Het demonstreren van harige en glabreuze huid innervatie in een 3D-patroon met behulp van meerdere fluorescerende kleuring en weefselzuiveringsbenaderingen

Samenvatting

De dikte van weefselsecties beperkte de morfologische studie van de huidinternervatie. Het huidige protocol beschrijft een unieke weefselzuiveringstechniek om cutane zenuwvezels te visualiseren in dikke weefselsecties van 300 μm onder confocale microscopie.

Samenvatting

Huid innervatie is een belangrijk onderdeel van het perifere zenuwstelsel. Hoewel de studie van de huidzenuwvezels snel is gevorderd, komt het grootste deel van het begrip van hun distributieve en chemische kenmerken van conventionele histochemische en immunohistochemische kleuring op dunne weefselsecties. Met de ontwikkeling van de weefselzuiveringstechniek is het mogelijk geworden om de huidzenuwvezels op dikkere weefselsecties te bekijken. Het huidige protocol beschrijft meerdere fluorescerende kleuringen op weefselsecties met een dikte van 300 μm van de plantaire en dorsale huid van de achtervoet van ratten, de twee typische harige en glabreuze huidplaatsen. Hier labelt het calcitonine-gen-gerelateerde peptide de sensorische zenuwvezels, terwijl falloïdine en lymfevat endotheliale hyaluronaatreceptor 1 respectievelijk de bloed- en lymfevaten labelen. Onder een confocale microscoop werden de gelabelde sensorische zenuwvezels volledig op langere afstand gevolgd, lopend in bundels in de diepe cutane laag en freestyle in de oppervlakkige laag. Deze zenuwvezels liepen parallel aan of omringden de bloedvaten en lymfevaten vormden een driedimensionaal (3D) netwerk in de harige en glazige huid. Het huidige protocol biedt een effectievere benadering voor het bestuderen van de innervatie van de huid dan de bestaande conventionele methoden vanuit het methodologische perspectief.

Inleiding

De huid, het grootste orgaan in het lichaam, dat dient als een belangrijke interface naar de omgeving, wordt dicht geïnnerveerd door vele zenuwvezels ^1,2,3. Hoewel de innervatie van de huid eerder op grote schaal is bestudeerd met verschillende histologische methoden, zoals kleuring op de huid- en weefselsecties ^4,5,6, is de gedetailleerde effectieve demonstratie van huidzenuwvezels nog steeds een uitdaging ^7,8. Daarom ontwikkelde het huidige protocol een unieke techniek om cutane zenuwvezels duidelijker te vertonen in het dikke weefselgedeelte.

Vanwege de limiet door de dikte van secties, is de observatie van geïnnerveerde huidzenuwvezels niet nauwkeurig genoeg om de relatie tussen calcitonine gen-gerelateerde peptide (CGRP) zenuwvezels en lokale weefsels en organen nauwkeurig weer te geven uit de verkregen beeldinformatie. De opkomst van 3D-weefselopruimingstechnologie biedt een haalbare methode om dit probleem op te lossen ^9,10. De snelle ontwikkeling van weefselzuiveringsbenaderingen heeft de afgelopen tijd veel hulpmiddelen geboden voor het bestuderen van weefselstructuren, hele organen, neuronale projecties en hele dieren¹¹. Het transparante huidweefsel kan in een veel dikker gedeelte worden afgebeeld door confocale microscopie om de gegevens te verkrijgen om huidzenuwvezels te visualiseren.

In de huidige studie werd de plantaire en dorsale huid van een rat achtervoet geselecteerd als de twee doellocaties van de harige en glabreuze huid ^3,4,7. Om de huidzenuwvezels op een langere afstand te traceren, werd het huidweefsel gesneden op de dikte van 300 μm voor immunohistochemische en histochemische kleuring, gevolgd door weefselzuiveringsbehandeling. CGRP werd gebruikt om de sensorische zenuwvezels^12,13 te labelen. Om de huidzenuwvezels op de weefselachtergrond te benadrukken, werden falloïdine en lymfevat endotheliale hyaluronaatreceptor 1 (LYVE1) verder gebruikt om de bloedvaten en lymfevaten te labelen, respectievelijk^14,15.

Deze benaderingen leverden een eenvoudige methode op die kan worden toegepast om een hoge resolutiebeeld van de huidzenuwvezels te demonstreren en ook om de ruimtelijke correlatie tussen de zenuwvezels, bloedvaten en lymfevaten in de huid te visualiseren, wat veel meer informatie kan opleveren om de homeostase van de normale huid en de cutane verandering onder de pathologische omstandigheden te begrijpen.

Protocol

De huidige studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Instituut voor Acupunctuur en Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (referentienummer D2018-04-13-1). Alle procedures werden uitgevoerd volgens de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Drie volwassen mannelijke ratten (Sprague-Dawley, gewicht 230 ± 15 g) werden gebruikt in deze studie. Alle dieren werden gehuisvest in een 12 uur licht/donker cyclus met gecontroleerde temperatuur en vochtigheid en vrije toegang tot voedsel en water.

1. Perfusie en monstervoorbereiding

1. Injecteer 250 mg/kg tribroomethanoloplossing (zie materiaaltabel) intraperitoneaal in de rat om euthanasie te induceren.
2. Zodra de ademhaling stopt, gebruikt u een roestvrijstalen chirurgische schaar om de thoracale holte van de rat te openen. Gebruik naalden van 20 G om te perfuseren via de linker hartkamer¹³ met een snelheid van 3 ml /min met 100 ml van 0,9% normale zoutoplossing gevolgd door 250-300 ml 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PB, pH 7,4) (figuur 1A, B).
3. Gebruik na perfusie een scalpel om de huid van de dorsum en zool van de achterpoot te verwijderen.
   1. Voor de monsters die een bevroren sectie nodig hebben, moet u de weefsels na 2 uur fixeren in 4% paraformaldehyde in 0,1 M PB; vervolgens cryoprotectie de weefsels in 25% sucrose in 0,1 M PB gedurende meer dan 24 uur bij 4 °C
   2. Voor de monsters met het dikke gedeelte dat weefselreiniging vereist, fixeren de weefsels na 4% paraformaldehyde in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (1x PBS) gedurende 2 uur; cryoprotecteer vervolgens de weefsels in 1x PBS bij 4 °C (figuur 1C-E).

2. Drievoudig fluorescerende kleuring met CGRP, falloidine en LYVE1 gevolgd door weefselzuiveringsbehandeling

OPMERKING: Drievoudig fluorescerende kleuring met CGRP, falloidine en LYVE1 werd aangebracht om de zenuwvezels, bloedvaten en lymfevaten in de harige en glazige huid te onthullen op weefselsecties met een dikte van 300 μm na weefselzuiveringsbehandeling.

1. Bereid 2% agarose in 1x PBS door 2 min in een micro-oven te verhitten tot de agarose oplost (zie Materiaaltabel).
2. Na het wassen, integreer de huidweefsels in 2% agarose bij 37 °C en plaats ze in de koelbox voor koeling (figuur 1F, G).
3. Bevestig het gemonteerde weefsel op de trillende microtoom met het ijswater en snijd ze op een dikte van 500 μm in de transversale richting. Gebruik de volgende parameters om de trilsnijmachine in te stellen en het snijden af te ronden: snelheid, 0,50 mm/s en amplitude, 1,5 mm (figuur 1H-K).
4. Verwijder na het snijden de agarose uit de secties en bewaar ze in een zesputtenplaat met 1x PBS (pH 7,4) (figuur 1L).
5. Incubeer de weefselsecties in een oplossing van 2% Triton X-100 in 1x PBS (TriX-PB) 's nachts bij 4 °C. Zie figuur 2 voor de volgende procedure.
6. Plaats de weefselsecties in de blokkerende buffer en draai met 72 rpm op de shaker een nacht bij 4 °C.
   OPMERKING: De blokkerende buffersamenstelling is 10% normaal ezelserum, 1% Triton-X 100 en 0,2% natriumazide in 1x PBS (zie Materiaaltabel).
7. Breng de weefselsecties over in de oplossing die de primaire antilichamen van monoklonale anti-CGRP bij muizen (1:500) en schapen polyklonaal anti-LYVE1-antilichaam (1:500) bevat in verdunningsbuffer in de microcentrifugebuis (zie Materiaaltabel) en draai gedurende 2 dagen op de shaker bij 4 °C.
   OPMERKING: De verdunningsbuffersamenstelling is 1% normaal ezelserum, 0,2% Triton-X 100 en 0,2% natriumazide in 1x PBS.
8. Was de weefselsecties twee keer met wasbuffer op kamertemperatuur en bewaar ze vervolgens een nacht op de shaker bij 4 °C in de wasbuffer.
   OPMERKING: De wasbuffersamenstelling is 0,2% Triton-X 100 in 0,1 M PB (pH 7,4).
9. Breng de volgende dag de weefselsecties over in de gemengde oplossing met de secundaire antilichamen van ezel-antimuis IgG H &L Alexa-Flour488 (1:500) en ezel-anti-schapen IgG H &L Alexa-Flour405 (1:500), evenals Alexa-Flour594 falloidin (1:1000) (zie Materiaaltafel) in een microcentrifugebuis en draai met 72 tpm op de shaker gedurende 5 uur bij 4 ° C.
10. Was de weefselsecties in een zesputtenplaat met wasbuffer gedurende 1 uur, tweemaal, bij kamertemperatuur. Bewaar de weefseldelen in de wasbuffer op de shaker een nacht bij 4 °C.
11. Breng de weefselsecties over in het weefselzuiveringsreagens (zie materiaaltabel, het volume was vijf keer meer dan het monstervolume) en draai met 60 tpm voorzichtig op de shaker gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Na deze behandeling worden de weefselsecties duidelijk (figuur 2B).
12. Monteer de opgeruimde weefsels op de dia, omcirkel de weefsels met een afstandhouder en plak de opening met vers weefselzuiveringsreagens en coverslip.

3. Drievoudige fluorescerende kleuring met CGRP, falloidine en LYVE1 volgens de conventionele aanpak

OPMERKING: Ter vergelijking: dezelfde kleuring werd uitgevoerd op weefselsecties met een dikte van 30 μm volgens conventionele technieken.

1. Snijd de weefselsecties op 30 μm op een microtoom in de transversale richting en monteer ze op de dia.
2. Voeg de blokkerende oplossing toe met 3% normaal ezelserum en 0,3% Triton X-100 in 0,1 M PB en incubeer de secties gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
3. Verwijder de blokkerende oplossing en incubeer de secties met de oplossing die de primaire antilichamen van monoklonale anti-CGRP (1:500) en schapen polyklonaal anti-LYVE1-antilichaam (1:500) bevat in verdunningsbuffer 's nachts bij 4 °C.
4. Was de volgende dag de weefselsecties met 0,1 M PB (pH 7,4) drie keer, voeg de gemengde oplossing toe die de secundaire antilichamen van ezel antimuis IgG H &L Alexa-Flour488 (1: 500) en ezel anti-schaap IgG H &L Alexa-Flour405 (1:500), evenals Alexa-Flour594 falloidine (1:1000) op de secties en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
5. Was vóór microscopische observatie de secties drie keer in 0,1 M PB (pH 7,4) en bedek ze vervolgens met coverslips in 50% glycerine.

4. Beeldvorming en analyses

1. Observeer de gekleurde monsters onder een fluorescerende microscoop en maak de beelden vervolgens met een confocale microscoop.
2. Leg 30 beelden (Z-stacks) vast, elk in frames van 10 μm, van elke 300 μm dikke sectie en integreer een enkele in-focus afbeelding met behulp van een beeldprocessor van het confocale microscopiesysteem (zie Materiaaltabel).
   1. Voer de volgende stappen uit in de beeldverwerkingssoftware van de confocale opstelling voor driedimensionale (3D)-analyse: Start Focal Plane | | van het eindpuntsvlak instellen Stapgrootte instellen | Kies dieptepatroon | | voor het vastleggen van afbeeldingen Z-serie.
      OPMERKING: De excitatie- en emissiegolflengten van blauwe fluorescentiesignalen waren respectievelijk 401 nm en 421 nm. Excitatie- en emissiegolflengten van groene fluorescentiesignalen waren respectievelijk 499 nm en 519 nm. Excitatie- en emissiegolflengten van rode fluorescentiesignalen waren respectievelijk 591 nm en 618 nm. 152 μm is de diameter van het confocale gaatje (10x objectieflens, NA: 0,4). De resolutie voor het vastleggen van afbeeldingen was 1024 × 1024 pixels.
3. Voor de conventionele monsters (stap 3), leg 30 beelden (Z-stacks) vast in 1 μm frames van elke 30 μm dikke sectie en behandel deze beelden verder zoals hierboven vermeld (stappen 4.1-4.2).
4. Demonstreer de afbeeldingen in het patroon van 3D-reconstructie met het beeldverwerkingssysteem.
5. Voer 3D-reconstructies uit door confocale Z-stack-afbeeldingen te importeren in Imaris 9.0 (celbeeldvormingssoftware, zie Materiaaltabel) en maak oppervlakteweergaven op basis van vlekintensiteiten: voeg nieuwe oppervlakken toe | Kies bronkanaal | Bepaal de parameters in de vloeiende optie van Surfaces Detail | Bepaal de parameters in de drempeloptie absolute intensiteit | Oppervlakken classificeren | Afmaken.
6. Verkrijg gegevens in het oppervlak van positieve zenuwvezels met de celbeeldvormingssoftware. Selecteer de gerenderde afbeelding | Statistieken | Gedetailleerde | Specifieke waarden | Volume.

Resultaten

Na drievoudige fluorescerende kleuring werden de zenuwvezels, bloedvaten en lymfevaten duidelijk gelabeld met respectievelijk CGRP, falloidine en LYVE1 in de behaarde en glabrous huid (figuur 3,4). Met de clearingbehandeling kunnen de CGRP-positieve zenuwvezels, falloidine-positieve bloedvaten en LYVE1-positieve lymfevaten op grotere diepte worden afgebeeld om de volledige structurele informatie van de huid te verkrijgen (figuur 3). Toen deze we...

Discussie

De huidige studie biedt een gedetailleerde demonstratie van de huidzenuwvezels in de behaarde en glabrous huid door immunofluorescentie te gebruiken op dikkere weefselsecties met clearingbehandeling en een 3D-weergave om de binnenkant van de huid beter te begrijpen. De antilichaamincubatietijd van maximaal 1-2 dagen en een nachtelijk reinigingsproces zijn belangrijk. Deze twee belangrijke stappen hebben direct invloed op het immunofluorescentiekleuringseffect van dikke delen. Een ander probleem werd opgeworpen door de ke...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing	Solarbio Life Sciences	P1020	pH 7.2-7.4, 0.01 Mol
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Life Science	T48402-5G
Confocale fluorescentiemicroscopie	Olympus Corporation	Fluoview FV1200
Donkey anti-muis IgG H&L Alexa-Fluor488	Abcam plc.	ab150105
Donkey anti-schapen IgG H&L Alexa-Fluor405	Abcam plc.	ab175676
EP buis	Wuxi NEST Biotechnology Co.	615001	1.5 mL
Schuifsysteem voor microtomen met vriesfase	Leica Biosystems	CM1860
Imaris Software	Oxford Instruments	v.9.0.1
IRIS standaard schaar	WPI (World Precision Instruments Inc.)	503242
iSpacer	SunJin Lab co.	IS005
Microtang-Str	RWD	F11020-11
Muis monoklonaal anti-CGRP-antilichaam	Santa cruz biotechnology, Inc.	sc-57053
Neutraal gebufferd Formaldehyde	Solarbio Life Sciences	G2161	10%
Normaal ezelsserum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-12	10 mL
Peristaltiekpomp	Longer Precision Pump Co., Ltd	BT300-2J
Phalloidin Alexa-Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A12381
RapiClear 1.52 oplossing	SunJin Lab co.	RC152001	10 mL
Reguliere agarose	Gene Company Limited	G-10
SEMKEN 1 x 2 tandweefseltang-Str	RWD	F13038-12
Schapen polyklonaal anti-LYVE1-antilichaam	R&D Systems, Inc.	AF7939
Zes-wellplaat	Corning Incorporated	3335
Natriumazid	Sigma Life Science	S2002	25 g
Sucrose	Sigma Life Science	V900116	500 g
Superlijm	Henkel AG & Co.	Pattex 502
Chirurgische handgrepen	RWD	S32003-12
Triton X-100	Solarbio Life Sciences	9002-93-1	100 mL
Urethane	Sigma Life Science	U2500	500 g
VANNAS veerscharen	RWD	S1014-12
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200S