Methodenartikel

Littekenontwikkeling visualiseren met behulp van SCAD Assay - een ex-situ skin scarring assay

DOI:

10.3791/63808

⸱

28 april 2022

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Regenerative Biology and Medicine, Helmholtz Zentrum München, 2School of Medicine, Klinikum Rechts der Isar, Department of Plastic and Hand Surgery, Technical University of Munich

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft het genereren van een huid-fascia explant genaamd "SCar like tissue in A Dish" of SCAD. Dit model maakt een ongekende visualisatie van enkele fibroblasten mogelijk tijdens littekenvorming.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De wereldwijde reactie van zoogdieren op het afdichten van diepe weefselwonden is door littekenvorming en weefselcontractie, gemedieerd door gespecialiseerde fascia fibroblasten. Ondanks de klinische betekenis van littekenvorming en verminderde wondgenezing, is ons begrip van fascia fibroblastdynamica bij wondgenezing vluchtig vanwege het gebrek aan relevante assays die directe visualisatie van fibroblastchoreografie en -dynamiek in complexe omgevingen zoals in huidwonden mogelijk maken. Dit artikel presenteert een protocol om ex-situ huidlittekens te genereren met behulp van SCAD of "SCar-achtig weefsel in A Dish" dat de complexe omgeving van huidwonden nabootst. In deze test wordt de huid van 2 mm van volledige dikte weggesneden en ondersteboven gekweekt in media gedurende 5 dagen, gedurende welke littekens en huidcontracturen zich uniform ontwikkelen. Deze methodologie, in combinatie met fibroblast-lineage specifieke transgene muismodellen, maakt visualisatie van individuele fibroblastlijnen over het hele wondherstelproces mogelijk. Over het algemeen helpt dit protocol onderzoekers bij het begrijpen van fundamentele processen en mechanismen van wondherstel, waarbij de effecten van modulatoren op wondgenezingsresultaten direct worden onderzocht.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wondgenezing is een proces van herstel van gebroken wonden. Weefselletsels bij ongewervelde dieren resulteren in gedeeltelijke of volledige regeneratie. Daarentegen reageren zoogdieren op diep letsel door littekens, een proces dat is afgestemd op het snel afdichten van wonden met dichte pluggen van matrixvezels die het doorgebroken gebied minimaliseren en tegelijkertijd de gewonde site permanent vervormen 1,2,3. Grote brandwonden op de huid of diepe open wonden bij zoogdieren resulteren in pathologische fenotypen zoals hypertrofische of keloïde littekens 4,5. Deze uitbundige littekens veroorzaken een enorme belasting voor klinische en wereldwijde gezondheidszorgsystemen. Alleen al in de VS kost littekenbeheer jaarlijks ongeveer $ 10 miljard 6,7. Daarom is de ontwikkeling van relevante methodologieën nodig om de fundementale processen en mechanismen die betrokken zijn bij littekenvorming beter te begrijpen.

In de afgelopen jaren heeft een breed scala aan studies bij muizen heterogene fibroblastpopulaties onthuld met verschillende functionele potenties op basis van hun oorsprong op bepaalde huidlocaties 8,9,10. In de achterhuid identificeerden Rinkevich et al., 2015, dat een specifieke fibroblastpopulatie met een vroege embryonale expressie van Engrailed-1 (En1), epf (engrailed positive fibroblast) genoemd, bijdraagt aan cutane littekens bij verwonding. Omgekeerd draagt een andere fibroblastlijn zonder voorgeschiedenis van ingebakken expressie, Engrailed negative fibroblast (ENF), niet bij aan littekenvorming8. Het in kaart brengen van deze En1-afstammingslijnen met behulp van Cre-gestuurde transgene muislijnen gekruist naar fluorescentie reporter muislijnen zoals R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) maakt visualisatie van EPF- en ENF-populaties mogelijk.

Het bestuderen van fibroblastmigratie in vivo gedurende meerdere dagen wordt beperkt door ethische en technische beperkingen. Bovendien is het technisch een technische uitdaging om samengestelde, virale en neutraliserende antilichaambibliotheekschermen te moduleren om routes te moduleren die betrokken zijn bij littekens. Eerder gebruikte in vitro of ex vivo modellen missen het vermogen om fibroblastmigratie en littekenvorming in echte huidmicro-omgevingen, uniformiteit in littekenontwikkeling en weefselcomplexiteit die in vivo huidomgevingen emuleertte visualiseren 11,12. Om de bovenstaande beperkingen te overwinnen, ontwikkelden we een ex vivo littekentest genaamd SCAD (SCar-achtig weefsel in A Dish)13,14. Deze eenvoudige test kan worden uitgevoerd door een huid van 2 mm van volledige dikte met de epidermis, de dermis en de subcutane fasciaregio's te exciëren en deze gedurende maximaal 5 dagen te kweken in dmso-media met serumsupplement. Littekens gegenereerd door SCAD repliceren op betrouwbare wijze transcriptomische en proteomische kenmerken van in vivo littekens. Bovendien maken SCADs gegenereerd uit relevante transgene muislijnen (bijv. En1-muizen) gekruist met fluorescerende reportermuislijnen de visualisatie van fibroblastmigratiedynamiek en littekenontwikkeling met een ongekende resolutie mogelijk. Bovendien kan dit model eenvoudig worden aangepast voor toepassingen met een hoge doorvoer (bijv. compound library, antilichaambibliotheek of virale screening)13,14. In dit artikel beschrijven we een geoptimaliseerd protocol om SCADs en daaropvolgende downstream verwerkingstoepassingen te genereren om cellulaire en matrixdynamiek in littekenontwikkeling te bestuderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderstaande model geeft een gedetailleerde stapsgewijze beschrijving van de generatie van SCAD-assay zoals kort beschreven in Jiang et al., 202013. SCAD-monsterpreparaten werden uitgevoerd na het offeren van de dieren volgens de internationale en de richtlijnen van de regering van Opper-Beieren. Dieren werden gehuisvest in de dierenfaciliteit van het Helmholtz Centre München. De kamers werden onderhouden met een optimale luchtvochtigheid en constante temperatuur met een lichtcyclus van 12 uur. Dieren werden ad libitum voorzien van voedsel en water.

1. SCAD weefselpreparaat

  1. Offer pasgeboren pups op postnatale dag 0 of dag 1 (P0 of P1).
  2. Snijd voorzichtig ten minste 1,5 cm x 1,5 cm volledige dikte dorsale rughuid tot de skeletspierlaag met behulp van een steriel chirurgisch scalpel.
  3. Pel de huid met behulp van steriele gebogen tang, zodat de oppervlakkige fascia intact is met de onderliggende panniculus carnosus spier.
  4. Was het weggesneden weefsel met 50-100 ml koude DMEM / F-12-media om besmettelijk bloed te verwijderen.
  5. Was eenmaal met Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) om de levensvatbaarheid van weefsel en cellen te behouden.
  6. Plaats de huid ondersteboven (oppervlakkige fascia bovenop) in een petrischaaltje van 10 cm met DMEM/F12-media.
  7. Met behulp van een wegwerp 2 mm biopsy punch, snijd volledige dikte ronde huidstukken, ervoor zorgen dat oppervlakkige fascia intact is met onderliggende panniculus carnosus spier tot de epidermis om SCAD weefsels te genereren.
  8. Bereid en vul 200 μL DMEM/F12 (zonder fenolrood) complete media-DMEM/F12 media aangevuld met 10% FBS, 1x GlutaMAX, 1x MEM niet-essentiële aminozuren en 1x Penicilline/streptomycine in individuele putjes van een 96-well plaat.
  9. Breng met behulp van een steriele tang zorgvuldig individueel SCAD-weefsel ondersteboven (fascia naar boven gericht) over en dompel het volledig onder in de putten van een 96-well plaat.
  10. Breng de plaat over naar een celkweekincubator die onder standaardomstandigheden wordt onderhouden (37 °C, 21% (v/v) zuurstof, 5% (v/v) C02 en 95% vochtigheid).

2. SCAD - Weefselkweek

  1. Kweek SCADs in een incubator gedurende maximaal 5 dagen.
  2. Vervang op dag 2 en dag 4 van de kweek de media door 200μl verse voorverwarmde DMEM / F12 complete media om voortdurende levensvatbaarheid van cellen en weefsels te garanderen. Vervang behandelingsstoffen tijdens elke mediawissel.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u 10 μL media in de put laat om te voorkomen dat weefsels aan de putjes blijven plakken.
  3. Bereid SCADs voor op de volgende experimenten: Live imaging (sectie 3) en Tissue Harvesting en 2D/3D immunofluorescentiekleuring (sectie 4).

3. Live beeldvorming van SCADs

  1. Bereid een minimum van 30 ml van 2% -3% (w / v) laagsmeltende agarose-oplossing in PBS in een glazen fles door deze in een magnetron te verwarmen totdat deze kookt.
  2. Breng de fles onmiddellijk over en koel de vloeibare agarose-oplossing in een waterbad van 40 °C.
  3. Breng het SCAD-weefsel met fascia/scar naar boven gericht over op het midden van een schotel van 35 mm.
  4. Sluit de SCAD in bij kamertemperatuur (RT) door met behulp van een Pasteur pipet langzaam 40 °C vloeibare agarose over te brengen op de 35 mm schotel. Agarose polymeriseert binnen 2 min.
  5. Voeg 2 ml voorverwarmde DMEM/F12 complete media toe (zonder fenolrode indicator).
  6. Verkrijg time-lapse-beelden van dag 0 SCADs tot 48 uur met behulp van een confocale of een multifotonenmicroscoop uitgerust met een geschikt incubatiesysteem ingesteld op 37 °C, 21% (v/v) zuurstof, 5% (v/v) C02 en 95% vochtigheid.

4. Weefseloogst en 2D/3D immunofluorescentiekleuring

  1. Was de weefsels op relevante tijdstippen door de media te vervangen door steriel PBS.
  2. Breng met behulp van een steriele tang zorgvuldig afzonderlijke SCADs over naar microcentrifugebuizen van 1,5 ml die 500 μL 2% paraformaldehyde bevatten om de weefsels 's nachts bij 4 °C te fixeren.
  3. Was de weefsels driemaal met PBS en ga verder met 2D/3D immunofluorescentiekleuring.
  4. 3D immunofluorescentie kleuring
    1. Permeabiliseer de weefsels door te incuberen in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met 500 μL PBS aangevuld met 0,2% gelatine, 0,5% Triton-X100 en 0,01% Thimerosal (PBSGT) bij RT gedurende 24 uur.
    2. Bereid een voldoende hoeveelheid primaire antilichamen volgens de instructies van de fabrikant en incubeer SCAD-weefsels in 150 μL PBSGT-oplossing gedurende 24 uur bij RT.
      OPMERKING: Als de optimale antilichaamconcentratie voor immuunfluorescentie niet door de fabrikant wordt gemeld, moet eerdere antilichaamtitratie worden uitgevoerd op controleweefsels met verschillende concentraties (bijv. 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000).
    3. Was de SCADs voorzichtig drie keer met PBS om het ongebonden primaire antilichaam te verwijderen.
    4. Incubateer weefsel met 1:1000 relevante Alexa Fluor secundaire antilichamen in PBS 's nachts bij RT.
    5. Was het weefsel gedurende 30 minuten in PBS driemaal voorzichtig om overtollige ongebonden secundaire antilichamen te verwijderen.
    6. Breng het weefsel over op een 35 mm glazen bodemschaal voor confocale of multifoton beeldvorming.
      OPMERKING: Bij gebruik van onderdompelingsdoelstellingen in water, integreer de SCADs in 2% laag smeltpunt agarose om het weefsel te immobiliseren om driften tijdens beeldacquisitie te voorkomen
  5. 2D immunofluorescentie kleuring
    1. Breng het weefsel over naar een cryo-mal en vul voorzichtig met optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding om het weefsel volledig onder te dompelen.
    2. Pas de oriëntatie van het weefsel voorzichtig aan en zorg voor de afwezigheid van luchtbellen om een doorsnede of een verticale sectie te verkrijgen.
    3. Plaats de vorm 20-30 min op droogijs en incubeer het blok een nacht op -80 °C.
    4. Stel de bladtemperatuur in op -25 °C en de temperatuur van het monsterblok op -17 °C. Bereid een cryosectie van 6 μm voor met behulp van een cryostaat, breng de secties over op een hechtingsschuif en bewaar de dia's in een vriezer van -20 °C.
    5. Spoel de glaasjes driemaal in PBS en incubeer de glaasjes in 5% Bovine Serum Albumin (BSA) w/v in PBST (PBS aangevuld met 0,05% Tween) gedurende 1 uur.
    6. Voeg een geschikte hoeveelheid primair antilichaam toe aan 150μl PGST en incubeer een nacht bij 4 °C
      OPMERKING: Als de optimale antilichaamconcentratie voor immuunfluorescentie niet door de fabrikant wordt gerapporteerd, moet eerdere antilichaamtitratie worden uitgevoerd op controlesecties met verschillende concentraties (bijv. 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000).
    7. Was de secties voorzichtig drie keer met PBS om het ongebonden primaire antilichaam te verwijderen.
    8. Incubeer weefsel met 1:1000 relevante Alexa Fluor secundaire antilichamen in PBS gedurende 2 uur bij RT.
    9. Was het weefsel gedurende 5 minuten in PBS driemaal voorzichtig om overtollige ongebonden secundaire antilichamen te verwijderen.
    10. Monteer de dia's met een montagemedium met DAPI en droog de dia's in het donker bij RT.
    11. Stel de secties voor met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het genereren van SCADs kan worden onderverdeeld in drie essentiële stappen: het oogsten van de huid van P0-P1-muizen, het genereren van biopsieponsen van volledige dikte en de daaropvolgende kweek van individuele scads tot 5 dagen in 96-well platen. Als uitlezing kan deze test verder worden toegepast om de ruimtelijke en temporele aspecten van littekens te analyseren. De ruimtelijke analyse maakt gebruik van 2D- en 3D-immuunlabeling van weefsels om ruimtelijke lokalisatie van cellulaire en matrixcomponenten in zich ontw...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn al verschillende modellen ontwikkeld om littekenvorming na letsel te begrijpen. Hoewel er in dit opzicht veel vooruitgang is geboekt, zijn de werkelijke mechanismen nog steeds niet duidelijk. In tegenstelling tot de vorige techniek bevat het SCAD-model alle celtypen en cutane lagen, waardoor de complexiteit van native skin18,19 behouden blijft. Deze methodologie is in staat om fundamentele datasets te genereren die belangrijk zijn voor het begrijpen van m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We erkennen alle co-auteurs van Jiang et al. 2020 voor hun bijdrage aan de ontwikkeling van SCAD-methodologie13. We bedanken Dr. Steffen Dietzel en de Bioimaging-kernfaciliteit aan de Ludwig-Maximilans-Universität voor de toegang tot het Multiphoton-systeem. Y.R. werd ondersteund door de Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), de European Research Council Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) en de LEO Foundation (LF-OC-21-000835).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10% Tween 20, Nonionic DetergentBiorad Laboratories1610781
Bovine serum albumin, Cold ethanol fractSigmaA4503-50G
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mLLIFE Technologies11039021
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190169
Epredia Cryostar NX70 CryostatThermo Scientific
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slidesFisher scientificJ1800AMNZAdhesion slides
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mLLIFE Technologies 10500064
Fluoromount-G met DAPILife Technologies00 4959 52Montagemedium met DAPI
Forceps gebogen met fijne punten met geleidingspen van roestvrij staal (pincet) 125 mm lengteFisher Scientific12381369
Gelatine uit varkenshuidSigmaG2500-100G
GlutaMAX Supplement-100 mLLIFE Technologies35050038
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mLLIFE Technologies14025092
Ibidi Gas incubatiesysteem voor CO2 en O2Ibidi11922
Ibidi VerwarmingssysteemIbidi10915
Leica SP8 rechtopstaande microscoop - Multifoton excitatie 680–1300 nmLeicaUitgerust met een 25x water-dipping objectief (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combinatie met een afstembare laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single)
Niet-essentiële aminozurenLIFE Technologies11140035
NuSieve GTG Agarose,25 gBiozym /Lonza859081
OCT Embedding MatrixCarlroth6478.1
Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mLVWR International43368.9M
Pen-StrepGibco15140122
Stiefel Biopsy-Punch 2 mmStiefel270130
Rechte Scherpe/Scherpe Dissectie schaar 11,4 cmFisher Scientific15654444
Thimerosal Bioxtra, 97%–101%Sigma-AldrichT8784-1G
Zeiss Axioimager M2 rechtopstaande microscoopZeiss

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Longaker, M. T., et al. Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation. Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).
  2. desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. Fibroblasts and wound healing: an update. Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).
  3. Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).
  4. Tripathi, S., et al. Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities. Biomedical Dermatology. 4, 11(2020).
  5. Martin, P. Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration. Science. 276 (5309), 75-81 (1997).
  6. Correa-Gallegos, D., et al. Patch repair of deep wounds by mobilized fascia. Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).
  7. Sen, C. K. Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates. Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).
  8. Rinkevich, Y., et al. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), 2151(2015).
  9. Leavitt, T., et al. Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis. Cell Reports. 33 (6), 108356(2020).
  10. Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
  11. Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
  12. Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices. Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).
  13. Jiang, D., et al. Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin. Nature Communications. 11 (1), 5653(2020).
  14. Wan, L., et al. Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).
  15. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -L., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807(2021).
  16. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
  17. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  18. Wilhelm, K. -P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studies. Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
  19. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing). The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Littekenvormingfascia fibroblastenfibroblastmigratieweefselcontractieimmunofluorescentiekleuringconfocale microscopiewondgenezing

Gerelateerde artikelen