Methodenartikel

Isolatie en identificatie van mesenchymale stamcellen uit het beenmerg van varkens en hun afgeleide extracellulaire blaasjes

4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63785

⸱

22 april 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, 2State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Center for Cardiovascular Experimental Study and Evaluation, National Center for Cardiovascular Diseases, Beijing Key Laboratory of Pre-clinical Research and Evaluation for Cardiovascular Implant Materials, Animal Experimental Center, Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Department of Cardiology, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College

In dit artikel

Samenvatting

In dit artikel wordt een methode uitgewerkt om mesenchymale stamcellen (pBM-MSC's) en extracellulaire blaasjes (EV's) van varkensbeenmerg die daarvan zijn afgeleid, te isoleren en te identificeren, en biedt een methodologische basis voor de preklinische evaluatie van de transplantatie-effectiviteit van BM-MSC's en hun afgeleide EV's.

Samenvatting

Met de ontwikkeling van stamceltherapie in translationeel onderzoek en regeneratieve geneeskunde, hebben mesenchymale stamcellen van het beenmerg (BM-MSC's), als een soort pluripotente stamcellen, de voorkeur vanwege hun onmiddellijke beschikbaarheid en bewezen veiligheid. Er is gemeld dat transplantatie van BM-MSC's van groot nut is voor het herstel van beschadigde weefsels bij verschillende ziekten, die mogelijk verband houden met het moduleren van de immuun- en ontstekingsreacties via paracriene mechanismen. Extracellulaire blaasjes (EV's), met een dubbellaagse lipidemembraanstructuur, worden beschouwd als de belangrijkste bemiddelaars van de paracriene effecten van stamcellen. Erkend voor hun cruciale rol in celcommunicatie en epigenetische regulatie, zijn EV's al in vivo toegepast voor immunotherapie. Net als bij de maternale cellen blijven de meeste onderzoeken naar de werkzaamheid van transplantatie van EV's echter nog steeds op het niveau van kleine dieren, wat niet voldoende is om essentieel bewijs te leveren voor klinische vertaling. Hier gebruiken we dichtheidsgradiëntcentrifugatie om eerst beenmergcellen (BMC) uit het beenmerg van varkens te isoleren en vervolgens BM-MSC's van varkens (pBM-MSC's) door celcultuur te krijgen, geïdentificeerd door de resultaten van observatie onder de microscoop, geïnduceerde differentiatietest en flowcytometrie. Bovendien isoleren we EV's afgeleid van pBM-MSC's in celsupernatans door middel van ultracentrifugatie, bewezen door de technieken van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), nanodeeltjesvolganalyse (NTA) en westerse blotting met succes. Over het algemeen kunnen pBM-MSC's en hun afgeleide EV's effectief worden geïsoleerd en geïdentificeerd aan de hand van de volgende protocollen, die op grote schaal kunnen worden gebruikt in preklinische onderzoeken naar de transplantatie-werkzaamheid van BM-MSC's en hun afgeleide EV's.

Inleiding

In de afgelopen 10 jaar heeft stamceltherapie grote voordelen beloofd voor patiënten die lijden aan een verscheidenheid aan ziekten en verwondingen, zoals trauma-, ademhalings- en hart- en vaatziekten. Met de vooruitgang in het veld krijgen mesenchymale stamcellen van het beenmerg (BM-MSC's) geleidelijk de voorkeur van mensen vanwege hun toegankelijkheid en weinig ethische geschillen1, die ondanks andere celtypen als de gouden standaard voor klinisch onderzoek worden beschouwd2. Therapieën op basis van BM-MSC's zijn ook aantrekkelijk voor steeds meer onderzoekers vanwege hun unieke vermogen om immuun- en ontstekingsreacties te moduleren en beschadigde weefsels te herstellen via differentiatie of paracriene mechanismen3.

Extracellulaire blaasjes (EV's), zoals de International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) onderschrijft4, verwijzen naar het totale aantal deeltjes met een lipide dubbellaagse structuur die van nature uit cellen vrijkomen. Met de recente ontdekkingen van verschillende inhouden zoals eiwitten, lipiden en genetisch materiaal (bijv. miRNA, mRNA, DNA-moleculen, evenals lange niet-coderende RNA's) in EV's van verschillende celtypen5, zijn hun cruciale rol in celcommunicatie en epigenetische regulatie erkend6. Als nieuw substituut voor maternale cellen zijn EV's toegepast in immunotherapie en regeneratieve geneeskunde met studies in vivo, die als basis dienen voor het lopende preklinische onderzoek en de follow-up klinische proeven7.

Op dit moment blijven de meeste studies naar de werkzaamheid van transplantatie van BM-MSC's en hun afgeleide EV's echter nog steeds op het niveau van kleine dieren, wat niet voldoende is om het nodige bewijs voor klinische vertaling te leveren. Daarom is het uiterst dringend om preklinisch onderzoek uit te voeren naar de transplantatie van BM-MSC's en hun afgeleide EV's op het niveau van grote dieren zoals varkens.

Er is gemeld dat MSC's in extreem lage aantallen aanwezig zijn in het beenmerg, goed voor slechts 0,01% tot 0,001% van het totale aantal cellen8. Preklinische toediening van BM-MSC's vereist echter een groot aantal cellen (≥107 per dier)9; de benodigde hoeveelheid EV's is zelfs nog groter, waarvan de mediane dosis 0,25 mg eiwit per kilogram lichaamsgewicht is bij varkens10. Om deze grote aantallen te bereiken, is er dringend behoefte aan een veilige en effectieve methode om MSC's uit beenmerg van varkens te isoleren en te kweken om hun enorme expansie in vitro te bereiken en vervolgens hun EV's met een hoge eiwitconcentratie te verkrijgen.

Tot nu toe zijn er verschillende methoden om BM-MSC's en hun afgeleide EV's te isoleren. De huidige methoden voor het isoleren van BM-MSC's omvatten directe beplanting van beenmergcellen (BMC's)11, dichtheidsgradiëntcentrifugatie, sortering van moleculaire labels op het celoppervlak en screening van flowcytometrie. Er is gemeld dat de moleculaire labelsortering op het celoppervlak en de screening van flowcytometrie resulteren in een afname van de celadhesiesnelheid, een toename van de mortaliteit gedurende 24 uur en proliferatieremming12, terwijl directe kweek van BMC's kan resulteren in een groot aantal gemengde hematopoëtische cellen. Daarom wordt dichtheidsgradiëntcentrifugatie nu vaak gebruikt om BM-MSC's te verkrijgen. De huidige methoden voor het isoleren van EV's uit celsupernatanten omvatten ultracentrifugatie, ultrafiltratie, polymeerprecipitatie en uitsluiting van grootte13. In vergelijking met andere methoden heeft ultracentrifugatie het voordeel van lage kosten, gebruiksgemak en compatibiliteit met voorbereiding van grote volumes zonder ingewikkelde voorbehandeling, wat de "gouden standaard" is geweest voor EV-scheiding14. Er bestaat echter een grote heterogeniteit in reagentia en technieken in verschillende laboratoria tijdens het proces 3,15, wat misleidend kan zijn voor lezers. In dit artikel wordt een reeks opeenvolgende stappen uitgelegd om pBM-MSC's en daarvan afgeleide EV's in detail te isoleren, en de daaropvolgende identificatieresultaten bewijzen dat de methode haalbaar is om pBM-MSC's en hun EV's te verkrijgen voor verdere analyse in preklinisch onderzoek. We hopen dat dit systematische werk een methodologische basis kan bieden voor onderzoekers die zich bezighouden met de preklinische evaluatie van transplantatie van pBM-MSC's en hun afgeleide EV's, zodat klinische proeven zo snel mogelijk kunnen worden uitgevoerd.

Protocol

Volgens de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, gepubliceerd door de National Institutes of Health, VS, zijn alle experimentele procedures goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences.

1. Preoperatieve voorbereiding voor de dieren

  1. Koop volwassen mannelijke Chinese minivarkens (30 ± 5 kg) van ongeveer 12 maanden oud bij het Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, en huisvest ze ten minste 2 weken van tevoren in de faciliteiten van het Animal Experimental Center, Fuwai Hospital. Voer preoperatieve inspecties uit, zoals routineonderzoeken van het bloed, om er zeker van te zijn dat de dieren gezond zijn.
  2. Reinig en scheer de huid van het dijbeen van het minivarken de dag voor de operatie. Om aspiratie te voorkomen, moet u de minipig 12 uur vasten voordat u het beenmerg extraheert.

2. Voorbereiding op celisolatie en teelt

  1. Gebruik Percoll (1.130 g/ml) om mesenchymale stamcellen uit het beenmerg te isoleren. Meng de stockoplossing met 10x geconcentreerd PBS in een verhouding van 9:1 om een isotoon medium te verkrijgen. Meng vervolgens het isotone medium met PBS in een verhouding van 3:2 om 60% Percoll-oplossing (1,077 g/ml) te verkrijgen, die kan worden gebruikt als de uiteindelijke scheidingsoplossing om pBM-MSC's te isoleren.
  2. Bereid Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) met 10% foetaal runderserum en 1,0% penicilline-streptomycine om een compleet medium te verkrijgen. Verwarm het volledige medium en PBS voor in een waterbad van 37 °C voor de verdere celteelt.

3. Verdoving voor de dieren

  1. Beheer algemene anesthesie met ketamine (10 mg/kg) en xylazine (2 mg/kg) intramusculair. Voer endotracheale intubatie snel uit wanneer de minipig langzaam ademt en minder ledemaatactiviteit heeft, en behoud spontane ademhaling om mislukte intubatie te voorkomen.
  2. Voer onderhoud van de anesthesie uit door inhalatie van 2% isofluraan, met zuurstof (1,5 l/min) als draaggas. Controleer tijdens de anesthesie de hartslag, ademhaling en zuurstofverzadiging in het bloed van het minivarken in realtime.

4. Beenmerg uit het minivarken halen

  1. Plaats het minivarken in een zijligging. Om ervoor te zorgen dat er voldoende beenmerg is voor de daaropvolgende celkweek, moet u het beenmergpunctiepunt in het proximale dijbeen van het minivarken plaatsen (Figuur 1). Desinfecteer en drapeer de huid van het prikgebied voordat de operatie wordt toegepast.
  2. Span de huid rond het prikpunt aan met de niet-dominante hand en prik de beenmergbiopsienaald verticaal op het punt met de dominante hand. Wanneer u voelt dat de naald in contact komt met het corticale bot, draait u het handvat voorzichtig naar links en rechts om de naald te boren. Wanneer de naald de beenmergholte binnengaat, is er vaak een gevoel van weerstandsverlies.
  3. Nadat de punctie op zijn plaats zit, trekt u de kernnaald terug. Bevestig vervolgens een steriele wegwerpspuit van 50 ml aan het uiteinde van de buitennaald en spoel de binnenwand van de spuit vooraf met heparine.
  4. Extraheer langzaam 20 ml beenmerg en breng ze voorzichtig over in een steriele centrifugebuis van 50 ml.
  5. Wanneer de procedure is voltooid, trekt u de naald eruit en verwijdert u het laken. Desinfecteer de prikplaats en druk er 20 minuten op voor hemostase.
  6. Extubeer het minivarken na herstel van de spontane ademhaling. Als het volledig wakker is en de ledematen vrij kunnen bewegen, breng je het minivarken terug naar de kooi om verder te eten.

5. Isoleren van mesenchymale stamcellen uit het beenmerg

  1. Voeg een gelijke hoeveelheid voorverwarmde PBS toe aan het beenmerg en meng ze grondig. Gebruik vervolgens een steriele pipet om 20 ml van het verdunde beenmerg boven het oplossingsniveau van 60% dichtheidsgradiënt met een volumeverhouding van 1:1 over te brengen in een steriele centrifugebuis van 50 ml.
  2. Centrifugeer de buis bij 600 x g ( versnelling (ACC) = 5, vertraging (DEC) = 5) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    OPMERKING: Na centrifugatie worden in de buis vier fasen gevormd, waaronder de serumfase, mononucleaire celfase, dichtheidsgradiënt, middenfase en precipitatiefase van boven naar beneden. De mononucleaire celfase is een dunne vlokkige laag tussen het serum en het dichtheidsgradiëntmedium. Mesenchymale stamcellen afkomstig van het beenmerg bevinden zich in deze fase.
  3. Zuig de mononucleaire celfase op in een steriele centrifugebuis van 15 ml en was tweemaal met PBS op 800 x g gedurende 5 minuten.
  4. Resuspendeer de gewassen cellen in 2 ml volledig medium en plant de geresuspendeerde cellen in een175 cm 2-cellige kweekkolf met een dichtheid van 3-5 x 105/ml.
    OPMERKING: Alle bovenstaande procedures voor het isoleren van mesenchymale stamcellen zijn te zien in figuur 2.

6. Mesenchymale stamcellen in vitro kweken

  1. Incubeer de kweekkolf bij 37 °C in een verzadigde bevochtigde atmosfeer van 5 % CO2 . Schud de kweekkolf elke 24 uur voorzichtig om aanhangende groei van de neergeslagen hematopoëtische stamcellen te voorkomen en observeer de celgroei, morfologie en besmetting onder een microscoop.
  2. Vervang het kweekmedium voor de eerste keer na 3 dagen en vervang het medium vervolgens elke 2-3 dagen. Wanneer de celkolonies 80%-90% samenvloeiing bereiken, subcultuur de cellen in een verhouding van 1:2.

7. Adipogene, osteogene en chondrogene differentiatie van pBM-MSC's

  1. Adipogene differentiatietest
    1. Bereid adipogeen differentiatiemedium A (Medium A) en B (Medium B) voor BM-MSC's voor volgens de instructies van de kit. Specifieke informatie over de kit is te vinden in de Materiaaltabel.
    2. Voeg 1 ml 0,1% gelatine toe aan de plaat met zes putjes en schud voorzichtig zodat deze de bodem van elke put gelijkmatig kan bedekken. Plaats vervolgens de plaat met zes putjes minimaal 30 minuten in een schone bank of CO2 -incubator.
    3. Zuig na 30 minuten de gelatine op en voeg 2 ml algemeen volledig medium toe aan elk putje. Plant vervolgens de pBM-MSC's in de plaat met zes putjes bij een celdichtheid van 2 x 104 cellen/cm2. Incubeer de plaat vervolgens bij 37 °C in een verzadigde vochtigheid van 5% CO2.
    4. Wanneer de cellen 100% samenvloeiing bereiken, verwijdert u voorzichtig het volledige medium en voegt u 2 ml medium A toe aan elk putje van de plaat. Haal na 3 dagen Medium A van het bord en voeg 2 ml Medium B toe aan elk putje.
    5. Na 1 dag te hebben onderhouden, verwijdert u Medium B en vervangt u het door Medium A voor inductie. Volgens de manier van "Medium A voor 3 dagen, Medium B voor 1 dag", gebruik Medium A en B achtereenvolgens voor inductie.
    6. Observeer de celtoestand elke dag tijdens de periode. Als de cellen krimpen of afsterven tijdens het inductieproces van Medium A, vervang het dan op tijd door Medium B totdat de celtoestand zich herstelt.
    7. Herhaal het inductie- en onderhoudsproces en bereid u voor op kleuring wanneer er voldoende lipidedruppels van geschikte grootte onder de microscoop worden waargenomen.
    8. Verwijder het medium voor adipogene differentiatie in de plaat met zes putjes en was voorzichtig met 1x PBS. Voeg 2 ml 4% paraformaldehyde-oplossing toe aan elk putje en fixeer gedurende 30 minuten bij RT.
    9. Verwijder het paraformaldehydefixeermiddel en was het twee of drie keer met 1x PBS om ervoor te zorgen dat het fixeermiddel grondig wordt verwijderd. Voeg 2 ml Oil Red O-kleurstof toe aan elk putje en kleur gedurende 30 minuten bij RT.
    10. Verwijder de Oil Red O kleurstof en was twee of drie keer met 1x PBS. Voeg 2 ml 1x PBS toe aan elk putje en observeer vervolgens het effect van adipogene differentiatie onder een microscoop.
  2. Osteogene differentiatietest
    1. Bereid het volledige medium voor osteogene differentiatie voor volgens de instructies van de kit.
    2. Volg de stappen 7.1.2-7.1.3 voor het planten en kweken van pBM-MSC's.
    3. Wanneer de cellen 70% samenvloeiing bereiken, verwijdert u voorzichtig het algemene volledige medium en voegt u 2 ml medium voor osteogene differentiatie toe aan elk putje van de plaat.
    4. Wissel elke 3 dagen over op vers osteogeen differentiatiemedium. Ga door met de inductie gedurende 2-4 weken en bereid je voor om te kleuren met de kleurstof Alizarin Red wanneer er duidelijke calciumknobbeltjes verschijnen tijdens osteogenese.
    5. Verwijder het medium voor osteogene differentiatie in de plaat met zes putjes en was voorzichtig met 1x PBS. Voeg 2 ml 4% paraformaldehyde-oplossing toe aan elk putje en fixeer gedurende 30 minuten bij RT.
    6. Verwijder het paraformaldehydefixeermiddel en was het twee of drie keer met 1x PBS om ervoor te zorgen dat het fixeermiddel grondig wordt gereinigd. Voeg 2 ml Alizarin Red-kleurstof toe aan elk putje en kleur gedurende 10 minuten bij RT.
    7. Verwijder de Alizarin Red kleurstof en was twee of drie keer met 1x PBS. Voeg 2 ml 1x PBS toe aan elk putje en observeer vervolgens het effect van osteogene differentiatie onder een microscoop.
  3. Chondrogene differentiatietest
    1. Bereid het voormengsel voor op chondrogene differentiatie volgens de instructies van de kit.
    2. Breng 3-4 x 105 pBM-MSC's over in een steriele centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer bij 250 x g gedurende 4 minuten bij 20 °C.
    3. Verwijder het bovenstaande en voeg 0,5 ml voormengsel toe om de pellet die in de vorige stap door centrifugeren is verkregen, opnieuw te suspenderen en centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 150 x g bij 20 °C. Herhaal deze stap om de cellen opnieuw te wassen.
    4. Bereid het volledige medium voor op chondrogene differentiatie.
    5. Resuspendeer de in de vorige stap verkregen cel met 0,5 ml volledig medium en centrifugeer bij 150 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C.
    6. Draai de dop van de centrifugebuis los om de gasuitwisseling te vergemakkelijken. Zet hem rechtop in een broedmachine bij 37 °C, 5% CO2 en verzadigde vochtigheid.
    7. Wanneer de cellen lijken samen te klonteren (meestal na 24-48 uur, afhankelijk van de werkelijke situatie), tikt u op de bodem van de centrifugebuis om de kraakbeenballen los te laten van de bodem en in het medium te laten zweven.
    8. Wissel elke 2-3 dagen over op vers compleet medium voor chondrogene differentiatie. Ga door met de inductie totdat kraakbeenballen met een diameter van 1,5-2 mm in de buis worden gevormd en bereid vervolgens secties voor op kleuring.
    9. Bereid paraffinesecties van kraakbeenballen voor volgens de routinestappen van pathologische experimenten. Voeg Alicia blauwe kleurstof toe aan de ontwaxte delen en beits gedurende 1 uur bij 37 °C.
    10. Spoel het glaasje 5 minuten af met stromend water en observeer vervolgens het vlekkende effect van Alicia blauw onder een microscoop na het drogen.

8. Identificatie van het celfenotype door middel van flowcytometrie

  1. Wanneer de celkolonies 80%-90% samenvloeiing bereiken in passages 3-5, verwijdert u het kweekmedium en wast u de cellen twee keer met voorverwarmd PBS. Verteer de cellen vervolgens met 3-4 ml 0,25% trypsine/EDTA en incubeer ze bij 37 °C in een verzadigde bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 gedurende 2-3 minuten totdat ze onder een microscoop van de bodem van de kolf worden losgemaakt.
  2. Oogst de cellen met een compleet medium van 10 ml en breng de celsuspensie over in een steriele centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer de celsuspensie bij 800 x g gedurende 5 minuten bij RT. Gooi het bovenstaande weg en spoel de cellen met 4 °C PBS.
  3. Resuspendeer de cellen tot 10 ml met 4 °C PBS. De celsuspensie is verdeeld in negen groepen met een volume van 1 ml in elke microbuis van 1,5 ml, respectievelijk negatieve controle, FITC-isotypecontrole, PE-isotypecontrole, APC-isotypecontrole, CD105, CD29, CD90, CD14 en CD45-groep genoemd. Zorg ervoor dat het aantal cellen in elke microbuis tussen 1 x 105 en 1 x 106 ligt.
  4. Centrifugeer de suspensie bij 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en suspendeer de cellen in elke microbuis opnieuw met 100 μl 4 °C PBS. Voeg behalve voor de negatieve controlegroep 5 μL van de corresponderende isotypecontrole (FITC, PE en APC Mouse IgG1 kappa Isotype Control) en antilichamen (CD105, CD29, CD90, CD14 en CD45 Monoklonaal Antilichaam) voor flowcytometrie toe aan elke microbuis volgens de volgorde in stap 8.3. Meng voorzichtig en incubeer gedurende 1,5 uur bij 4 °C in het donker.
  5. Voeg aan elke microbuis 1 ml PBS 4 °C toe en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g bij 4 °C. Gooi het bovenstaande weg en voeg 200 μl PBS van 4 °C toe om de cellen opnieuw in suspentie te brengen.
  6. Test ten minste 10.000 cellen op de flowcytometrie na het filteren van de celsuspensie16 en analyseer de gegevens met behulp van de flowcytometriesoftware.

9. Isolerende extracellulaire blaasjes (EV's) afgeleid van mesenchymale stamcellen uit het beenmerg van varkens

  1. Wanneer de samenvloeiing van pBM-MSC's 80%-90% bereikt, gooi je het bovenstaande weg en was je de cellen 2x met PBS. Voeg vervolgens 25 ml serumvrij IMDM toe aan elke kweekkolf en blijf gedurende 48 uur incuberen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 .
  2. Verzamel het celsupernatans (geconditioneerd medium, CM) in een centrifugebuis van 50 ml en centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om de celresten te verwijderen.
  3. Vang het bovenstaande weer op in een andere centrifugebuis van 50 ml. Voer de isolatie van EV's zo snel mogelijk uit na het verzamelen van de supernatant. Bewaar het bovenstaande voor langdurige opslag in de koelkast bij -80 °C om het verlies van EV's te voorkomen.
  4. Centrifugeer het bovenstaande in stap 9.3 bij 2.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
  5. Breng het bovenstaande over in een steriel buisje dat wordt gebruikt voor de hogesnelheidscentrifuge en centrifugeer bij 16.500 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
  6. Breng het bovenstaande opnieuw over in een ultracentrifugebuis en centrifugeer bij 120.000 x g gedurende ten minste 70 minuten bij 4 °C, met een rotor met een vaste hoek.
  7. Gooi het bovenstaande volledig weg. Voeg 1 ml PBS van 4 °C toe aan elke ultracentrifugebuis en suspendeer de neerslag opnieuw met een micropipet. Meng de oplossing uit dezelfde groep in een ultracentrifugebuis en voeg vervolgens 4 °C PBS toe om het volume meer dan 3/4 van de buis te maken.
  8. Centrifugeer bij 120.000 x g gedurende 60 minuten bij 4 °C en verwijder het bovenstaande zoveel mogelijk.
  9. Resuspendeer het cipitant opnieuw met steriel PBS en bewaar de EV's in een koelkast van -80 °C.
    OPMERKING: De hoeveelheid PBS voor resuspensie kan worden bepaald als 100 μl voor de neerslag van elke twee kweekkolven van 175cm2 . Alle bovenstaande stappen voor het isoleren van EV's worden systematisch weergegeven in figuur 3 .

10. Identificatie van EV's door middel van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), nanodeeltjesvolganalyse (NTA) en western blotting

  1. Plaats het EVs-monster op ijs nadat u het hebt ontdooid in een waterbad van 25 °C en verdun vervolgens tot de helft van de vorige concentratie met PBS voor NTA-detectie17.
  2. Pipetteer 10 μL van het monster op het koperen gaas, laat het 1 minuut bezinken en absorbeer de drijvende vloeistof met filterpapier. Voeg vervolgens 10 μL fosfowolfraamzuur toe aan het koperen gaas, laat het 1 minuut staan en absorbeer de overtollige vloeistof.
  3. Na een paar minuten drogen bij RT, voert u elektronenmicroscopiebeeldvorming uit onder de voorwaarde van 100 KV versnellende spanning18.
  4. Resuspendeer het EVs-monster uit stap 9.9 in de RIPA-lysisbuffer (25 mM Tris· HCl (pH 7,6), 150 mM natriumchloride [NaCl], 1% nonylfenoxypolyethoxyethanol (NP-40), 1% natriumdeoxycholaat, 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS), 1 mM fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF), 1x proteaseremmer), en detecteer de expressie van specifieke markers voor EV's zoals Alix, TSG101, CD81 en CD63 door western blotting19.

Resultaten

Vorming van mesenchymale stamcellen uit het beenmerg van varkens
Mesenchymale stamcellen afgeleid van beenmerg van varkens werden met succes geïsoleerd en in vitro gekweekt, en de morfologie van pBM-MSC's op verschillende dagen is te zien in figuur 4. In de primaire cultuur van pBM-MSC's toonde microscopische observatie aan dat de celhechting een dag na het planten plaatsvond en dat de aanhangende cellen meestal rond van vorm waren. De primaire pBM-MSC's bleven over het algemeen 3 dagen na het planten in de rustfase en de celproliferatie begon op de 4edag. De celmorfologie veranderde na proliferatie van rond naar spoel-, multilateraal- of stertype, en de kernen zijn centraal, met dubbele nucleoli in sommige cellen. Celkolonies werden 7-9 dagen na het begin van de celproliferatie gevormd en 80%-90% celsamenvloeiing kon worden bereikt na 12-14 dagen. De microscopische waarneming toonde aan dat aanhangende cellen groeiden als verspreide kolonies en in een wervelend patroon waren gerangschikt.

De celproliferatie werd aanzienlijk versneld na het passeren en 80%-90% samenvloeiing kon in een week worden bereikt. De celmorfologie was homogeen spoelvormig vanaf de tweede passage, lijkend op fibroblasten, met een lengte-breedteverhouding van ongeveer 2-3:1. Als de cellen gedifferentieerd waren, zouden ze veelhoekig of stervormig kunnen lijken. Na het passeren groeiden de cellen niet meer als verspreide kolonies, maar gelijkmatig en radiaal in een parallelle opstelling.

Identificatie van het celdifferentiatiepotentieel door kleuring
In de adipogene differentiatietest toonde Oil Red O-kleuring aan dat er ronde oranjerode lipidedruppels van verschillende grootte rond de kern verschenen (Figuur 5A); In de osteogene differentiatietest toonde Alizarin Red-kleuring rode knobbeltjes op het celoppervlak (Figuur 5B), die werd veroorzaakt door de kleurreactie met calciumzouten die werden afgezet door osteoblasten die gedifferentieerd waren van pBM-MSC's. In de chondrogene differentiatietest toonde Alicia blue-kleuring aan dat het hele weefselgedeelte blauw was (Figuur 5C), wat werd veroorzaakt door de kleuring van endozuur mucopolysaccharide in kraakbeenballen.

Identificatie van celfenotype door middel van flowcytometrie
Testen van de celoppervlaktemarkers werden uitgevoerd om een fenotype van pBM-MSC's te creëren. Uit de resultaten van de flowcytometrie (Figuur 6) werden drie positieve markers zoals CD105, CD29 en CD90 significant tot expressie gebracht op het oppervlak van pBM-MSC's, goed voor respectievelijk 96,5%, 99,8% en 92% (Figuur 6A-C). De expressie van CD14 en CD45 was echter negatief (Figuur 6D,E). Ondertussen waren de resultaten van overeenkomstige isotypecontroles allemaal negatief, wat al over de figuur is gelegd, waardoor de mogelijkheid van niet-specifieke binding van antilichamen wordt uitgesloten.

Identificatie van EV's afgeleid van pBM-MSC's door NTA, TEM en western blotting
Het resultaat van NTA toonde aan dat de mediane deeltjesgrootte 126,9 nm was, wat binnen het bereik van EV's lag; bovendien was de oorspronkelijke concentratie van de EVs-steekproef 1,5 x 1010 deeltjes/ml, en de nauwkeurige waarde die aan de grootte is toegekend, is te vinden in figuur 7A. Het baandiagram van de deeltjes wordt getoond in figuur 7B, die illustreert dat de deeltjes in een onregelmatige Brownse beweging waren. Bovendien was het schijfvormige blaasje, als de klassieke structuur van EV's, duidelijk te zien onder de elektronenmicroscoop bij vergrotingen van 50.000x (Figuur 7C). Ook werd de expressie van specifieke markers voor EV's zoals Alix, TSG101, CD81 en CD63 in de steekproef gedetecteerd door western blotting (Figuur 7D).

figure-results-1
Figuur 1: Beenmergpunctiepunt van het minivarken. Het rode gebied toont het prikpunt van het extractiebeenmerg, gelegen op het proximale dijbeen van het minivarken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Isoleren van mesenchymale stamcellen uit het beenmerg van varkens. Het proces van het isoleren van mesenchymale stamcellen uit het beenmerg van varkens wordt weergegeven in het stroomschema en vier vloeistoffasen worden duidelijk geïllustreerd na centrifugatie met dichtheidsgradiënt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Isoleren van EV's afgeleid van pBM-MSC's. Het schematische diagram toont specifieke stappen om EV's te isoleren van het geconditioneerde medium door middel van ultracentrifugatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Morfologische kenmerken van pBM-MSC's op verschillende dagen. Vergelijkbare morfologische kenmerken van pBM-MSC's zijn te zien op de3e,5e, 7e en 9edag na het planten onder het 100x microscopische veld, en celkolonies zijn gevormd op de 9edag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5. Identificatie van het differentiatiepotentieel van pBM-MSC's door kleuring. (A) Adipogene, (B) osteogene en (C) chondrogene differentiatietest van respectievelijk pBM-MSC's. Het differentiatiepotentieel van pBM-MSC's kan worden geïdentificeerd aan de hand van deze kleuringsresultaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Identificatieresultaten van pBM-MSC's door middel van flowcytometrie. CD105, CD29 en CD90 komen significant tot expressie op het oppervlak van pBM-MSC's, goed voor respectievelijk 96,5%, 99,8% en 92,0%, terwijl de expressie van CD14 en CD45 negatief is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Identificatieresultaten van EV's afgeleid van pBM-MSC's naar morfologie en moleculaire biologie. (A) NTA-resultaat van EV's afgeleid van pBM-MSC's, met respectievelijk deeltjesgrootteverdelingsgrafiek en (B) deeltjestrajectdiagram; (C) TEM-afbeelding gemaakt met vergrotingen van 50.000x, en de witte pijl toont de klassieke structuur van schijfvormige blaasjes. (D) Expressie van specifieke markers voor EV's door western blotting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het traditionele beenmergpunctiepunt van minivarkens werd gepositioneerd op de bekkenkam20. Hoewel het gemakkelijk te lokaliseren is, is de hoeveelheid beenmergextractie beperkt21 (slechts ongeveer 5 ml in het algemeen), dus het is moeilijk om te voldoen aan de vereiste van een groot aantal uitbreidingen in vitro voor de transplantatie in vivo. Bij deze methode hebben we het beenmergpunctiepunt verplaatst naar het proximale dijbeen en kan ten minste 20 ml beenmerg uit deze plaats worden geëxtraheerd, wat een voldoende hoeveelheid pBM-MSC's garandeert voor latere celkweek.

De twee belangrijkste scheidingsoplossingen die worden gebruikt voor het isoleren van BM-MSC's door middel van dichtheidsgradiëntcentrifugatie zijn Percoll en Ficoll. Percoll is samengesteld uit gesiliconiseerd polyvinylpyrrolidon (PVP), een nieuw niet-toxisch en niet-irriterend centrifugaalmiddel met dichtheidsgradiënt. De lage diffusieconstante van Percoll resulteert in een relatief stabiele dichtheidsgradiënt; Daarom kan een bevredigende celscheiding meestal binnen tientallen minuten worden bereikt bij lage centrifugale krachten (200-1000 x g). De methode voor isolatie van pBM-MSC's met behulp van Ficoll is eerder gerapporteerd21. Vergeleken met Ficoll is Percoll geleidelijk gebruikt vanwege de voordelen van gemakkelijke isopermeabiliteit, lage viscositeit, niet-toxiciteit en het niet veroorzaken van celaggregatie, wat een aanvulling kan zijn op de bestaande methoden voor het isoleren van pBM-MSC's.

Bij het isoleren en kweken van pBM-MSC's kunnen enkele cruciale stappen niet worden genegeerd. Ten eerste is succesvolle stratificatie van verschillende vloeistoffasen na dichtheidsgradiëntcentrifugatie de sleutel tot het isoleren van gezuiverde pBM-MSC's. BM-MSC's, als een type mononucleaire beenmergcellen (BM-MNC's), hebben een soortelijk gewicht dat vergelijkbaar is met dat van lymfocyten en monocyten, ongeveer 1,075 g/ml. De oorspronkelijke dichtheid van Percoll is 1,130 g/ml, en om de cellaag die BM-MSC's bevat met succes te verkrijgen na dichtheidsgradiëntcentrifugatie, moet 60% isotone dichtheidsgradiëntscheidingsoplossing (1,077 g/ml) van tevoren worden geconfigureerd volgens de Percoll-dichtheidsconcentratierelatie22. Bovendien dragen de juiste centrifugatieomstandigheden ook bij aan een succesvolle stratificatie. Gezien de lage diffusieconstante van Percoll, centrifugeerden we het geëxtraheerde beenmerg bij 600 x g gedurende 20 minuten bij relatief lage acceleratie-/vertragingsniveaus (ACC = 5, DEC = 5), wat een goed stratificatie-effect bereikte. Ten tweede is de juiste plantdichtheid ook essentieel voor celcultuur. Om een voldoende aantal MSC's (meestal meer dan 107 per dier9) te verkrijgen voor latere transplantatie, gebruiken we 175 cm2 kweekkolven voor celcultuur. In een eerdere studie20 werden de verkregen BM-MNC's meestal geplant in kweekkolven voor teelt met een dichtheid van 5 x 105/cm2. Er is gemeld dat na dichtheidsgradiëntcentrifugatie 2-3 x 107 BM-MNC's kunnen worden verkregen voor elke 5 ml beenmerg van varkens23. Daarom raden we in dit protocol aan om totale BM-MNC's geïsoleerd uit elk beenmerg van 20 ml varkens in een kweekkolf van 175cm2 te planten voor een geschikte dichtheid. Ten derde moeten onzuiverheden worden vermeden tijdens de isolatie en kweek van pBM-MSC's. Bij het optrekken van de mononucleaire celfase mag de pipet niet in de Percoll-fase worden ingebracht om niet te vermengen met de scheidingsvloeistof. Bovendien moet de kweekkolf na 24 uur celplanting voorzichtig worden geschud om de hechting van rode bloedcellen te verminderen.

Tijdens het proces van ultracentrifugatie brengen hoge niveaus van eiwitaggregaat en lipoproteïnebesmetting via deze methode onvermijdelijk de kwantificering en functionele analyse van EV'sin gevaar 14. Om verontreiniging tijdens het proces zoveel mogelijk te beperken, moet bij het overbrengen van het bovenstaande vóór de ultracentrifugatiestap telkens een diepte van 5 mm vloeistof in de bodem worden aangehouden. Ondertussen, na de eerste ultracentrifugatie, kan het opnieuw suspenderen van de pellet in steriel PBS en vervolgens opnieuw ultracentrifugeren uitvoeren, de besmetting met lipoproteïnen effectief verminderen.

Hoewel dichtheidsgradiëntcentrifugatie en ultracentrifugatie op grote schaal zijn gebruikt bij het isoleren van respectievelijk BM-MSC's en hun afgeleide EV's, hebben deze twee technieken ook hun eigen beperkingen. Aan de ene kant is de Percoll-techniek lang en omslachtig, en het opleveren van een BM-concentraatmonster via een celconcentratieapparaat aan het bed is gerapporteerd als een alternatieve methode om MSC's24 te isoleren. Aan de andere kant vereist de ultracentrifugatiemethode niet alleen hoogopgeleide technici, maar ook dure apparatuur; daarom kan de gecombineerde toepassing van twee of meer technieken een redelijke strategie zijn voor een efficiëntere isolatie van EV's25. Daarnaast moet ook de identificatie van pBM-MSC's en hun afgeleide EV's worden verbeterd. Volgens de internationale criteria voor het definiëren van MSC's26 ontbreekt bijvoorbeeld de expressie van sommige positieve of negatieve markers, zoals CD73, CD34 en HLA-DR, nog steeds in de identificatieresultaten van BM-MSC-fenotypes door flowcytometrie in deze studie. Hoewel er maatregelen zijn genomen om besmetting tijdens het proces van het isoleren van EV's te voorkomen, kunnen we vanwege de beperkingen van ons laboratorium de zuiverheid van het EV-monster niet beoordelen om het vervolgwerk te helpen verbeteren.

Deze studie combineert methoden voor de isolatie van pBM-MSC's en hun afgeleide EV's sequentieel, bewezen door de daaropvolgende identificatieresultaten systematisch. In het bijzonder hebben we de belangrijkste bewerkingen in deze reeks stappen belicht, waarbij we enkele specifieke experimentele omstandigheden hebben uitgelegd die het probleem van heterogeniteit dat tijdens dit proces in verschillende laboratoria bestaat, tot op zekere hoogte kunnen oplossen. Dit methodische werk kan op grote schaal worden gebruikt in preklinische studies naar de transplantatie-effectiviteit van BM-MSC's en hun afgeleide EV's, die een experimentele basis zouden kunnen bieden met een voldoende niveau voor klinisch onderzoek.

Openbaarmakingen

Alle auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.

Dankbetuigingen

We danken Yang Jianzhong en Wang Xuemin voor hun bijdragen aan de werking van beenmergextractie. Dit werk werd ondersteund door subsidies van CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) [subsidienummer 2016-I2M-1-009], National Natural Science Foundation of China (nr: 82070307; nr: 81874461).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
175 cm2 cell culture flaskThermo Fisher159910gebruikt voor celkweek
0.25% Trypsin/EDTAThermo Fisher25200056gebruikt om cellen te verteren
Adipogenic Differentiation Kit for Bone Marrow Mesenchymal Stem CellOriCell  GUXMX-90031gebruikt voor adipogene differentiatie assay
Alix Monoclonal AntibodyThermo FisherMA1-83977gebruikt om extracellulaire blaasjes (EVs) te identificeren door middel van western blotting
APC Mouse IgG1 kappa Isotype ControlThermo Fisher17-4714-42gebruikt om de effecten van niet-specifieke kleuring in flow cytometry te elimineren
CD105 (Endoglin) Monoclonal AntibodyThermo Fisher17-1057-42gebruikt om pBM-MSCs te identificeren door middel van flow cytometry
CD14 Monoclonal AntibodyThermo FisherMA1-82074gebruikt om pBM-MSCs te identificeren door middel van flow cytometry
CD29/IGTB1 Monoclonal AntibodyThermo FisherMA1-19458gebruikt om pBM-MSCs te identificeren door middel van flow cytometry
CD45 Monoclonal AntibodyThermo FisherMA5-28383gebruikt om pBM-MSCs te identificeren door middel van flow cytometry
CD63 Monoclonal AntibodyThermo Fisher10628Dgebruikt om EV's te identificeren door middel van western blotting
CD81 Monoclonal AntibodyThermo FisherMA5-13548gebruikt om EV's te identificeren door middel van western blotting
CD90 Monoclonal AntibodyThermo FisherA15794gebruikt om pBM-MSCs te identificeren door middel van flow cytometry
Chondrogenic Differentiation Kit for Bone Marrow Mesenchymal Stem CellOriCellGUXMX-90041gebruikt voor chondrogene differentiatie assay
Fetal Bovine SerumGibco10099141Cgebruikt om compleet medium te bereiden
FITC Mouse IgG1 kappa Isotype ControlThermo Fisher11-4714-42gebruikt om de effecten van niet-specifieke kleuring in flow cytometry te elimineren
Flow cytometryBDAccuri C6gebruikt voor identificatie van celfenotype
FlowJo softwareBDV10gebruikt om gegevens uit flow cytometry te analyseren
High-speed centrifuge tube (50 mL)Beckman357003gebruikt voor hoogsnelheidscentrifugatie
Iscove's Modified Dulbecco's MediumGibcoC12440500BTgebruikt voor celkweek
Low-temperature high-speed floor centrifugeAvantiJ-26XPIgebruikt voor hoogsnelheidscentrifugatie om schoon geconditioneerd medium te verkrijgen
Nonyl phenoxypolyethoxylethanol (NP-40)Sigma-AldrichNP40Sgebruikt voor de samenstelling van RIPA lysis buffer
Osteogenic Differentiation Kit for Bone Marrow Mesenchymal Stem CellOriCellGUXMX-90021gebruikt voor osteogene differentiatie assay
PE Mouse IgG1 kappa Isotype ControlThermo Fisher12-4714-42gebruikt om de effecten van niet-specifieke kleuring in flow cytometry te elimineren
PercollCytiva17089102gebruikt om porcine beenmerg mesenchymale stamcellen (pBM-MSC's) te isoleren
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)Thermo Scientific36978gebruikt voor de samenstelling van RIPA lysis buffer
Phosphate Buffered Saline(10x)BeyotimeST476gebruikt om isotone Percoll oplossing te bereiden
Phosphate Buffered Saline(1x)CytivaAF29561133gebruikt om Percoll te verdunnen en cellen te wassen
Protease inhibitor (1x)Thermo ScientificA32955gebruikt voor de samenstelling van RIPA lysis buffer
sodium chlorideSigma-AldrichS9888gebruikt voor de samenstelling van RIPA lysis buffer
sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750gebruikt voor de samenstelling van RIPA lysis buffer
sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma-AldrichL3771gebruikt voor de samenstelling van RIPA lysis buffer
Transmission electron microscopyHitachiHT7700gebruikt voor elektronenmicroscopie beeldvorming
Tris·HClSigma-Aldrich93363gebruikt voor de samenstelling van RIPA lysis buffer
TSG101 Monoclonal AntibodyThermo FisherMA1-23296gebruikt om EV's te identificeren door middel van western blotting
Ultracentrifuge (Type 50.2 Ti Rotor)Beckmanoptima L-100XPgebruikt voor ultracentrifugatie om exosomen te isoleren
Ultracentrifuge tube (26.3 mL)Beckman355654gebruikt voor ultracentrifugatie
ZetaVIEWParticle MetrixS/N 17-310gebruikt voor Nanoparticle Tracking Analysis

Referenties

  1. Heslop, J. A., et al. Concise review: workshop review: understanding and assessing the risks of stem cell-based therapies. Stem Cells Translational Medicine. 4 (4), 389-400 (2015).
  2. Berebichez-Fridman, R., Montero-Olvera, P. R. Sources and clinical applications of mesenchymal stem cells: State-of-the-art review. Sultan Qaboos University Medical Journal. 18 (3), 264-277 (2018).
  3. Antebi, B., Mohammadipoor, A., Batchinsky, A. I., Cancio, L. C. The promise of mesenchymal stem cell therapy for acute respiratory distress syndrome. The Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 84 (1), 183-191 (2018).
  4. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  5. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
  6. Farooqi, A. A., et al. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds. Biotechnology Advances. 36 (1), 328-334 (2018).
  7. Lener, T., et al. Applying extracellular vesicles based therapeutics in clinical trials - an ISEV position paper. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 30087(2015).
  8. Castro-Malaspina, H., et al. Characterization of human bone marrow fibroblast colony-forming cells (CFU-F) and their progeny. Blood. 56 (2), 289-301 (1980).
  9. vander Spoel, T. I. G., et al. Human relevance of pre-clinical studies in stem cell therapy: systematic review and meta-analysis of large animal models of ischaemic heart disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 649-658 (2011).
  10. Gupta, D., Zickler, A. M., El Andaloussi, S. Dosing extracellular vesicles. Advanced Drug Delivery Reviews. 178, 113961(2021).
  11. Mareschi, K., et al. Multipotent mesenchymal stromal stem cell expansion by plating whole bone marrow at a low cellular density: a more advantageous method for clinical use. Stem Cells International. , 920581(2012).
  12. Van Vlasselaer, P., Falla, N., Snoeck, H., Mathieu, E. Characterization and purification of osteogenic cells from murine bone marrow by two-color cell sorting using anti-Sca-1 monoclonal antibody and wheat germ agglutinin. Blood. 84 (3), 753-763 (1994).
  13. Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
  14. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  15. Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers In Immunology. 9, 738(2018).
  16. Huang, P., et al. Combinatorial treatment of acute myocardial infarction using stem cells and their derived exosomes resulted in improved heart performance. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 300(2019).
  17. Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e61979(2021).
  18. Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56482(2018).
  19. Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (119), e55057(2017).
  20. Yang, Y. J., et al. Atorvastatin treatment improves survival and effects of implanted mesenchymal stem cells in post-infarct swine hearts. European Heart Journal. 29 (12), 1578-1590 (2008).
  21. Lee, W. -J., et al. Isolation and cellular phenotyping of mesenchymal stem cells derived from synovial fluid and bone marrow of minipigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e54077(2016).
  22. Lindqvist, R. Food Microorganisms: Buoyant Density Centrifugation. Encyclopedia of Separation Science. Wilson, I. D. , Academic Press. 2843-2849 (2000).
  23. Yao, Y. L., Zhang, H., Gong, D. J., Song, Z. G., Xu, Z. Y. Transfecting hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel 2 gene into porcine bone marrow mesenchymal stem cells. Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research. 13 (49), 9673-9676 (2009).
  24. Hegde, V., et al. A prospective comparison of 3 approved systems for autologous bone marrow concentration demonstrated nonequivalency in progenitor cell number and concentration. Journal of Orthopaedic Trauma. 28 (10), 591-598 (2014).
  25. Gallet, R., et al. Exosomes secreted by cardiosphere-derived cells reduce scarring, attenuate adverse remodelling, and improve function in acute and chronic porcine myocardial infarction. European Heart Journal. 38 (3), 201-211 (2017).
  26. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Varkens BM MSC sdichtheidsgradi ntcentrifugatiecelkweekflowcytometrieultracentrifugatietransmissie elektronenmicroscopienanopartikel trackinganalyseWestern blotting
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen