Methodenartikel

Label-Retention Expansion Microscopy (LR-ExM) maakt beeldvorming met superresolutie en zeer efficiënte etikettering mogelijk

3.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63793

⸱

11 oktober 2022

 ,  , 
1Center for Complex Biological Systems, University of California Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California Irvine, 3Department of Chemistry, University of California Irvine

In dit artikel

Samenvatting

Een protocol van labelretentie expansie microscopie (LR-ExM) wordt gedemonstreerd. LR-ExM maakt gebruik van een nieuwe set trifunctionele ankers, die een betere etiketteringsefficiëntie biedt in vergelijking met eerder geïntroduceerde uitbreidingsmicroscopieën.

Samenvatting

Expansiemicroscopie (ExM) is een monstervoorbereidingstechniek die kan worden gecombineerd met de meeste lichtmicroscopiemethoden om de resolutie te verhogen. Na het inbedden van cellen of weefsels in opzwellende hydrogel, kunnen monsters fysiek drie- tot zestienvoudig (lineaire dimensie) worden uitgebreid in vergelijking met de oorspronkelijke grootte. Daarom wordt de effectieve resolutie van elke microscoop verhoogd door de expansiefactor. Een belangrijke beperking van de eerder geïntroduceerde ExM is verminderde fluorescentie na polymerisatie en de verteringsprocedure. Om deze beperking te overwinnen, is labelretentie-uitbreidingsmicroscopie (LR-ExM) ontwikkeld, die signaalverlies voorkomt en de etiketteringsefficiëntie aanzienlijk verbetert met behulp van een reeks nieuwe trifunctionele ankers. Deze techniek maakt het mogelijk om een hogere resolutie te bereiken bij het onderzoeken van cellulaire of subcellulaire structuren op nanometrische schaal met minimaal fluorescerend signaalverlies. LR-ExM kan niet alleen worden gebruikt voor immunofluorescentie-etikettering, maar ook met zelfetikettering van eiwittags, zoals SNAP- en CLIP-tags, waardoor een hogere etiketteringsefficiëntie wordt bereikt. Dit werk presenteert de procedure en probleemoplossing voor deze op immunostaining gebaseerde benadering, evenals een bespreking van zelflabelende taggingbenaderingen van LR-ExM als alternatief.

Inleiding

Expansiemicroscopie (ExM) wordt door onderzoekers gebruikt sinds het voor het eerst werd geïntroduceerd als een handige benadering om superresolutiebeeldvorming te bereiken met conventionele microscopen, zoals epifluorescentie en confocale microscopen 1,2,3,4,5,6,7 . Met behulp van ExM is het mogelijk om ~ 70 nm laterale resolutie te bereiken, zelfs met gewone confocale microscopen. Wanneer ExM wordt gecombineerd met beeldvorming met superresolutie, wordt de resolutie verder verbeterd. Men kan bijvoorbeeld ongeveer 30 nm resolutie bereiken met gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM) en ongeveer 4 nm resolutie met stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM)1,5.

Een lage etiketteringsefficiëntie is echter een kritiek probleem bij standaard ExM-methoden. Fluorescentieverlies kan variëren op basis van het type fluorescerende groepen en de verteringstijd. Gemiddeld is echter gemeld dat meer dan 50% van de fluoroforen verloren gaat na de polymerisatie en de eiwitverteringsstappen van ExM, wat schadelijk is voor de beeldvormingskwaliteit 3,4.

Zo is labelretentie-expansiemicroscopie (LR-ExM) ontwikkeld, die efficiënt labels kan behouden en signaalverlies kan verminderen1. De belangrijkste innovatie van LR-ExM is het gebruik van een set trifunctionele ankers in plaats van alleen fluorescerende kleurstoffen te gebruiken - zoals in de standaard ExM-procedure - voor het kleuren van eiwitten van belang. Deze trifunctionele linkers bestaan uit drie delen: (1) de connector (bijv. N-hydroxysuccinimide (NHS)) om verbinding te maken met het antilichaam, (2) het anker (bijv. Methacrylamide (MA)) om eiwitten aan het polymeer te verankeren, en (3) de verslaggever (bijv. Biotine of digoxigenine (DIG)) om te conjugeren aan een organische kleurstof. De trifunctionele ankers overleven de polymerisatie- en eiwitverteringsstappen en voorkomen daarom fluorofoorverlies.

Bovendien heeft deze methode een groot potentieel omdat het compatibel is met zelfetiketterende enzymatische tags zoals SNAP of CLIP. Enzymatische tagbenaderingen hebben enkele voordelen ten opzichte van de immunostaining-benadering met betrekking tot hoge specificiteit en etiketteringsefficiëntie 8,9,10.

In dit manuscript wordt een gedetailleerde procedure van LR-ExM gedemonstreerd. LR-ExM is een zeer effectieve en flexibele methode om een hoge ruimtelijke resolutie te bereiken met verbeterde etiketteringsefficiëntie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Celkweek

  1. Gebruik U2OS-cellen gekweekt in McCoy's 5A-medium aangevuld met 10% FBS bij 37 °C in 5% CO2.
  2. Kweekcellen op een 16 goed verwijderbare kamer coverglas (kweekoppervlak 0,4 cm2) voor gebruiksgemak.

2. Fixatie en permeabilisatie

OPMERKING: Fixatie- en permeabilisatiecondities zijn afhankelijk van de geoptimaliseerde immunostainingprotocollen. Het volgende is een fixatie- en permeabilisatieprotocol om microtubuli en clathrine gecoate putten (CCP's) te co-immunostainen.

  1. Zodra het aantal cellen ~0,04 x 106 bereikt, fixeert u cellen met 100 μL 3,2% paraformaldehyde (PFA) in PEM-buffer (100 mM PIPES, 1 mM EGTA en 1 mM MgCl2, pH 6,9) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (tabel 1).
    OPMERKING: Fixatie met PFA wordt uitgevoerd in een gecertificeerde veiligheidskap.
  2. Was cellen driemaal gedurende 5 minuten elk met 200 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  3. Permeabiliseer cellen met de 100 μL permeabilisatiebuffer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten (tabel 1).
    OPMERKING: Ga zo snel mogelijk door met labelen om doeleiwit-, RNA- of DNA-afbraak te voorkomen en een optimaal resultaat te verkrijgen. Indien nodig kunnen vaste monsters echter gedurende een lange tijd (tot een maand) worden opgeslagen in een PBS-buffer bij 4 °C. Vervang eventuele verdampte PBS en bescherm het monster tegen fotobleaching.

3. Endogene streptavidin en biotine blokkering

  1. Incubeer cellen met de streptavidinoplossing verdund in een celblokkerende buffer (100 μL) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (tabel 1).
  2. Spoel kort af met 200 μL celblokkerende buffer.
  3. Incubeer cellen met 100 μL biotineoplossing verdund in een celblokkerende buffer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Wanneer u een zelflabelende taggingbenadering gebruikt, zoals het gebruik van SNAP- of CLIP-tags, slaat u stap 4 over en gaat u verder met stap 5.1: zelflabeling tagging aanpak.

4. Primaire antilichaamkleuring

  1. Incubeer cellen met rattenanti-α-tubuline antilichaam (1:500 verdunning) en konijn anti-clathrin zware keten antilichaam (1:100 verdunning) in 100 μL celblokkingsbuffer gedurende 16 uur bij 4 °C of 1 uur bij kamertemperatuur. Verdubbel de incubatietijd voor de weefselmonsters.
  2. Was monsters vier keer met 200 μL PBS gedurende 5 minuten elk.

5. LR-ExM specifieke secundaire antilichaamkleuring

  1. Conjugaat IgG-antilichamen met de trifunctionele linkers zoals N-hydroxysuccinimide (NHS) - methacrylamide (MA) -Biotine of NHS-MA-Digoxigenin (Dig) (Figuur 1B). Synthese van trifunctionele ankers en conjugatie van de secundaire antilichamen zijn eerder geïntroduceerd in Shi et al.1. Zelfetiketteringsbenadering: Conjugaat IgG-antilichamen met de trifunctionele linkers, zoals MA- benzylguanine (BG)-Biotine of MA- benzylcytosine (BC)-Dig (Figuur 1B). Synthese van trifunctionele ankers en een conjugatie van de secundaire antilichamen zijn eerder geïntroduceerd in Shi et al.1.
  2. Incubeer cellen met de ezel anti-konijn-Dig-MA (1:100 verdunning) en ezel anti-rat-biotine-MA (1:100 verdunning) secundaire antilichamen in 100 μL celblokkerende buffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Verdubbel deze incubatietijd voor de weefselmonsters.
  3. Was monsters vier keer in 200 μL PBS gedurende elk 5 minuten.

6. Extra verankering

  1. Incubeer cellen met 0,25% glutaaraldehyde (GA) in PBS (100 μL) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om de eiwitten op de hydrogel te verankeren. U kunt ook 25 mM methacrylzuur N-hydroxysuccinimide ester (MA-NHS) gebruiken voor verankering. Een uur incubatie bij kamertemperatuur wordt aangemoedigd.
  2. Was monsters drie keer in PBS gedurende 5 minuten elk.

7. Gelation

OPMERKING: De expansiesnelheid wordt bepaald door de diffusietijd van zout en water uit of in de gel; het gieten van dunne gels versnelt dus de expansietijd.

  1. Verwijder de bovenste structuur van de 16-well gelplaat. Voeg 40 μL monomeeroplossing toe aan elk putje om cellen op ijs te conditioneren. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten.
    1. Zie tabel 2 om een monomeeroplossing te bereiden.
  2. Bereid de gelation-oplossing op ijs. Voeg dubbel gedestilleerd water en 10% N,N,N′,N′ Tetramethyleendiamine (TEMED) versneller toe aan de monomeeroplossing (10% TEMED: monomeeroplossing = 1:47); voeg de initiator nog niet toe (tabel 3).
  3. Gebruik voor een celkweekkamer met een oppervlakte van 0,4 cm2 een volume van de gelation-oplossing van ongeveer 40 μL. Bereid 45 μL gelation-oplossing voor elke put.
  4. Voeg 10% ammoniumpersulfaat (APS) toe aan de gelatatieoplossing, incubeer op ijs en pipetteer onmiddellijk 40 μL gelation-oplossing in elke siliconenpakking op ijs. Incubeer op ijs gedurende 3 minuten (10% APS: 10% TEMED: monomeeroplossing = 1:1:47).
  5. Bescherm het monster tegen licht en verplaats het afdekglas in de petrischaal van 10 cm gedurende 1,5 uur naar een incubator van 37 °C voor gelation. Om de vochtigheid van de gel tijdens de incubatie van 37 °C te behouden, dek u de petrischaal af met het deksel en doet u een paar druppels water in de petrischaal.

8. Spijsvertering

  1. Verwijder na het leren het glas om de gel te scheiden en breng de gel over op een 6-putplaat. Verwerk ingebedde cellen met 2 ml digestiebuffer (tabel 1) 's nachts bij kamertemperatuur of 4 uur bij 37 °C. Gebruik ten minste 10 keer het overtollige volume van de digestiebuffer.
  2. Was gels met ten minste een 10-voudig overtollig volume water dan het uiteindelijke gelvolume. Herhaal de wasstap vier keer gedurende 20 tot 30 minuten. De gel breidt zich in elke dimensie ongeveer twee keer uit.
    OPMERKING: Gelmonsters kunnen maximaal 1 maand worden bewaard in een PBS-buffer bij 4 °C. Vervang verdampt water om uitdroging te voorkomen en bescherm het monster tegen licht tijdens opslag. Om degradatie van trifunctionele ankers te voorkomen, moeten monsters zo snel mogelijk na de spijsvertering en was worden gekleurd.

9. Fluorescentiekleuring na de spijsvertering

  1. Incubeer gels in 2 ml volume streptavidin (STV) / digoxigenine (DIG) kleuringsbuffer met 2 tot 5 μM STV-kleurstof en / of anti-DIG-kleurstof gedurende 24 uur bij kamertemperatuur. Bewaar de monsters in het donker.

10. Uitbreiding

  1. Was en zet de gel vier keer uit met overmatig water (2-3 ml) gedurende 30 minuten tot 1 uur per keer.
  2. Voor eenvoudigere visualisatie van cellen onder fluorescente microscopie, kleur cellen met DAPI tijdens de derde van de vijf wasbeurten. Verdunde DAPI-voorraadconcentratie (5 mg/ml, bewaard bij 4 °C) in 1:5.000 verdunningen in waswater. Incubeer de gel met een DAPI-wateroplossing (2 ml) gedurende 30 minuten tot 1 uur.
  3. Was twee keer extra met 3 ml water.
  4. Breid gels uit in elke platte schaal die groot genoeg is om de monsters te bevatten. De geëxpandeerde gels die op 0,4 cm2 gebiedsdekglas worden bereid, passen mooi in een 6-wellsplaat met glazen bodem.
    OPMERKING: Post-expansie-gekleurde monsters kunnen maximaal 4 maanden worden bewaard in een PBS-buffer bij 4 ° C. Voeg voldoende water toe om uitdroging te voorkomen en het monster te beschermen tegen fotobleaching. Herhaal de uitbreidings- en DAPI-kleuringsstap voordat u de afbeelding in beeld brengt. Om elk risico op afbraak van fluoroforen te voorkomen, moeten monsters zo snel mogelijk in beeld worden gebracht.

11. Beeldvorming

  1. Bedek de 6-well glazen bodembeeldvormingskamer met 0,01% poly-L-lysine (elk 3 ml) om de gelmonsters te immobiliseren.
  2. Breng gelmonsters over naar de gecoate beeldkamer.
  3. Breng de monsters in beeld met de gewenste fluorescentiescopen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Clathrin-coated pits (CCP's) zijn immunostained met behulp van trifunctionele ankers (figuur 1B) en LR-ExM wordt uitgevoerd zoals beschreven in figuur 1A. LR-ExM (figuur 2C,E) vertoont een veel hogere fluorescentie-intensiteit in vergelijking met de eiwitretentie-expansiemicroscopie (proExM, figuur 2A) of biotine-ExM (figuur 2B); het signaal voor LR-ExM was...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De belangrijkste innovatie van LR-ExM is het gebruik van trifunctionele ankers om de doeleiwitten effectief te labelen en de beeldkwaliteit te verbeteren. Deze methode wordt beperkt door trifunctionele ankers, die niet zo gemakkelijk beschikbaar zijn voor onderzoekers. Trifunctionele ankers kunnen echter op verzoek worden gedeeld met andere onderzoekers en vergelijkbare producten zoals ExM-sondes van Chrometa zijn nu ook in de handel verkrijgbaar.

In dit protocol is 1 uur incubatie bij kamerte...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health (R00 GM126136 tot X.S.), de Amerikaanse National Science Foundation (DMS1763272 tot S.P.) en de Simons Foundation (594598 tot S.P.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Acrylamide Sigma A9099 ExM Gel
AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearchH+L, 711–005-152Antibody
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgGJackson ImmunoResearchH+L, 712–005-153Antibody
Alexa Fluor 488-StreptavidinJackson ImmunoResearch016-540-084Fluorescent probes 
Alexa Fluor 594 StreptavidinJackson ImmunoResearch016-580-084Fluorescent probes 
Alexa Fluor 647 StreptavidinJackson ImmunoResearch016-600-084Fluorescent probes 
Ammonium Persulfate Sigma A3678 ExM Gel
anti-H3K4me3Abcamab8580Antibody
anti-H3K9me3Abcamab176916Antibody
DAPI dilacetateThermofisher ScientificD3571Fluorescent probes 
DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)Vector LaboratoriesDI-7488Fluorescent probes 
DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)Vector LaboratoriesDI-7594Fluorescent probes 
EGTAEMD Millipore Corp.324626-25GMFixatie buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma EDTADigestie buffer
Glutaraldehyde 10% EM GradeElectron Microscopy Sciences50-262-13Anchoring
Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglassGrace Bio-Labs GBL112358-8EACel cultuur kamer
Grace Bio-Labs CultureWell removal toolGrace Bio-Labs GBL103259Verwijder gereedschap
Guanidine HCl Sigma G3272 Digestie buffer
Magnesium chlorideSigmaM8266-1KGFixatie buffer
McCoy's 5aATCC30–2007Cel cultuur medium
Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98%  (MA-NHS)Sigma 730300-1GAnchoring
monoclonal mouse anti-Nup153 antibodyAbcamab24700Antibody
N,N′Methylenebisacrylamide Sigma M7279 ExM Gel
N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma T7024 ExM Gel
16% Paraformaldehyde Aqueous SolutionsElectron Microscopy Sciences50-980-487Fixatie buffer
PIPESSigmaP6757-25GFixatie buffer
Poly-L-LysineSigmaP8920-100MLKamer coating
Proteinase K Sigma-AldrichP4850-5MLDigestie buffer
Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibodyAbcamab21679Antibody
rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2Millipore SigmaMAB1864-IAntibody
Sodium Acrylate Sigma408220ExM Gel
Streptavidin / Biotin blocking kitVector LaboratoriesSP-2002Blocking buffer
Tris-HCl Life Technologies AM9855 Digestie buffer
U2OSATCCHTB-96Cel lijn
6 well glass bottom platesCellvisP06-1.5H-NBeeldplateau

Referenties

  1. Shi, X., et al. Label-retention expansion microscopy. The Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067(2021).
  2. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  3. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
  4. Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
  5. Wang, Y., et al. Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes. Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).
  6. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  7. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  8. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  9. Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).
  10. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  11. Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (19), 45836(2018).
  12. Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, 73775(2021).
  13. M'Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fluorescentie labelingtrifunctionele ankersimmunofluorescentie labelingprote ne tagginghydrogel embeddingclathrine gecoate pitshoge labeling effici ntie

Gerelateerde artikelen