Methodenartikel

Evaluatie van fotosynthetische efficiëntie in fotorespiratoire mutanten door chlorofylfluorescentieanalyse

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63801

⸱

9 december 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Louisiana State University, 2Department of Plant Pathology and Crop Physiology, Louisiana State University AgCenter

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een benadering om veranderingen in fotosynthetische efficiëntie in planten te meten na behandeling met lage CO2 met behulp van chlorofylfluorescentie.

Samenvatting

Fotosynthese en fotorespiratie vertegenwoordigen de grootste koolstoffluxen in het primaire metabolisme van planten en zijn noodzakelijk voor het overleven van planten. Veel van de enzymen en genen die belangrijk zijn voor fotosynthese en fotorespiratie zijn al tientallen jaren goed bestudeerd, maar sommige aspecten van deze biochemische routes en hun kruisverwijzing met verschillende subcellulaire processen zijn nog niet volledig begrepen. Veel van het werk dat de genen en eiwitten heeft geïdentificeerd die belangrijk zijn in het plantenmetabolisme, is uitgevoerd in sterk gecontroleerde omgevingen die mogelijk niet het beste weergeven hoe fotosynthese en fotorespiratie functioneren onder natuurlijke en landbouwomgevingen. Gezien het feit dat abiotische stress resulteert in verminderde fotosynthetische efficiëntie, is de ontwikkeling van een high-throughput scherm dat zowel abiotische stress als de impact ervan op fotosynthese kan monitoren noodzakelijk.

Daarom hebben we een relatief snelle methode ontwikkeld om te screenen op abiotische stress-geïnduceerde veranderingen in fotosynthetische efficiëntie die niet-gekarakteriseerde genen met rollen in fotorespiratie kunnen identificeren met behulp van chlorofylfluorescentieanalyse en lage CO2-screening . Dit artikel beschrijft een methode om veranderingen in fotosynthetische efficiëntie in overgedragen DNA (T-DNA) knock-out mutanten in Arabidopsis thaliana te bestuderen. Dezelfde methode kan worden gebruikt voor het screenen van door ethylmethaansulfonaat (EMS) geïnduceerde mutanten of suppressorscreening. Het gebruik van deze methode kan genkandidaten identificeren voor verder onderzoek in het primaire metabolisme van planten en abiotische stressreacties. Gegevens van deze methode kunnen inzicht geven in de genfunctie die mogelijk niet wordt herkend tot blootstelling aan verhoogde stressomgevingen.

Inleiding

Abiotische stressomstandigheden die vaak worden gezien op de velden van boeren kunnen de gewasopbrengsten negatief beïnvloeden door de fotosynthetische efficiëntie te verminderen. Schadelijke omgevingsomstandigheden zoals hittegolven, klimaatverandering, droogte en zoutgehalte van de bodem kunnen abiotische stress veroorzaken die de beschikbaarheid van CO2 verandert en de reactie van een plant op hoge lichtstress vermindert. De twee grootste terrestrische koolstoffluxen zijn fotosynthese en fotorespiratie, die essentieel zijn voor plantengroei en gewasopbrengsten. Veel van de belangrijke eiwitten en enzymen die betrokken zijn bij deze processen zijn gekarakteriseerd onder laboratoriumomstandigheden en geïdentificeerd op genetisch niveau1. Hoewel er veel vooruitgang is geboekt bij het begrijpen van fotosynthese en fotorespiratie, blijven veel stappen, waaronder transport tussen plantenorganellen, onkarakteristiek 2,3.

Fotorespiratie, de op een na grootste koolstofflux in planten na fotosynthese, begint wanneer het enzym Rubisco zuurstof in plaats van koolstofdioxide fixeert op ribulose 1,5 bisfosfaat (RuBP), waardoor de remmende verbinding 2-fosfoglycolaat (2PG)1 wordt gegenereerd. Om de remmende effecten van 2PG te minimaliseren en de voorheen vaste koolstof te recyclen, hebben C3-planten het multi-organellaire proces van fotorespiratie ontwikkeld. Fotorespiratie zet twee moleculen van 2PG om in één molecuul 3-fosfoglyceraat (3PGA), dat opnieuw in de C3-koolstoffixatiecyclus kan komen1. Fotorespiratie converteert dus slechts 75% van de eerder vaste koolstof van de generatie van 2PG en verbruikt ATP in het proces. Als gevolg hiervan is het proces van fotorespiratie een aanzienlijke weerstand van 10% -50% op het fotosynthetische proces, afhankelijk van de beschikbaarheid van water en de temperaturen van het groeiseizoen4.

De enzymen die betrokken zijn bij fotorespiratie zijn al tientallen jaren een onderzoeksgebied, maar slechts een klein aantal transporteiwitten is op genetisch niveau gekarakteriseerd, hoewel er ten minste 25 transportstappen betrokken zijn bij het proces 5,6,7. De twee transporteiwitten die direct betrokken zijn bij de beweging van koolstof die wordt gegenereerd in het fotorespiratieproces zijn de plastadische glycolaat/glyceraattransporter PLGG1 en de galzuurnatriumsymporter BASS6, die beide betrokken zijn bij de export van glycolaat uit de chloroplast 5,6.

Onder omgevingstemperatuur [CO2] fixeert Rubisco ongeveer 20% van de tijd een zuurstofmolecuul aan RuBP1. Wanneer planten worden blootgesteld aan lage [CO2], nemen de fotorespiratiesnelheden toe, waardoor lage [CO2] een ideale omgeving is om te testen op mutanten die belangrijk kunnen zijn onder verhoogde fotorespiratiestress. Het testen van aanvullende vermeende chloroplast transport eiwit T-DNA lijnen onder lage CO2 gedurende 24 uur en het meten van veranderingen in chlorofyl fluorescentie leidde tot de identificatie van bass6-1 plantenlijnen die een fotorespiratie mutant fenotype5 aantoonden. Verdere karakterisering toonde aan dat BASS6 een glycolaattransporter is in het binnenmembraan van de chloroplast.

Dit artikel beschrijft in detail een protocol dat vergelijkbaar is met wat aanvankelijk werd gebruikt om BASS6 te identificeren als een fotorespiratietransporter, die afkomstig was van een lijst met vermeende transporteiwitten in het chloroplastmembraan8 Dit protocol kan worden gebruikt in een high-throughput experiment dat Arabidopsis T-DNA-mutanten of EMS-gegenereerde mutante planten karakteriseert als een manier om genen te identificeren die belangrijk zijn voor het handhaven van fotosynthetische efficiëntie onder een reeks abiotische stress zoals hitte, hoge lichtstress, droogte en CO2-beschikbaarheid . Het screenen van plantenmutanten met behulp van chlorofylfluorescentie is in het verleden gebruikt om snel genen te identificeren die belangrijk zijn voor het primaire metabolisme9. Met maar liefst 30% van het Arabidopsis-genoom dat genen bevat die coderen voor eiwitten met een onbekende of slecht gekarakteriseerde functie, zou stress-geïnduceerde analyse van fotosynthetische efficiëntie inzicht kunnen geven in moleculaire functies die niet onder gecontroleerde omstandigheden in mutante planten worden waargenomen10. Het doel van deze methode is om mutanten van de fotorespiratoire route te identificeren met behulp van een lage CO2-screening . We presenteren een methode om mutanten te identificeren die de fotorespiratie verstoren na blootstelling aan lage CO2. Een voordeel van deze methode is dat het een high-throughput screening is voor zaailingen die in een relatief korte tijd kan worden gedaan. De secties van het videoprotocol geven details over zaadvoorbereiding en sterilisatie, plantengroei en lage CO2-behandeling , de configuratie van het fluorescentiebeeldvormingssysteem, de meting van de kwantumopbrengst van de behandelde monsters, representatieve resultaten en conclusies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Zaadbereiding en sterilisatie

OPMERKING: Zaadbereiding bestaat uit zaadindrinking en zaadsterilisatie. Het is belangrijk op te merken dat al deze stappen moeten worden uitgevoerd in een laminaire stromingskap om steriele omstandigheden te behouden. Alle benodigde materialen, reagentia en groeimedia moeten worden geautoclaveerd (zie de tabel met materialen).

  1. Zaadimbibatie en stratificatie
    OPMERKING: De gebruikte zaadlijnen zijn plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) en wild type (WT, Col-0).
    1. Doseer de zaden in 1,5 ml microcentrifugebuizen. Neem de zaden in steriel water in een laminaire stromingskap en stratificeer bij 4 °C in het donker gedurende 2 dagen.
  2. Zaadsterilisatie
    1. Bereid onder steriele omstandigheden 10 ml 50% (v/v) bleekoplossing en voeg ongeveer 20 μL Tween 20 toe. Voor zaadsterilisatie, verwijder water uit de ingebakken zaden, voeg 1 ml bleekoplossing toe aan de microcentrifugebuizen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    2. Verwijder de bleekoplossing met een pipet.
    3. Spoel de zaden af in 1 ml steriel water om te resuspenderen. Verwijder het water zodra de zaden op de bodem zijn neergedaald. Herhaal stap 1.6 en stap 1.7 zeven keer.
    4. Resuspendeer de zaden in steriele 0,1% agarose oplossing.
  3. Zaadplating
    1. Maak een 1 L volume van Murashige & Skoog Basal Medium met vitamines en 1,0 g / L van 2-(N-morphonio) ethaansulfonzuur (MS) door 5,43 g van het poeder toe te voegen aan 500 ml gedestilleerd water. Pas de pH aan tussen 5,6 en 5,8 met kaliumhydroxide (KOH). Vul tot 1 L met gedestilleerd water.
      1. Splits de vloeibare oplossing in 500 ml en plaats elke helft in een kolf van 1 l met een magnetische roerstaaf. Voeg 5 g agarpoeder toe om voor elke kolf een 1% agar w/v-oplossing te verkrijgen.
      2. Autoclaaf bij 121 °C en 15 psi gedurende 30 minuten; plaats vervolgens op kamertemperatuur terwijl je langzaam roert. Giet bij het afkoelen 25 ml MS-agar in een vierkante petrischaal. Laat het stollen.
        OPMERKING: Deze Murashige &Skoog Basal Medium platen bevatten 1% MS medium met vitamines en 1% agar voor de teelt van de testmutanten.
    2. Snijd een pipetpunt van 200 μL met een scheermesje. Plaats één zaadje in het midden van het aangewezen vierkante raster voor elke testmutant of genotype (1 cm2 vierkant) van een vierkante MS-plaat (figuur 1) met behulp van een micropipette van 200 μL.
      OPMERKING: Het vierkante raster van 1 cm x 1 cm helpt om een uniforme afstand tussen de zaailingen te houden en overlapping te voorkomen, wat belangrijk zal zijn bij latere fluorescentiebeeldvorming en -analyse.
    3. Zodra de zaden zijn verguld, wikkelt u met chirurgische tape rond het deksel om af te sluiten en plaatst u het in de groeikamer in omstandigheden zoals hieronder beschreven.

2. Plantengroei en co2-arme behandeling

  1. Laat de planten 7-9 dagen groeien bij 20 °C onder een lichtcyclus van 8 uur van 120 μmol·m−2s−1 en 16 uur duisternis bij 18 °C. Controleer de planten op de 6e dag om te bepalen of ze groot genoeg zijn voor beeldvorming. Stel de planten op de 8e dag na de beplating bloot aan een laag CO2-gehalte.
  2. Co2-arme behandeling
    1. Plaats na de 7-9 dagen vier van de acht platen uit de omgevingsgroeikamercondities in fotorespiratoire omstandigheden van 20 °C, continue lichtniveaus van 200 μmol·m−2s−1 en lage CO2 gedurende 12 uur.
    2. Construeer de CO2-lage toestand met behulp van een luchtdichte transparante container met 100 g natronkalk op de bodem van de container. Plaats de container in dezelfde groeikamer als de controle. Houd de controle-installatiesgedurende 12 uur onder 120 μmol·m−2s−1 in omgevings-CO 2.

3. Het fluorescentiebeeldvormingssysteem configureren

  1. Plaats een testplaat (voorbereid volgens sectie 1 en sectie 2) gecentreerd onder de camera op een vaste afstand in het fluorescentiebeeldvormingssysteem.
  2. Navigeer in de software van het instrument naar het Live Window en vink het vakje Knipperen aan om niet-actinische meetflitsen in te schakelen.
  3. Klik op de gereedschappen Zoomen en Scherpstellen totdat een volledig en scherp beeld zichtbaar is. Gebruik hiervoor een podium of een plank om de afstand tussen de planten en de camera aan te passen. Houd de zoom, focus en afstand tot de camera constant gedurende het hele experiment.
  4. Stel de waarde van El. Shutter in op 0 en pas de gevoeligheid aan om een fluorescerend signaal te krijgen in het bereik van 200-500 digitale eenheden.
    OPMERKING: Een lagere El. Sluiterwaarde (0-1) zorgt ervoor dat de meetflitsen niet-actinisch zijn, terwijl een hogere waarde (2) de resolutie van de afbeelding zal verbeteren.
  5. Plaats een lichtmeter in dezelfde positie als waarmee de camera-instellingen worden aangepast.
  6. Schakel in het livevenster het selectievakje Super in om een verzadigingspuls van 800 ms te starten. Vergeet niet om het vakje elke keer aan te vinken voor een nieuwe puls.
  7. Gebruik de schuifregelaar om het percentage relatief vermogen voor de superpuls aan te passen totdat de lichtmeter 6.000-8.000 μmol·m−2s−1 aangeeft.

4. Ontwerp het kwantumopbrengstprogramma

  1. Importeer standaardbesturingssysteem voor het imagingsysteem.
    Standaard.inc opnemen
    Inclusief light.inc
    OPMERKING: De syntaxis van het programma die in dit experiment ter referentie wordt gebruikt, is voor een FluorCam-beeldvormingssysteem.
  2. Definieer de volgende globale variabelen op basis van de geconfigureerde lichtinstellingen:
    Sluiter = 0
    Gevoeligheid = 40
    Super = 65
  3. Neem de tijdstap op voor het vastleggen van gegevens:
    TS = 20 ms
  4. Verzamel de Fo-meting door fluorescentie te bemonsteren in een aan het donker aangepaste toestand.
    F0duration = 2s;
    F0period = 200ms;
    OPMERKING: F0duration definieert het tijdsbereik waarover de aan het donker aangepaste fluorescentie wordt geregistreerd. F0period definieert het tijdsinterval waarover de donker-aangepaste fluorescentiemeting wordt herhaald.
  5. Noteer de Fo-metingen in gegevenstabellen.
    <0,F0periode.. F0duration>=>mfmsub
    <0s>->checkpoint,"startFo"
    =>checkpoint,"endFo";
    Indien < , vertegenwoordigt > de reeks fluorescentiewaarden die door de tijd zijn geïndexeerd; => slaat metingen op in een systeembestand; mfmsub vertegenwoordigt de volledige dataset voor het experiment; en checkpoint maakt een subset voor gegevens van specifieke metingen zoals startFo.
  6. Verzamel en bewaar de Fm-meting door fluorescentie te bemonsteren na een verzadigde puls.
    PulseDuration = 960ms; ##
    a1 = F0duration + 40ms
    a2 = a1 + 480 ms;
    = >SatPulse (PulseDuration);
    = >mfmsub
    = >mfmsub;
    =>checkpoint,"startFm"
    = >checkpoint,"endFm"
    =>checkpoint,"timeVisual";
    Wanneer a1 en a2 variabelen zijn om de bemonsteringstijd te coördineren met de verzadigingspuls; a1 staat voor de begintijd van de Fm-meting; en a2 vertegenwoordigt de middelste tijd van de puls.

5. Meten van de kwantumopbrengst van de behandelde monsters

  1. Direct na de behandeling bedek de platen met aluminiumfolie gedurende 15 minuten voor donkere aanpassing. Verwijder de folie om de kwantumopbrengst van fotosysteem II te meten met een pulsamplitude-gemodificeerde fluorometer. Plaats vervolgens de zaailingplaat direct onder de camera en voer het kwantumopbrengstprotocol uit dat te vinden is in de GitHub-repository.
  2. Download het quantum_yield protocol van GitHub (https://github.com/South-lab/fluorescent-screen) of gebruik een vergelijkbaar ontworpen programma uit sectie 4. Gebruik de software van de fluorometer om het programmabestand te openen door op het mappictogram te klikken en naar de bestandslocatie te navigeren.
  3. Voer het kwantumopbrengstprogramma uit door op het rode bliksempictogram te klikken.
  4. Nadat het protocol is voltooid, navigeert u naar het preanalysevenster . Verdeel de plaat in afzonderlijke zaailingen met behulp van de selectiegereedschappen om alle pixels voor elke zaailing op de plaatafbeelding te markeren. Klik op Achtergronduitsluiting om gemarkeerde achtergrondpixels te verwijderen, zodat alleen het zaailinggebied overblijft.
  5. Klik op Analyseren om fluorescentiegegevens te genereren voor elke zaailing op de plaatafbeelding. Pas het fluorescentiewaardebereik handmatig aan om consistente minimum- en maximumwaarden tussen alle platen weer te geven.
  6. Klik op Numeriek-gemiddelde in het tabblad Experiment | | exporteren Numeriek. Selecteer Alle gegevens en per kolom en klik op OK om een tekstbestand met QY-metingen voor elke zaailing te genereren.

6. Het gegevensbestand openen

  1. Open het tekstbestand in een spreadsheet voor analyse. Van de koppen met het gebiedsnummer, de grootte van pixels, Fm, Ft, Fq en QY, identificeert u het gebiedsnummer voor het kerngenotype (WT of testmutant) en QYmax. Voer een paarsgewijze t-test uit met betrekking tot wildtype om significantie te bepalen. Gegevens worden geïnterpreteerd als significant verschillend wanneer p-waarden lager zijn dan 0,05.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De resultaten tonen plaatbeelden van ruwe en fluorescentiebeelden van omgevings- en CO2-screening van WT- en testmutanten. Elke plantlet wordt gelabeld op gebiedsnummer, met overeenkomstige fluorescentiemetingen gegeven als QY. De gegevens worden geëxporteerd als een tekstbestand en kunnen worden geopend in een spreadsheet voor analyse (zie Aanvullende tabel S1). Mutantenlijnen plgg1-1 en abcb26 werden geselecteerd om de positieve en negatieve identificatie van genen geassoci...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De experimentele methoden die in dit artikel worden beschreven, hebben enkele voordelen en beperkingen. Een voordeel is dat deze methode veel plantenzaailingen kan screenen, hoewel enkele voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om besmetting van de plantmediaplaat tijdens het beplatings- en groeiproces te voorkomen. Daarom is het van cruciaal belang om de Arabidopsis-platen af te dichten met chirurgische tape. Een ander voordeel van dit experiment is dat het een kortere fotorespiratoire stressperiode van 12 uur heeft ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door de Louisiana Board of Regents (AWD-AM210544).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL microcentrifuge tubeVWR10810-070container voor zaadsterilisatie
agaroseVWR9012-36-6chemisch middel gebruikt om zaden op te schorsen voor eenvoudig beplaten
Arabidopsis thaliana zaden (abcb26)ABRC, besteld via TAIR www.arabidopsis.orgSALK_085232Arabidopsis-zaden gebruikt als experimentele groep
Arabidopsis thaliana zaden (plgg1-1)ABRC, besteld via TAIR www.arabidopsis.orgSALK_053469Couder Arabidopsis-zaden 
Arabidopsis thaliana zaden (WT)ABRC, besteld via TAIR www.arabidopsis.orgCol-0Arabidopsis wild type zaden gebruikt als controlegroep
 bleach cloroxgeneriek bleekmiddel chemisch middel gebruikt om zaden te steriliseren
Carbolime absorberMedline productsS232-104-001CO2 absorber
Gesloten FluorCamPhoton Systems InstrumentsFC 800-CFluorescentiebeeldvormer
FluoroCam FC 800-CPhoton Systems InstrumentsGesloten FluorCam FC 800-C/1010-SFluorescentiebeeldvormer
FluoroCam7Photon Systems InstrumentsGesloten FluorCam FC 800-C/1010-SFluorescentiebeeldanalysesoftware
Gelzan (plantenagar)Phytotech labs71010-52-1chemisch middel gebruikt om MS-media als platen te verstevigen 
glaskolf 1 LFisherbrandFB5011000container voor het maken en autoclaven van MS-media
groeikamercaron7317-50-2groeikamer gebruikt om planten te kweken
Murashige & Skoog basaal medium met vitaminen & 1,0 g/L MES (MS)Phytotech labsM5531 groeimedium voor Arabidopsis-zaailingen 
kaliumhydroxide (KOH)Phytotech labs1310-58-3maak als 1 M oplossing voor pH-aanpassing
spider lightsMean Well EnterprisesXLG-100-H-ABlichten gebruikt in de lichttest 
Vierkante petrischaal met raster, sterielSimport ScientificD21016gebruikt om MS-media voor Arabidopsis-zaailingen vast te houden
chirurgisch pleister3M1530-1tape gebruikt om platen te verzegelen
tween 20biorad 9005-64-5oppervlakteactieve stof gebruikt om zaadsterilisatie te ondersteunen

Referenties

  1. Peterhansel, C., et al. Photorespiration. Arabidopsis Book. 8, 0130(2010).
  2. Bordych, C., Eisenhut, M., Pick, T. R., Kuelahoglu, C., Weber, A. P. Co-expression analysis as tool for the discovery of transport proteins in photorespiration. Plant Biology. 15 (4), 686-693 (2013).
  3. Eisenhut, M., Pick, T. R., Bordych, C., Weber, A. P. Towards closing the remaining gaps in photorespiration--the essential but unexplored role of transport proteins. Plant Biology. 15 (4), 676-685 (2013).
  4. Walker, B. J., VanLoocke, A., Bernacchi, C. J., Ort, D. R. The costs of photorespiration to food production now and in the future. Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 107-129 (2016).
  5. South, P. F., et al. Bile acid sodium symporter BASS6 can transport glycolate and is involved in photorespiratory metabolism in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 29 (4), 808-823 (2017).
  6. Pick, T. R., et al. PLGG1, a plastidic glycolate glycerate transporter, is required for photorespiration and defines a unique class of metabolite transporters. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 110 (8), 3185-3190 (2013).
  7. Kuhnert, F., Schlüter, U., Linka, N., Eisenhut, M. Transport proteins enabling plant photorespiratory metabolism. Plants. 10 (5), 880(2021).
  8. Badger, M. R., Fallahi, H., Kaines, S., Takahashi, S. Chlorophyll fluorescence screening of Arabidopsis thaliana for CO2 sensitive photorespiration and photoinhibition mutants. Funct Plant Biology. 36 (11), 867-873 (2009).
  9. Ogawa, T., Sonoike, K. Screening of mutants using chlorophyll fluorescence. Journal of Plant Research. 134 (4), 653-664 (2021).
  10. Kleffmann, T., et al. The Arabidopsis thaliana chloroplast proteome reveals pathway abundance and novel protein functions. Current Biology. 14 (5), 354-362 (2004).
  11. Hempel, J. J. Molecular characterization of the plastid-localized ABC protein TAP1 in Arabidopsis thaliana. , University of Stavanger. Ph.D. thesis (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Low CO2 screeningArabidopsis thalianakwantumopbrengsthigh throughput screeningabiotische stressresponsbeeldvorming van zaailingenPulse Amplitude Fluorometer

Gerelateerde artikelen