Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Confocale en superresolutie beeldvorming van gepolariseerde intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten tijdens Drosophila Oogenesis

2.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63778

⸱

19 mei 2022

 , 
1Department of Biological Sciences, Northern Illinois University

In dit artikel

Samenvatting

Het keldermembraan is essentieel voor weefsel- en orgaanmorfogenese tijdens de ontwikkeling. Om de mechanismen die leiden tot de juiste plaatsing van deze structuur beter te begrijpen, beschrijft het gepresenteerde protocol methoden om de intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten in epitheelcellen te visualiseren en te karakteriseren met behulp van confocale en superresolutiemicroscopie.

Samenvatting

Het keldermembraan (BM) - een gespecialiseerd vel extracellulaire matrix aanwezig aan de basale kant van epitheelcellen - is van cruciaal belang voor de vaststelling en het onderhoud van epitheliale weefselmorfologie en orgaanmorfogenese. Bovendien is de BM essentieel voor weefselmodellering, dient het als een signaleringsplatform en biedt het externe krachten om weefsels en organen te vormen. Ondanks de vele belangrijke rollen die de BM speelt tijdens normale ontwikkeling en pathologische omstandigheden, zijn de biologische routes die de intracellulaire handel van BM-bevattende blaasjes beheersen en hoe basale secretie leidt tot de gepolariseerde afzetting van BM-eiwitten slecht begrepen. Het folliculaire epitheel van de Drosophila-eierstok is een uitstekend modelsysteem om de basale afzetting van BM-membraaneiwitten te bestuderen, omdat het alle belangrijke componenten van de BM produceert en afscheidt. Confocale en superresolutie beeldvorming in combinatie met beeldverwerking in vaste weefsels maakt de identificatie en karakterisering mogelijk van cellulaire factoren die specifiek betrokken zijn bij de intracellulaire handel en afzetting van BM-eiwitten. Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het kleuren en afbeelden van BM-bevattende blaasjes en gedeponeerde BM met behulp van endogene gelabelde eiwitten in het folliculaire epitheel van de Drosophila-eierstok . Dit protocol kan worden toegepast om zowel kwalitatieve als kwantitatieve vragen aan te pakken en het is ontwikkeld om high-throughput screening mogelijk te maken, waardoor factoren die betrokken zijn bij de gepolariseerde intracellulaire handel en afscheiding van blaasjes tijdens de ontwikkeling van epitheelweefsel mogelijk is.

Inleiding

Het keldermembraan (BM) is een dunne plaat van gelaagde cel-adherente extracellulaire matrix (ECM) die cruciaal is voor de epithelstructuur en morfogenese1. Het bestaat uit ~ 50 eiwitten en wordt alomtegenwoordig aangetroffen onder de epitheel- en endotheelcellen, en verwarmt skelet-, gladde en hartspiercellen en adipocyten 1,2,3. De drie belangrijkste componenten van de BM aan de basale kant van de epitheelcellen zijn Collageen IV, Perlecan en Lamininen. De BM ligt ten grondslag aan de epitheelcellen en is verantwoordelijk voor vele functies, waaronder weefselscheiding en -barrière, groei en ondersteuning, en celpolarisatie 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Zijn rol als signaleringsplatform reguleert de morfologie en differentiatie van epitheelcellen en weefsels tijdens de ontwikkeling 3,13,14. Bovendien zijn de verkeerde regulatie van de BM en /of een schending van de integriteit ervan de primaire oorzaken van veel pathologische aandoeningen, waaronder tumormetastase 2,15,16. Ondanks de essentiële functies die de BM uitvoert tijdens weefsel- en orgaanmorfogenese, zijn de componenten van de biologische route (s) gewijd aan de gepolariseerde intracellulaire handel en secretie van BM-eiwitten vaag bekend.

Om de intracellulaire handel van BM-bevattende blaasjes en de secretie van BM-eiwitten door epitheelcellen te bestuderen, is het folliculaire epitheel (FE) van de Drosophila-eierstok een krachtig modelsysteem (figuur 1). Een Drosophila-eierstok bestaat uit 16-20 lange, buisachtige structuren, ovarioles genaamd (figuur 1A, B)17,18,19. Elke ovariole kan worden gezien als een eierassemblagelijn, met de leeftijdsprogressie van eikamers (die elk aanleiding geven tot een ei) die begint aan het voorste uiteinde en achterste beweegt, totdat het rijpe ei door de eileider naar buiten komt. Elke eikamer wordt ingekapseld door de FE, een monolaag van somatische follikelcellen (FCs), die de centrale kiembaancellen (GC's) omringt. De FE is sterk gepolariseerd met een duidelijke apicale-basale polariteit waarbij het apicale domein naar de kiembaan is gericht en de BM-eiwitten basaal worden uitgescheiden18,19. De VC's scheiden actief alle belangrijke componenten van de BM af, waaronder Collagen IV, Perlecan en Laminins20,21. In epitheelcellen zoals FCs worden de BM-componenten geproduceerd en vereisen ze een gespecialiseerde gepolariseerde secretieroute voor hun afzetting extracellulair. Bijvoorbeeld, in het geval van de meest voorkomende component van de BM, Collageen IV (Coll IV), zijn de details rond de gepolariseerde intracellulaire handel en secretie vaag, ondanks dat de productie en afzetting de focus is van veel studies. Coll IV wordt vertaald in het endoplasmatisch reticulum (ER), waar ook elk fibril - samengesteld uit drie polypeptiden (twee α1-ketens en één α2-keten) - wordt geassembleerd tot een drievoudige helix22. Een goede Coll IV-vouwing en -functie vereisen ER-chaperonnes en enzymen, waaronder lysyl- en prolyl-hydroxylasen zoals Plod en PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Deze posttranslationele enzymen reguleren de ER-sortering van Coll IV, omdat het verlies van elk ervoor zorgt dat Coll IV gevangen zit in de basale ER 20,23,24,25,26. Vervolgens verlaat nieuw gesynthetiseerde Coll IV de ER voor de Golgi in COPII-gecoate blaasjes. De ladingreceptor Tango1 helpt bij het verpakken van collageen in aanzienlijke Golgi-gebonden blaasjes die plaats bieden aan grote multimere eiwitten20,27. Zodra Coll IV is verpakt in intracellulaire exocytaire blaasjes, wordt het specifiek basaal uitgescheiden uit epitheelcellen. Om BM-afzetting naar de basale kant te leiden, hebben epitheelcellen een andere reeks factoren nodig die specifiek zijn gewijd aan gepolariseerde BM-secretie. Met behulp van de FE van de Drosophila-eierstok zijn enkele componenten van dit nieuwe cellulaire proces gekarakteriseerd, waaronder de nucleotide-uitwisselingsfactoren (GEF's) Crag en Stratum, de GTPases Rab8 en Rab10, evenals de niveaus van de fosfoinositide PI (4,5) P2 en Kinesine 1 en 3 motoreiwitten 20,28,29,30,31 . Deze componenten zijn van cruciaal belang voor de gepolariseerde verdeling van BM-eiwitten.

Om de intracellulaire lokalisatie van BM-eiwitten in de FE te monitoren, kunnen endogene gelabelde keldermembraaneiwitten (eiwitvallen), zoals Viking-GFP (Vkg-GFP of α2 Coll IV-GFP) en Perlecan-GFP (Pcan-GFP) worden gebruikt 32,33. Van deze eiwitvallijnen is aangetoond dat ze de endogene verdeling van BM-eiwitten nauwkeurig weergeven en een gevoeligere detectie van vesiculaire handel mogelijk maken28,30. De componenten die betrokken zijn bij de gepolariseerde afzetting van BM in de FE werden voor het eerst gekarakteriseerd met behulp van eiwitvallijnen voor Vkg-GFP en Pcan-GFP 20,28,29,30. Eiwitvallen kunnen worden gebruikt in verschillende genetische achtergronden, waaronder mutanten en Gal4-lijnen 34. Bovendien kunnen eiwitvallen worden gebruikt in combinatie met fluorescerende kleurstoffen en/of fluorescentie-immunostaining, waardoor een nauwkeurige karakterisering van de lokalisatie van BM-eiwitten mogelijk is bij het vergelijken van wildtype en mutante condities35.

Om de distributie en lokalisatie van BM-eiwitbevattende blaasjes nauwkeurig en efficiënt te beoordelen, vormen confocale laserscanmicroscopie (CLSM) en beeldvormingstechnieken met superresolutie een aanzienlijk voordeel voor andere beeldvormingsbenaderingen. Deze benaderingen koppelen beeldvorming met hoge resolutie aan relatief gebruiksgemak. CLSM is een microscopietechniek die een verbeterde optische resolutie mogelijk maakt door het monster met een laser te scannen op een rasterscanmanier met behulp van galvanometers. De opening van het gaatje is een kerncomponent van een confocale microscoop. Door de onscherpe signalen van boven of onder het brandpuntsvlak te blokkeren, resulteert het gaatje diafragma in een zeer superieure resolutie in de z-as36. Dit maakt het ook mogelijk om een reeks afbeeldingen in het z-vlak te verkrijgen, een z-stack genaamd, die overeenkomen met een reeks optische secties. z-stacks maken vervolgens een 3D-beeld van het specimen, via 3D-reconstructie, met behulp van beeldbewerkingssoftware. Conventionele epifluorescentie (widefield) microscopen, in tegenstelling tot confocale microscopen, zorgen ervoor dat onscherp licht bijdraagt aan de beeldkwaliteit, waardoor de beeldresolutie en het contrastmet 36,37 afnemen. Dit maakt epifluorescentiemicroscopie een minder aantrekkelijke kandidaat bij het bestuderen van eiwitlokalisatie of colocalisatie.

Hoewel CLSM een geschikte aanpak is voor verschillende toepassingen, waaronder beeldvorming en karakterisering van de intracellulaire handel in BM-eiwitten, vormt het nog steeds een probleem bij het afbeelden van monsters onder de diffractielimiet van Abbe van licht (200-250 nm). Bij het afbeelden van dergelijke monsters kan confocale microscopie, vooral bij gebruik van een olieobjectief, resulteren in een hoge resolutie. Superresolutietechnieken overschrijden echter de limiet van confocale microscopie. Er zijn verschillende benaderingen om superresolutiemicroscopie te bereiken, elk met specifieke resolutielimieten en elk geschikt voor verschillende analyses. Deze benaderingen omvatten foto-geïnactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM) of stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM), gestimuleerde emissiedepletiemicroscopie (STED), gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM) en Airyscan (superresolutie) microscopie 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Hoewel Airyscan een grovere resolutie heeft dan PALM / STORM, STED en SIM, kan het nog steeds een resolutie van maximaal ~ 120 nm bereiken (ongeveer twee keer de resolutie van CLSM). Bovendien is aangetoond dat deze superresolutiemicroscopiebenadering een voordeel heeft ten opzichte van SIM- en andere superresolutietechnieken bij het afbeelden van dikke monsters en monsters met een lage signaal-ruisverhoudingvan 47,48.

Airyscan is een relatief nieuwe superresolutie confocale microscopietechnologie46. In tegenstelling tot traditionele CLSM's, die de pinhole- en single point-detectors gebruiken om onscherp licht af te stoten, maakt deze superresolutiebenadering gebruik van een 32-kanaals galliumarsenidefosfide (GaAsP) fotomultiplicatorbuisgebieddetector die al het licht verzamelt op elke scanpositie45. Elk van de 32 detectoren werkt als een klein gaatje, waardoor de pinhole-grootte wordt verkleind van de traditionele 1.0 Airy Unit (A.U.) tot een verbeterde 0.2 A.U., waardoor een nog hogere resolutie en signaal-ruisverhouding mogelijk is, met behoud van de efficiëntie van een 1.25 A.U. diameter45. Bovendien resulteert de lineaire deconvolutie die Airyscan gebruikt in een tot 2x hogere resolutie45. Dit in aanmerking nemend, zijn CLSM, en specifiek superresolutiemicroscopie, zeer geschikt om BM-eiwitten en eiwitten te bestuderen die de basale afzetting van BM-eiwitten reguleren, omdat ze afbeeldingen met een zeer hoge resolutie kunnen produceren voor lokalisatie- en colokalisatiestudies, waardoor nieuwe inzichten worden verkregen in de ruimtelijke, temporele en moleculaire gebeurtenissen die deze processen beheersen.

Een alternatieve benadering van confocale microscopie die kan worden gebruikt om lokalisatie-experimenten uit te voeren, is beelddeconvolutie. Aangezien widefield-microscopie het mogelijk maakt om onscherp licht de detectoren te bereiken, kunnen wiskundige en computationele deconvolutie-algoritmen worden toegepast om onscherp licht uit beelden verkregen door widefield-microscopie te verwijderen of opnieuw toe te wijzen, waardoor de resolutie en het contrast van het beeld worden verbeterd49. Deconvolutie-algoritmen kunnen ook worden toegepast op confocale beelden om de resolutie en het contrast verder te verhogen, waardoor uiteindelijke beelden worden geproduceerd die bijna vergelijkbaar zijn met die van superresolutiemicroscopie50. Airyscan maakt gebruik van Weiner filter-gebaseerde deconvolutie samen met Sheppard's pixel hertoewijzing, wat resulteert in een sterk verbeterde ruimtelijke resolutie en signaal-ruisverhouding. Vergeleken met confocale microscopie wordt een toename van 2x in resolutie in alle drie de ruimtelijke dimensies (120 nm in x en y en 350 nm in z) waargenomen bij gebruik van deze superresolutiemicroscopietechniek45,51.

Dit manuscript biedt gedetailleerde en geoptimaliseerde protocollen om de intracellulaire handel en afzetting van BM-eiwitten te kleuren, te verwerven en te visualiseren met behulp van de FE van de Drosophila-eierstok als een modelsysteem in combinatie met confocale en superresolutiemicroscopie. Drosophila-lijnen die endogene gelabelde keldermembraaneiwitten tot expressie brengen, bijvoorbeeld Vkg-GFP en Pcan-GFP, zijn efficiënte en nauwkeurige hulpmiddelen om BM-eiwithandel en -secretie te visualiseren. Bovendien kunnen ze gemakkelijk worden gebruikt in verschillende genetische achtergronden, waaronder mutant en Gal4 / UAS-lijnen 34. Hoewel endogeen gelabelde keldermembraaneiwitten worden aanbevolen, is het gebruik van antilichamen tegen specifieke BM-eiwitten ook compatibel met de beschreven protocollen. Deze protocollen zijn vooral nuttig voor wetenschappers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van intracellulaire handel en de secretie van BM-eiwitten in intact epitheelweefsel met behulp van confocale en superresolutie beeldvorming. Bovendien maakt de mogelijkheid om epitheliale weefselanalyse te combineren met de uitgebreide hulpmiddelen van Drosophila genetica deze aanpak bijzonder krachtig. Ten slotte kunnen deze protocollen eenvoudig worden aangepast om de vesiculaire handel en het sorteren van andere interessante eiwitten te bestuderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Vliegvoorbereiding voor eierstokdissecties

  1. Doe 10-15 Drosophila melanogaster vrouwelijke vliegen (1-2 dagen oud) van het gewenste genotype in een smalle injectieflacon met ~8 ml Drosophila fly medium besprenkeld met een kleine hoeveelheid gegranuleerde bakkersgist 2-3 dagen voorafgaand aan de dissectie bij 25 °C. Het toevoegen van een paar mannetjes aan de injectieflacon kan de opbrengst van de eikamer verhogen. Zorg er echter voor dat het totale aantal vliegen niet hoger is dan 20, omdat dit de ontwikkeling van de eierstokken negatief kan beïnvloeden.
    OPMERKING: Beschrijving van Drosophila-mannen en -vrouwen, en nuttige tips en adviezen voor wetenschappers zonder eerdere Drosophila-ervaring zijn te vinden in de geciteerde artikelen34,52. Het toevoegen van gist zal de eiproductie stimuleren en eierstokken genereren met verschillende stadia vertegenwoordigd. Bovendien zal het ook de eierstokken vetmesten en ze gemakkelijker te verwijderen maken. Natte gist kan ook worden gebruikt in plaats van gegranuleerde gist, maar voor zwakkere voorraden kunnen de vliegen vast komen te zitten en sterven.

2. Ovariumdissectie en fixatie

OPMERKING: Voor aanvullende bronnen over eierstokdissectie en kleuring worden lezers verwezen naar de geciteerde protocollen 53,54,55.

  1. Bereid op de dag van de dissectie verse fixatieoplossing met een eindconcentratie van 4% paraformaldehyde (PFA) door de PFA-stamoplossing te verdunnen in 1x fosfaatbufferzoutoplossing (PBS).
  2. Verdoof de vliegen met CO2 en plaats ze op een vliegkussen. Houd de vliegen verdoofd totdat ze worden gedissectieerd. Overweeg vliegen die goed worden verdoofd zodra hun bewegingen zijn gestopt, wat meestal 10-20 s duurt.
    OPMERKING: Hoewel het gebruik van CO2 wordt aanbevolen als een veiligere en snellere optie, kunnen vliegen worden verdoofd met behulp van ijs.
  3. Plaats een glazen concave dia of vlekschaal met ondiepe depressieputten onder een ontleedmicroscoop en vul de putten met 1x PBS.
  4. Grijp een vrouwelijke vlieg aan de onderste thorax met behulp van een tang. Zorg voor het geslacht van de vliegen door de afwezigheid van mannelijke genitaliën aan het achterste uiteinde van de buik en de afwezigheid van geslachtscommen op hun voorpoten als een secundair kenmerk52. Dissect vliegt individueel met behulp van een ander paar tangen (stap 2.5) terwijl ze worden ondergedompeld in putten gevuld met 1x PBS onder de ontleedmicroscoop (20x vergroting wordt aanbevolen).
  5. Terwijl u door de ontleedmicroscoop kijkt, gebruikt u een ander paar tangen om aan het achterste deel van de vliegenbuik te trekken, waardoor de inwendige organen (bijv. Eierstokken, darm) zichtbaar worden.
  6. Knijp zachtjes in het voorste deel van de vliegbuik (zoals bij een tube tandpasta) om de eierstokken uit de buik te dwingen. Deze methode moet de eierstokken intact houden. Maak andere organen en vliegresten los en verwijder ze voorzichtig.
  7. Gebruik een tang of ontleednaalden om de ovariolen van de eierstok te scheiden terwijl de algehele eierstokstructuur intact blijft. Het doel van deze stap is om de spierschede die de eierstokken bedekt te breken en een efficiëntere en homogene kleuring mogelijk te maken.
  8. Breng de eierstokken snel over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml met 1x PBS en houd de buis op ijs totdat alle vliegen zijn ontleed. Houd de buis niet op ijs als microtubuli of microfilamenten (of blaasjes die door deze cytoskeletale componenten worden verhandeld) moeten worden gevisualiseerd, omdat dit depolymerisatie kan veroorzaken.
  9. Zodra alle eierstokken zijn ontleed en overgebracht naar een microcentrifugebuis, laat ze dan naar de bodem van de buis zinken en verwijder alles behalve ~ 50 μL van de PBS. Voeg 1 ml 4% PFA toe en plaats 15 minuten op een noterende platformrocker. Belangrijk is om te controleren of de eierstokken heen en weer bewegen in de fixatieoplossing om een goede fixatie mogelijk te maken, omdat onvolledige fixatie kan leiden tot vlekken en beeldvormingsproblemen.
    OPMERKING: De snelheid van de nutator is niet cruciaal. Terwijl sommige nutators een snelheidsregeling hebben, worden anderen geleverd met een vooraf ingestelde snelheid. De vooraf ingestelde snelheid is voldoende en indien instelbaar, ingesteld op 40-50 tpm.
  10. Verwijder de fixatieoplossing (zoals in stap 2.9) en voer vervolgens twee snelle wasbeurten uit met 1 ml 1x PBS met 0,1% Triton-X 100 (1x PBST), door de microfugebuizen 5-6 keer voorzichtig om te keren. Ga vervolgens verder met vier wasbeurten van 10-15 minuten (lange wasbeurt) met 1 ml 1x PBST (40-60 minuten totaal).
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 1x PBS + 0,1% Triton-X 100 te gebruiken voor wasbeurten, omdat het verhogen van het percentage wasmiddel kan leiden tot GFP-denaturatie, wat leidt tot verminderde fluorescentie en detectie van GFP-gelabelde BM-eiwitten.
  11. Ga voor kleurstofkleuring, bijvoorbeeld DNA- en F-actinekleuring, verder met stap 3. Ga voor immunostaining verder met stap 4. De eierstokken kunnen tot 24 uur in 1x PBST bij 4 °C worden bewaard voordat ze verder gaan.

3. Standaard DNA/F-Actine kleuring

  1. Verwijder na het fixeren en wassen PBST. Voeg 500 μL DNA en F-Actin kleuringsoplossing toe. Om de DNA/F-Actin-oplossing te bereiden, mengt u Hoechst (DNA-kleuring; 1:1000 verdunning van 1 mg/ml stamoplossing) en fluorofoor-gelabelde falloidine (F-actinekleuring; 1:500 verdunning voor Alexa Fluor 546 of 1:100 verdunning voor Alexa Fluor 647, elk van 66 μM stockoplossing) in 500 μL PBST.
  2. Bedek de buizen met aluminiumfolie om de eierstokken en kleurstoffen in het donker te houden om de fluorescentie te behouden voor efficiënte beeldvorming en incubeer gedurende 15 minuten op een nutating platform rocker.
  3. Verwijder na incubatie de DNA/F-Actin-oplossing (zoals in stap 2.9). Voer twee snelle wasbeurten en drie lange (10-15 min) wasbeurten uit in 1x PBST zoals beschreven in stap 2.10. Ga verder met het monteren zoals beschreven in stap 5.

4. Fluorescentie immunostaining

OPMERKING: Dit is een standaard immunostaining protocol voor fluorescerende beeldvorming en is compatibel met de meeste primaire antilichamen.

  1. Blokkerende en primaire antilichaam immunostaining (Dag 1)
    1. Verwijder PBST na het fixeren en wassen zoals beschreven in stap 2.9. Voeg 1 ml blokkeringsoplossing (PBS + 5% BSA) toe en blokkeer de eierstokken op een nooterende platformknop gedurende minimaal 1 uur.
      OPMERKING: Naast BSA kan foetaal runderserum (FBS) of normaal geitenserum (NGS) aan de blokkerende oplossing worden toegevoegd. Als alternatief kunnen de eierstokken 's nachts worden geblokkeerd op een notenplatform rocker bij 4 °C.
    2. Verwijder de blokkeringsoplossing zoals in stap 2.9 en voeg 300 μL primaire antilichaamoplossing met primaire antilichamen verdund in de juiste concentraties (specifiek voor het gebruikte antilichaam) toe aan de blokoplossing. Incubeer een nacht op een noterend platform rocker bij 4 °C. Verwijder de volgende dag de primaire antilichaamoplossing en ga verder met secundaire antilichaamimmunostaining.
      OPMERKING: Sommige primaire antilichamen kunnen worden opgeslagen en hergebruikt. In sommige gevallen kunnen hergebruikte primaire antilichamen achtergrondkleuring verminderen, wat resulteert in betere beeldvorming. Hergebruik moet echter voor elk antilichaam worden getest om de efficiëntie te garanderen.
  2. Secundair antilichaam immunostaining (Dag 2)
    1. Voer na het verwijderen van de primaire antilichaamoplossing twee snelle wasbeurten en vier lange (10-15 min) wasbeurten uit zoals in stap 2.10. Zorgvuldig uitgevoerde repetitieve wasbeurten met verse 1x PBST zullen de niet-specifieke achtergrond verminderen en leiden tot optimale beeldvorming.
    2. Verwijder PBST zoals in stap 2.9 en voeg 500 μL secundaire antilichaamoplossing toe die fluorescerende secundaire antilichamen bevat die de gebruikte primaire antilichamen detecteren. Bescherm de buis tegen licht door deze vanaf dit punt te bedekken met aluminiumfolie voor een optimaal behoud van fluorescentie, wat van cruciaal belang is voor beeldacquisitie en -analyse.
      OPMERKING: De secundaire antilichaamoplossing moet secundaire antilichamen bevatten die zijn geconjugeerd met fluoroforen die niet overlappen met endogene gelabelde eiwitten. Als u bijvoorbeeld GFP-gelabelde eiwitten gebruikt, wordt het gebruik van secundaire Alexa Fluor-antilichamen op rode of verrode golflengten aanbevolen (bijvoorbeeld 546, 568 of 647 nm). Fluorescerende kleurstoffen, zoals Hoechst en Alexa Fluor 546 of 647 geconjugeerd falloïdine, kunnen aan de secundaire oplossing worden toegevoegd. Deze vlekken kunnen nuttig zijn om de algehele celstructuur (d.w.z. kernen en F-Actine) te markeren. Zie stap 3.1 voor de concentraties.
    3. Incubeer de eierstokken in de secundaire antilichaamoplossing op een nutating platform rocker gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Voer twee snelle wasbeurten en vier lange (10-15 min) wasbeurten uit in 1x PBST zoals in stap 2.10. Ga verder met monteren zoals in stap 5.

5. Montage van gekleurde eierstokken

OPMERKING: Deze methode werkt heel goed als de eierstokken goed ontwikkeld en overvloedig zijn. Zorgvuldige montage van de eierstokken op de dia is van cruciaal belang voor een optimale beeldvorming.

  1. Gebruik na de laatste wasbeurt een p1000-pipet om de eierstokken voorzichtig op en neer in de buis te pipetteren om de eikamers te scheiden. Laat de eikamers naar de bodem zakken door de buis 5-10 minuten rechtop te houden. Zorgvuldige scheiding van individuele eikamers is van cruciaal belang om optimale beeldacquisitie te bereiken.
  2. Verwijder PBST met een Pasteur pipet, waardoor ~50 μL overblijft. Verwijder zoveel mogelijk van de resterende PBST met een p200 pipet. Voeg twee druppels montagemedium toe, genoeg om gelijkmatig te verspreiden over een afdekplaat van 22 mm x 22 mm. Eierstokken kunnen tot 1 maand voorafgaand aan de montage in microcentrifugebuizen bij 4 °C worden bewaard in montagemedium.
    OPMERKING: Verschillende bevestigingsmedia zijn in de handel verkrijgbaar; het gebruik van hardwerkende mountants, zoals Aqua-Poly/Mount of ProLong Glass Antifade Mountant, wordt aanbevolen om optimale beeldomstandigheden te bereiken. Het gebruik van glycerol als montagemedium wordt afgeraden omdat het kan leiden tot slechte beeldvormingsomstandigheden (bijv. Fluorofoorinstabiliteit). Voor montagemedia die niet polymeriseren, sluit u de coverslip af met een coverslipkit / nagellak om deze op zijn plaats te houden.
  3. Label een glazen dia en veeg deze af met zacht, stofvrij papier om stof en vingerafdrukken te verwijderen. Knip het uiteinde van een p200 pipetpunt af zodat het viskeuze montagemedium gemakkelijk vanuit de microcentrifugebuis naar de schuif kan worden overgebracht. Breng vervolgens langzaam alle eierkamers in het montagemedium over naar de glazen schuif en zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan.
  4. Onder een ontleedmicroscoop spreidt u voorzichtig het montagemedium en de gescheiden eierkamers uit met behulp van een nieuwe p200-punt of -tang om een gebied te bedekken dat ongeveer zo groot is als de coverslip.
  5. Plaats met behulp van een tang voorzichtig de deklip (gereinigd met stofvrij papier) onder een hoek op de eierkamers om bubbels te voorkomen.
  6. Bewaar de glijbaan bij kamertemperatuur op een vlak oppervlak in het donker gedurende 2 dagen om te polymeriseren. Zodra het montagemedium is uitgehard, kan de dia enkele weken bij 4 °C in het donker worden bewaard voor beeldvorming.
    OPMERKING: Het is belangrijk dat het montagemedium met harde instelling polymeriseert voordat het wordt afgebeeld. Als het medium nog niet is gepolymeriseerd, zullen de eierstokken onder de coverslip zweven, wat de beeldacquisitie beïnvloedt. Bovendien wordt de optimale reflecterende index van montagemedia pas bereikt nadat deze volledig is ingesteld (zie de informatie van de fabrikant voor meer informatie).
  7. Alternatieve montagemethode: Deze methode wordt aanbevolen om weefselverlies te verminderen als de eierstokken niet overvloedig zijn. Bij deze methode (hieronder beschreven) scheidt u de ovariolen en de eikamers op de dia tijdens het monteren, in plaats van ze in een microcentrifugebuis te scheiden door te pipetteren zoals beschreven in stap 5.1.
    1. Verwijder na de laatste wasbeurt alles behalve ~100 μL van de wasoplossing. Breng met behulp van een Pasteur-pipet of p1000-pipet de intacte eierstokken in PBS over naar de dia. Gebruik een p200 pipet om voorzichtig zoveel mogelijk PBST van de dia te verwijderen. Gebruik indien nodig een stofvrij papier om de PBST weg te vegen. Raak de eierstokken niet aan.
    2. Voeg twee druppels montagemedia toe. Scheid de ovariolen en eierkamers zorgvuldig met behulp van een tang of ontleednaalden. Verwijder en gooi vreemd weefsel weg en spreid vervolgens de eikamers en ovarioles uit in het montagemedium. Ga verder met de stappen 5.5-5.6.

6. Confocale beeldverwerving

OPMERKING: Deze sectie bevat belangrijke parameters om optimale beeldacquisitie te bereiken met behulp van een confocale microscoop (figuur 2).

  1. Stel de microscoop in en lokaliseer het monster zoals hieronder beschreven.
    1. Voordat u gaat fotograferen, is het cruciaal om de regio van belang (ROI) te lokaliseren met behulp van het oculair van de fluorescentiemicroscoop. Gebruik een objectief met een lage vergroting (20x) of het objectief dat moet worden gebruikt voor beeldacquisitie (d.w.z. 40x of 63x). Selecteer een eierkamer om af te beelden.
      OPMERKING: Voor beeldacquisitie wordt het gebruik van hoge vergrotingsdoelstellingen zoals 40x of 63x aanbevolen (zie 6.2.1).
    2. Zodra de ROI is geselecteerd, gaat u verder met het verwerven van afbeeldingen; ga verder met stap 6.2 voor confocale beeldvorming en stap 7 voor beeldvorming met superresolutie.
  2. Selecteer de belangrijkste parameters voor optimale beeldacquisitie zoals hieronder beschreven (voorbeelden van belangrijke parameters voor de representatieve afbeeldingen worden gegeven in tabel 1).
    1. Een doel selecteren: Gebruik voor confocale beeldverwerving van de intracellulaire handel en secretie van BM-eiwitten in de FE een 40x- of 63x-doelstelling.
      OPMERKING: Om de best mogelijke resolutie te bereiken, wordt het gebruik van Plan-Apochromat-objectieven, met een hoog numeriek diafragma (NA) dat de hoogste achromatische correctie biedt, ten zeerste aanbevolen.
    2. Lasers selecteren voor elk kanaal/spoor: Gebruik voor GFP laser 488 nm; gebruik voor DAPI of Hoechst laser 405 nm; gebruik voor Alexa Fluor 546 of 568 laser 561 nm; en gebruik voor Alexa Fluor 647 laser 640 nm.
      OPMERKING: Elke laserselectie resulteert in een andere kanaal-/spoorvorming. Hier verwijst de term kanaal naar het beeld gevormd door de opgenomen intensiteitsverdeling voor geëxciteerde fluoroforen voor de geselecteerde ROI op de specifieke golflengte van elk kanaal.
    3. Pinhole-instelling: Om onscherp licht tijdens beeldacquisitie te verminderen, stelt u het gaatje voor elk kanaal in op 1 AE.
    4. Laserintensiteit en detectorversterkingsinstellingen: Om de beeldgevoeligheid te verfijnen, gebruikt u zowel de detectormasterversterking als het laservermogen. Om de beeldgevoeligheid goed in te stellen, wordt een bereikindicator aanbevolen. Stel zowel de hoofdversterking als het laservermogen in op een juiste gevoeligheid waarbij de interessante structuren (bijv. BM-bevattende blaasjes) duidelijk zichtbaar zijn en tegelijkertijd detectorverzadiging vermijden.
      OPMERKING: Om fotobleaching te voorkomen, gebruikt u het minimale laservermogen dat nodig is. Het wordt aanbevolen om eerst de detectorversterking te verhogen met behulp van het laagst mogelijke laservermogen. Als een toename van de detectorversterking niet de gewenste intensiteit kan bereiken, verhoog dan het laservermogen. Laservermogensintensiteit tussen 0,5% -1,2% wordt aanbevolen.
    5. Framegrootte: het wordt aanbevolen om de optimale afbeeldingsgrootte te gebruiken die wordt bepaald door de acquisitiesoftware. Gebruik voor de meeste toepassingen een maximale resolutie van 1024 x 1024. Een hogere resolutie zal de acquisitietijd aanzienlijk verlengen.
    6. Scansnelheid: gebruik een scansnelheid tussen 6-9, wat veilig is voor de meeste monsters. Als het monster luidruchtig is, gebruikt u een lagere scansnelheid om de signaal-ruisverhoudingen te verbeteren. Lage scansnelheden verhogen echter de fotobleaching en acquisitietijd.
    7. Gemiddelde intensiteitsgemiddelde: Om de beeldkwaliteit te verbeteren, gebruikt u gemiddelde intensiteitsgemiddelde via opeenvolgende scans met identieke instellingen. Gebruik in de meeste gevallen een gemiddelde van twee om de signaal-ruisverhoudingen te verbeteren zonder het monster te fotobleachen.
    8. Zoomen: Pas het scangebied aan met de zoomfunctie. Gebruik een zoom tussen 2x-4x met zowel 40x als 63x objectieven als de meest effectieve waarde om BM-bevattende blaasjes in de FE duidelijk te visualiseren. Selecteer zorgvuldig de minimale ROI om de acquisitietijd te verkorten.
  3. Om een z-stack te verkrijgen met Zeiss Zen-software, gebruikt u de volgende Z-sectieparameters en stelt u deze in zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: Blaasjes en andere intracellulaire structuren die BM-eiwitten bevatten, zijn 3-dimensionale (3D) structuren. Het aanschaffen van een z-stack via de FE zal de beeldkwaliteit en resolutie aanzienlijk verbeteren. Meestal is een bereik dat de dikte / diepte van het weefsel beslaat voldoende om intracellulaire lokalisatie efficiënt te visualiseren. Voor een optimale 3D-reconstructie wordt aanbevolen om het optimale interval te gebruiken dat door de software wordt bepaald. Vermijd voor 40x- en 63x-doelstellingen intervallen hoger dan 0,5 μm tussen elke z-sectie om een optimale 3D-reconstructie mogelijk te maken.
    1. Klik op het selectievakje z-Stack in het hoofdgebied onder het tabblad Acquisitie . Selecteer de scanmodus Alle tracks per segment voor de z-stack. Dit resulteert in een verandering in kanaaltracks voor elke z-positie slice.
    2. Selecteer het gewenste kanaal om het exemplaar te observeren en klik op Live om een live scan te starten. Het gebruik van het kanaal dat nodig is om het GFP-gelabelde BM-eiwit te detecteren, wordt aanbevolen.
    3. Stel een bereik in voor de z-stack zoals beschreven. Gebruik de fijnafstellingsknop op de microscoop om de z-locatie voor het ene uiteinde van het monster te vinden en klik op Eerst instellen. Zoek op dezelfde manier de z-locatie voor het andere uiteinde van het exemplaar en klik op Laatste instellen.
    4. Klik voor elke locatie in de z-stack op elk kanaal afzonderlijk met de bereikindicator geselecteerd en pas de intensiteit van de laser en de masterversterking indien nodig aan, zoals beschreven in stap 6.2.4.
    5. Stel het interval voor de z-stack in om de stapgrootte toe te wijzen zoals aanbevolen in de OPMERKING onder stap 6.3. Klik op Experiment starten om te beginnen met het aanschaffen van z-stack.

7. Superresolutie beeldacquisitie

  1. Selecteer een Airyscan-compatibel doel. Om de intracellulaire lokalisatie van BM-eiwit te visualiseren, is het gebruik van een 63x oliedoelstelling optimaal (figuur 3). Stel het doel in op 63x en plaats voorzichtig een druppel dompelolie op de lens. Plaats de dia op het objectief met coverslip naar het doel gericht om het monster te lokaliseren.
  2. Selecteer een configuratie met de juiste instellingen voor de fluorofoor om af te beelden zoals hieronder beschreven.
    1. Klik op de knop Slimme installatie op het tabblad Acquisitie om een nieuw experiment te configureren. Selecteer Airyscan (superresolutie); wanneer dit is geselecteerd, is een verdere selectie vereist tussen Resolutie (Airyscan SR), SNR/gevoeligheid (Airyscan Confocal) en Snelheid (Multiplex SR-2Y). Voor vast weefsel selecteert u Resolutie , omdat dit zal resulteren in de beste acquisitie.
    2. Klik op + in het vak Uw experiment configureren om tracks/kanalen toe te voegen. Selecteer de tracks voor specifieke kleurstoffen uit de Dye Database. Voor een experiment met meerdere kanalen voegt u elke track indien nodig toe door de juiste kleurstoffen te selecteren.
    3. Nadat alle tracks zijn toegevoegd, selecteert u een van de experimentvoorstellen die door de software worden geleverd. Gebruik voor dit experiment Best Signal, want hoewel de snelheid iets langzamer zal zijn in vergelijking met het Slimste (Line) voorstel, zal het de beste hardware-instellingen voor elke kleurstof creëren, wat resulteert in maximale signaalversterking en minimale emissie-overspraak. Zodra het experiment is ingesteld en geladen, wordt het weergegeven in het venster Imaging Setup op het tabblad Acquisitie.
    4. Zodra een slimme opstelling is geselecteerd, wordt het golflengtebereik voor de detector GaAsP-PMT automatisch geselecteerd. Pas het bereik aan door de schuifbalk onderaan te verplaatsen om het bereik te vergroten of te verkleinen of het bereik naar een ander gebied te verplaatsen als dat nodig is. Gebruik dit om ervoor te zorgen dat de bereiken van twee verschillende kanalen elkaar niet overlappen om overspraak te voorkomen. Sla de configuratie op om in de toekomst opnieuw te gebruiken.
  3. Zodra de configuratie is ingesteld, gaat u verder met het aanpassen van het zoom- en scangebied zoals in stap 6.2.8. Optimaliseer het scangebied om u te concentreren op de gewenste regio om de scantijd en opslagruimte te verminderen. Ga verder met het verkrijgen van afbeeldingen.
  4. Selecteer voor elk afzonderlijk kanaal een track onder Kanaal en klik op Live. Pas de hoofdversterking en het laservermogen aan met behulp van het bereikindicatorgereedschap zoals beschreven in stap 6.2.4 en volg alle beschreven richtlijnen om verzadigde pixels te voorkomen. Controleer of de zeshoekige detectorweergave is gecentreerd en uitgelijnd door op de knop Airyscan-detectorweergave te klikken. In de meeste gevallen wordt de zeshoekige detectorweergave automatisch gecentreerd en uitgelijnd. Herhaal dit voor extra kanalen.
  5. Klik in het schakelvenster Acquisitiemodus onder Afbeeldingsgrootte op SR (superresolutie-beperkt aantal pixels) om de mogelijkheden van de detector te maximaliseren. Hiermee wordt de framegrootte automatisch aangepast.
  6. Houd het gemiddelde op Geen omdat het meestal niet nodig is, en dit zal de scantijd verkorten. In sommige gevallen kan een gemiddelde van 2x de signaal-ruisverhouding verbeteren.
  7. Verzamel onbewerkte gegevens met 8-bits gegevensdiepten. Klik op Snap om een afbeelding te verkrijgen. Volg stap 6.3 om een z-stack te verkrijgen.
  8. Voer beeldverwerking uit zoals hieronder beschreven. Dit levert een 16-bits afbeelding op.
    1. Zodra de afbeelding of z-stack is verkregen, klikt u op de Processing > Method en selecteert u Airyscan Processing.
    2. Voer om te beginnen automatisch filteren uit en voer verdere handmatige verwerking uit door de SR-waarde te wijzigen om de beste resultaten voor het monster te verkrijgen. Zodra de optimale SR-waarde is bepaald, klikt u op Toepassen om een verwerkte afbeelding te genereren. In het geval van z-stack-afbeeldingen, verwerk u als één z-slice (Current Image [2D]) of als de hele z-stack door op het vak 3D-verwerking te klikken.

8. Beeldverwerking en data-analyse (orthogonale projectie, 3D-reconstructie en intensiteitsprofiel)

OPMERKING: Voor deze methode worden de stappen beschreven die worden gebruikt om orthogonale projecties, 3D-reconstructies en intensiteitsprofielen te genereren voor de Zen-software (zie Materiaaltabel). Soortgelijke data-analyses kunnen ook worden uitgevoerd met ImageJ-software56.

  1. Orthogonale projectie uitvoeren zoals hieronder beschreven (figuur 4).
    1. Zodra een z-stack is verkregen met behulp van confocale of superresolutiemicroscopie, genereert u een orthogonale projectie om de blaasjes in de z-as van de cel in een 2D-weergave te bekijken (vergeleken met 3D-reconstructie). Klik hiervoor op de verwerkingsmethode > en selecteer Orthogonale projectie.
    2. Selecteer onder parameters het vereiste projectievlak. Voor een projectie van de z-as (z-stack) selecteert u het frontale (XY) vlak. Selecteer onder Methode de optie Maximum om te resulteren in de projectie van de hoogste kwaliteit.
    3. Bepaal vervolgens de dikte van de projectie door de beginpositie te selecteren (beginnende z-slice) en bepaal de dikte (totaal aantal z-slices) in de projectie. Het is ideaal om de dikte te selecteren die gelijk is aan die van één cel in de z-as.
    4. Zodra de parameters zijn ingesteld, klikt u op Toepassen om de projectie van de z-stack op een XY-vlakmanier te maken.
      OPMERKING: Bij het maken van orthogonale projecties van meerdere z-stacks om de hoeveelheid van een bepaald interessant object te vergelijken, is het noodzakelijk om de dikte van de projectie hetzelfde (of zo dicht mogelijk) te houden voor gegevensnauwkeurigheid.
  2. Voer een 3D-reconstructie uit zoals hieronder beschreven (figuur 5).
    1. Maak 3D-reconstructies van z-stacks om de lokalisatie en vorm van structuren te observeren. Doe dit voor z-stacks die zijn verkregen met behulp van confocale en superresolutiebenaderingen. Verwerk z-stacks met superresolutie eerst met behulp van 3D-verwerking zoals in stap 7.8 voor 3D-reconstructie.
    2. Om een 3D-afbeelding te genereren, klikt u op het 3D-pictogram in het voorbeeldvenster. Eenmaal aangeklikt, verschijnt er een 3D-tabblad in het gedeelte weergavebeheer in de onderste helft van het scherm. 3D-weergaven, zoals Transparantie, Volume, Maximum, Oppervlak en Gemengd, zijn zichtbaar. Gebruik Surface- of Gemengde weergaven bij het bekijken van de structuur van blaasjes (bij voorkeur).
    3. Voor de afbeelding van de hoogste kwaliteit selecteert u de instelling Nauwkeurig , omdat de snelste instelling minder nauwkeurig is en leidt tot een slechte 3D-weergave.
    4. Zodra de afbeelding is gegenereerd, manipuleert u deze door te roteren en in te zoomen om scherp te stellen op een voorkeurslocatie om de interessante objecten te bekijken. Manipuleer de 3D-afbeelding op het tabblad Vormgeving .
    5. Zodra een bevredigend beeld is verkregen, selecteert u onder het tabblad 3D de optie Weergegeven resolutie en klikt u vervolgens op Afbeelding maken. Hiermee wordt een momentopname van de afbeelding gemaakt in dezelfde richting als deze werd bekeken en kan deze worden opgeslagen en geëxporteerd in verschillende bestandsindelingen.
  3. Genereer een intensiteitsprofiel zoals hieronder beschreven (figuur 7).
    OPMERKING: De verdelings- en intensiteitsprofielen van de pixels die zijn gekoppeld aan de verschillende fluorescerende signalen kunnen worden bekeken als een overlayafbeelding om hun colocalisatie te bepalen.
    1. Zodra een optimaal beeld is verkregen via confocale of superresolutie beeldvorming, klikt u in het deelvenster Weergave van het voorbeeldvenster op Profiel. In het voorbeeldvenster verschijnt een histogram dat het intensiteitsprofiel weergeeft als functie van de afstand, evenals een tabel met afstanden en intensiteitswaarden.
    2. Klik in het gebied met weergavebesturingselementen onder aan het scherm op het gereedschap Pijl op het tabblad Profieldefinitie . Teken een pijl langs de lengte van het object waarvoor het intensiteitsprofiel van de verschillende pixels moet worden beoordeeld. Als u de pijl wilt tekenen, zoomt u in op de afbeelding.
    3. Het intensiteitsprofiel verschijnt aan de linkerkant van het afbeeldingsvoorbeeld, waar de afstand en de bijbehorende pieken langs het pad van de pijl worden weergegeven. Als u het histogram wilt verwijderen dat op de afbeelding zelf wordt weergegeven, schakelt u het selectievakje Profiel weergeven in afbeeldingen uit .
    4. Schakel op het tabblad Dimensies in het weergavebesturingselementgebied de selectie uit alle kanalen die niet in het intensiteitsprofiel mogen worden opgenomen.
    5. Dubbelklik op het tabblad Afbeeldingen op Profiel dat wordt weergegeven onder het vak Annotaties/Metingen om het pop-upvenster Grafische elementen opmaken te openen. Gebruik dit om de kleur van de pijl en de stijl en lijndikte te wijzigen. Sluit het vak nadat u de gewenste instellingen hebt geselecteerd.
    6. Klik op het tabblad Profielweergave . Klik in het nieuwe afbeeldingsgedeelte op Huidige weergave en vervolgens op Opslaan als om het bestand op te slaan. Het wordt aanbevolen om het bestand op te slaan als een .tif bestand om gegevenscompressie en -verlies te voorkomen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De hierin beschreven methoden kunnen worden gebruikt om de intracellulaire handel en secretie van BM-eiwitten in gepolariseerde epitheelcellen, zoals de FE van de Drosophila-eierstok , efficiënt en nauwkeurig in beeld te brengen en te karakteriseren. Vervolgens bieden we verwachte resultaten die zijn verkregen met behulp van de beschreven methoden, evenals nuttig advies en mogelijke valkuilen. Om dit te doen, wordt Vkg-GFP, een endogeen gelabelde Vkg (Drosophila Col IV) gebruikt. Dezelfde resultaten kun...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De BM is van cruciaal belang voor embryonale en orgaanmorfogenese en fysiologische functies bij volwassenen. Bovendien fungeert de BM als een signaleringsplatform voor het vaststellen en onderhouden van epitheliale polariteit en biedt weefsels ondersteuning2. Toch zijn de mechanismen die de juiste plaatsing van BM-eiwitten reguleren slecht begrepen. Een beter begrip van de biologische routes gewijd aan de intracellulaire handel en gepolariseerde secretie van BM-eiwitten vereist een zorgvuldige ana...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs zijn Julie Merkle dankbaar voor haar nuttige commentaar op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie R15GM137236 aan O.D. De confocale en superresolutiebeelden werden verkregen met behulp van een Zeiss LSM 900 met Airyscan 2, gekocht met NSF MRI-subsidie 2018748.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alexa Fluor 546 phalloidinInvitrogenA22283F-Actin Stain (1/500 van 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidinInvitrogenA22287F-Actin Stain (1/100 van 66µM))
Anti-GM130 Antibodyabcamab30637Voor Golgi Stain (colocalisatie); gebruik als concentratie van 7µg/uL
Aqua-PolymountPolysciences, Inc.1860620Inbeddingsmedium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast)Genesee Scientific62-103Om de eierstokken te vetteren voor dissectie
Bovine Serum Albumin (30% oplossing)Sigma-AldrichA7284Voor blokkeeroplossing
DepressieputjesElectron Microscopy Sciences7156101Voor dissectie (glazen concaviteitsschuif kan in plaats daarvan worden gebruikt)
Dissectie naaldFisher scientifc13-820-024
Drosophila IncubatorGenesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila lijn (ZCL1700)Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi lijn (TRIP lijn HMS00241)Bloomington Drosophila Stock Center33594RNAi tegen Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila lijn (CC00791)Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4Devergne et al., 2017. De expressie van Crag RNAi in de FE aansturen
Pincet (Dumont 5)Fine Science Tools11251-30Voor dissectie
Glazen ConcaviteitsschuifElectron Microscopy Sciences7187804Voor dissectie (depressieputjes kunnen in plaats daarvan worden gebruikt)
Geit anti-Konijn IgG, Alexa Fluor 568InvitrogenA11036Secundaire antilichaam (GM130 antilichaam) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342)InvitrogenH3570DNA Stain (1 ug/mL)
KimwipesKimtechFisher Scientific: 06-666Delicate task wipers
Leica Fluorescerende Stereo Microscoop  M165 FCLeicaVoor eierstokbeeldvorming
MicroscoopglazenCorning294875X25Microscoopglazen
Nutating platform rockerCorning Life Sciences6720Voor eierstokfixatie en kleuring
Nutri-Fly BFGenesee Scientific66-121Vliegvoer
Paraformaldehyde 20% OplossingElectron Microscopy SciencesFisher Scientific: 15713Voor PFA 4%
Fosfaat gebufferde zoutoplossing tablettenFisher scientificBP2944100Voor PBS oplossing
ProLong Glass Antifade MountantInvitrogenP36980Inbeddingsmedium
Vierkante DekglasCorning285022Dekglas voor microscoopglazen
Triton x-100Sigma-Aldrich9036-19-5Voor PBST
Zeiss LSM 900 met Airyscan 2ZeissConfocale en superresolutie microscoop
Zeiss Stemi 305 Stereo MicroscoopZeissDissectiemicroscoop
Zeiss Zen Software versie 3.3 (Blue Edition)ZeissBeeldverwerving en -verwerking

Referenties

  1. Halfter, W., et al. New concepts in basement membrane biology. FEBS Journal. 282 (23), 4466-4479 (2015).
  2. Sekiguchi, R., Yamada, K. M. Basement membranes in development and disease. Current Topics in Developmental Biology. 130, 143-191 (2018).
  3. Jayadev, R., Sherwood, D. R. Basement membranes. Current Biology. 27 (6), 207-211 (2017).
  4. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  5. Kefalides, N., Borel, J. Functions of basement membranes. Current Topics in Membranes. 56, 79-111 (2005).
  6. Kefalides, N., Borel, J. Basement membranes in development. Current Topics in Membranes. 56, 43-77 (2005).
  7. Halfter, W., et al. The bi-functional organization of human basement membranes. PLoS One. 8 (7), 67660(2013).
  8. Morrissey, M. A., Sherwood, D. R. An active role for basement membrane assembly and modification in tissue sculpting. Journal of Cell Science. 128 (9), 1661-1668 (2015).
  9. Miller, R. T. Mechanical properties of basement membrane in health and disease. Matrix Biology. 57-58, 366-373 (2017).
  10. Mak, K. M., Mei, R. Basement membrane type IV collagen and laminin: An overview of their biology and value as fibrosis biomarkers of liver disease. Anatomical Record. 300 (8), 1371-1390 (2017).
  11. Fukumoto, S., et al. Laminin α5 is required for dental epithelium growth and polarity and the development of tooth bud and shape. Journal of Biological Chemistry. 281 (8), 5008-5016 (2006).
  12. Plachot, C., et al. Factors necessary to produce basoapical polarity in human glandular epithelium formed in conventional and high-throughput three-dimensional culture: Example of the breast epithelium. BMC Biology. 7, 77(2009).
  13. Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
  14. Loscertales, M., et al. Type IV collagen drives alveolar epithelial-endothelial association and the morphogenetic movements of septation. BMC Biology. 14, 59(2016).
  15. Kalluri, R. Basement membranes: Structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 3 (6), 422-433 (2003).
  16. Royer, C., Lu, X. Epithelial cell polarity: A major gatekeeper against cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1470-1477 (2011).
  17. McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster oogenesis: An overview. Methods in Molecular Biology. 1328, Clifton, N.J. 1-20 (2015).
  18. Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (3), 271-282 (2008).
  19. Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: Epithelial morphogenesis in theDrosophila egg chamber. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 559-574 (2005).
  20. Lerner, D. W., et al. A Rab10-dependent mechanism for polarized basement membrane secretion during organ morphogenesis. Developmental Cell. 24 (2), 159-168 (2013).
  21. Schneider, M., et al. Perlecan and Dystroglycan act at the basal side of the Drosophila follicular epithelium to maintain epithelial organization. Development. 133 (19), Cambridge, England. 3805-3815 (2006).
  22. Mao, M., Alavi, M. V., Labelle-Dumais, C., Gould, D. B. Type IV collagens and basement membrane diseases: Cell biology and pathogenic mechanisms. Current Topics in Membranes. 76, 61-116 (2015).
  23. Myllylä, R., et al. Expanding the lysyl hydroxylase toolbox: new insights into the localization and activities of lysyl hydroxylase 3 (LH3). Journal of Cellular Physiology. 212 (2), 323-329 (2007).
  24. Myllyharju, J., Kivirikko, K. I. Collagens, modifying enzymes and their mutations in humans, flies and worms. Trends in Genetics: TIG. 20 (1), 33-43 (2004).
  25. Norman, K. R., Moerman, D. G. The let-268 locus of Caenorhabditis elegans encodes a procollagen lysyl hydroxylase that is essential for type IV collagen secretion. Developmental Biology. 227 (2), 690-705 (2000).
  26. Rautavuoma, K., et al. Premature aggregation of type IV collagen and early lethality in lysyl hydroxylase 3 null mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (39), 14120-14125 (2004).
  27. Saito, K., et al. TANGO1 facilitates cargo loading at endoplasmic reticulum exit sites. Cell. 136 (5), 891-902 (2009).
  28. Denef, N., et al. Crag regulates epithelial architecture and polarized deposition of basement membrane proteins in Drosophila. Developmental Cell. 14 (3), 354-364 (2008).
  29. Devergne, O., Sun, G. H., Schüpbach, T. Stratum, a homolog of the human GEF Mss4, partnered with Rab8, controls the basal restriction of basement membrane proteins in epithelial cells. Cell Reports. 18 (8), 1831-1839 (2017).
  30. Devergne, O., Tsung, K., Barcelo, G., Schüpbach, T. Polarized deposition of basement membrane proteins depends on Phosphatidylinositol synthase and the levels of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7689-7694 (2014).
  31. Zajac, A. L., Horne-Badovinac, S. Kinesin-directed secretion of basement membrane proteins to a subdomain of the basolateral surface in Drosophila epithelial cells. Current Biology: CB. 32 (4), 735-748 (2022).
  32. Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15050(2001).
  33. Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
  34. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  35. Dunst, S., Tomancak, P. Imaging flies by fluorescence microscopy: Principles, technologies, and applications. Genetics. 211 (1), 15-34 (2019).
  36. Elliott, A. D. Confocal Microscopy: Principles and Modern Practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68(2020).
  37. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), (2014).
  38. Liu, S., Huh, H., Lee, S. H., Huang, F. Three-dimensional single-molecule localization microscopy in whole-cell and tissue specimens. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 155-184 (2020).
  39. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  40. Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
  41. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  42. Heintzmann, R., Huser, T. Super-resolution structured illumination microscopy. Chemical Reviews. 117 (23), 13890-13908 (2017).
  43. Müller, T., Schumann, C., Kraegeloh, A. STED microscopy and its applications: new insights into cellular processes on the nanoscale. Chemphyschem: A. European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (8), 1986-2000 (2012).
  44. Feng, H., Wang, X., Xu, Z., Zhang, X., Gao, Y. Super-resolution fluorescence microscopy for single cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1068, 59-71 (2018).
  45. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
  46. Wu, X., Hammer, J. A. ZEISS Airyscan: Optimizing usage for fast, gentle, super-resolution imaging. Methods in Molecular Biology. 2304, Clifton, N.J. 111-130 (2021).
  47. Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
  48. Tröger, J., et al. Comparison of multiscale imaging methods for brain research. Cells. 9 (6), 1377(2020).
  49. Zhang, W., et al. Virtual single-pixel imaging-based deconvolution method for spatial resolution improvement in wide-field fluorescence microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (7), 3648(2020).
  50. He, T., Sun, Y., Qi, J., Hu, J., Huang, H. Image deconvolution for confocal laser scanning microscopy using constrained total variation with a gradient field. Applied Optics. 58 (14), 3754(2019).
  51. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41(2017).
  52. Pulver, S. R., Berni, J. The fundamentals of flying: Simple and inexpensive strategies for employing drosophila genetics in neuroscience teaching laboratories. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 11 (1), 139-148 (2012).
  53. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of drosophila ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1), e52(2006).
  54. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
  55. Thompson, L., Randolph, K., Norvell, A. Basic techniques in drosophila ovary preparation. Methods in Molecular Biology. 1328, Clifton, N.J. 21-28 (2015).
  56. Long, D. E., et al. A guide for using NIH Image J for single slice cross-sectional area and composition analysis of the thigh from computed tomography. PLoS One. 14 (2), 0211629(2019).
  57. Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and live imaging of drosophila ovaries. Methods in Molecular Biology. 1478, Clifton, N.J. 215-226 (2016).
  58. Bier, E., et al. Advances in engineering the fly genome with the CRISPR-Cas system. Genetics. 208 (1), 1-18 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Confocale microscopiegepolariseerde secretiefolliculair epitheelvesikellokalisatieantilichaamskleuring3D reconstructie
Confocale en superresolutie beeldvorming van gepolariseerde intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten tijdens Drosophila Oogenesis
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.