Dit protocol beschrijft methoden voor het doorsnijden, kleuren en afbeelden van vrij zwevende weefselsecties van de muizenhersenen, gevolgd door een gedetailleerde beschrijving van de analyse van het astrocytengebiedvolume en astrocytengebied overlap of tegels.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Analyse van astrocytengebiedvolume en tegels in dikke vrij zwevende weefselsecties
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Astrocyten bezitten een verbazingwekkende mate van morfologische complexiteit die hen in staat stelt om te interageren met bijna elk type cel en structuur in de hersenen. Door deze interacties reguleren astrocyten actief veel kritieke hersenfuncties, waaronder synapsvorming, neurotransmissie en ionhomeostase. In de hersenen van knaagdieren groeien astrocyten in grootte en complexiteit tijdens de eerste drie postnatale weken en vestigen ze verschillende, niet-overlappende gebieden om de hersenen te betegelen. Dit protocol biedt een gevestigde methode voor het analyseren van astrocytengebiedvolume en astrocytentetettegels met behulp van vrij zwevende weefselsecties uit het muizenbrein. Ten eerste beschrijft dit protocol de stappen voor weefselverzameling, cryosectie en immunostaining van vrij zwevende weefselsecties. Ten tweede beschrijft dit protocol beeldacquisitie en analyse van astrocytengebiedvolume en territoriumoverlappingsvolume, met behulp van commercieel beschikbare beeldanalysesoftware. Ten slotte bespreekt dit manuscript de voordelen, belangrijke overwegingen, veelvoorkomende valkuilen en beperkingen van deze methoden. Dit protocol vereist hersenweefsel met schaarse of mozaïek fluorescerende labeling van astrocyten en is ontworpen om te worden gebruikt met gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur, confocale microscopie en in de handel verkrijgbare beeldanalysesoftware.
Inleiding
Astrocyten zijn uitgebreid vertakte cellen die veel belangrijke functies in de hersenen vervullen1. In de cortex van de muis geven radiale gliastamcellen aanleiding tot astrocyten tijdens de late embryonale en vroege postnatale stadia2. Tijdens de eerste drie postnatale weken groeien astrocyten in omvang en complexiteit en ontwikkelen ze duizenden fijne takken die rechtstreeks interageren met synapsen1. Tegelijkertijd interageren astrocyten met naburige astrocyten om discrete, niet-overlappende gebieden vast te stellen om de hersenen te betegelen3, terwijl de communicatie <....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle muizen werden gebruikt in overeenstemming met de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill en de afdeling Vergelijkende Geneeskunde (IACUC-protocolnummer 21-116.0). Muizen van beide geslachten op postnatale dag 21 (P21) werden gebruikt voor deze experimenten. CD1-muizen werden commercieel verkregen (Tabel van materialen) en MADM9 WT: WT- en MADM9 WT: KO-muizen werden eerder beschreven9.
OPMERKING: Dit protocol vereist hersenen met fluorescerende eiwitexpressie in een schaarse populatie van astrocyten. Fluorescerende eiwitexpressie k....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 geeft een schematisch overzicht van de belangrijkste stappen en workflow voor dit protocol. Figuur 2 toont screenshots van belangrijke stappen met behulp van de beeldanalysesoftware om een oppervlak te genereren, vlekken dicht bij het oppervlak te genereren en een bolle romp te genereren. Figuur 3 toont de toepassing van deze techniek om de overlap/tegels van astrocytengebied te bepalen. In figuur 4
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft een gevestigde methode voor het analyseren van het astrocytengebiedvolume en astrocytentegels in de cortex van de muis, waarbij alle belangrijke stappen worden beschreven, beginnend met perfusie en eindigend met beeldanalyse. Dit protocol vereist hersenen van muizen die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in een schaarse of mozaïekpopulatie van astrocyten. Buiten deze vereiste kunnen muizen van elke leeftijd voor dit protocol worden gebruikt, met slechts kleine aanpassingen aan de perfus.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Microscopie werd uitgevoerd in de UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID: SCR_019060), gedeeltelijk ondersteund door financiering van de NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 en de NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com. De afbeeldingen en gegevens in figuur 4 zijn met toestemming van de uitgever overgenomen uit een eerdere publicatie9 .
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl tot pH 7.4, dH2O tot 1 L; bewaar op kamertemperatuur (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; bewaar op RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28,2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; bewaar bij 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS tot 50 mL; bewaar bij 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O tot 1 L; bewaar bij 4 °C | ||
| Avertin | 0,3125 g tri-bromoethanol, 0,625 mL methylbutanol, dH2O tot 25 mL; bewaar bij 4 °C; weggooien 2 weken na bereiding | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% geitenserum in TBST; bewaar bij 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympus | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; bewaar op kamertemperatuur | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Versie 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | Van Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mounting medium | 20 mM Tris pH 8.0, 90% Glycerol, 0,5% N-propyl gallate; bewaar bij 4 °C; goed voor maximaal 2 maanden | ||
| Nail polish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specifiek voor microscoop/objectief |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimale snelheid: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | Van Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5,75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; bewaar op kamertemperatuur | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0,2% Triton in 1x TBS; bewaar op kamertemperatuur | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension als aanvulling |
Referenties
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-233 (2020).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
