Dissectietechnieken en histologische bemonstering van het hart in grote diermodellen voor hart- en vaatziekten

Samenvatting

Vanwege de complexe anatomie kan een consistent reproduceerbaar dissectie- en oogstprotocol voor hartmonsters een uitdaging zijn om te implementeren. Dit manuscript presenteert de belangrijkste elementen van enkele standaard cardiale dissectieprotocollen, waarbij zowel de grove onderzoeksbenaderingen als de bemonsteringslocaties die vaak worden gebruikt voor histopathologisch onderzoek worden benadrukt.

Samenvatting

Het standaard bruto onderzoek en de bemonstering zijn sleutelelementen in de reproduceerbaarheid en het succes van experimentele studies naar hart- en vaatziekten bij grote dieren. Gezien de complexe anatomie van het hart, interspecies verschillen en de soorten compenserende en pathologische reacties, zijn consistente protocollen een uitdaging om te implementeren. Het gebruik van meerdere dissectieprotocollen wordt meestal aangepast aan de ervaring van de prosector en persoonlijke voorkeur blijft een bron van experimentele en interobservervariabiliteit. Hier is het doel om de belangrijkste anatomische kenmerken en oriëntatiepunten, dissectieprotocollen en histologische bemonsteringsnormen van het hart in sommige veelgebruikte soorten (waaronder honden, varkens, herkauwers en katten) te presenteren als modellen van hart- en vaatziekten.

Hier worden twee standaard bruto examenprotocollen gepresenteerd. Ten eerste de instroom-uitstroommethode, die de fysiologische bloedstroomrichting door het hart en grote bloedvaten volgt (vaak gebruikt bij honden, herkauwers en varkens), en ten tweede de vierkamerdissectietechniek (geïllustreerd bij katten). Beide technieken kunnen worden aangepast aan elke soort in bepaalde experimentele omstandigheden. De bemonsteringsprotocollen omvatten alle interessegebieden (sinoatriale knoop, ventrikels, interventriculair septum, atria, kleppen en aorta) en verbeteren, indien correct uitgevoerd, zowel de reproduceerbaarheid als de betrouwbaarheid van experimentele studies.

Inleiding

Vanwege de complexe anatomie en vroege strengheid, die de beoordeling van de hartwanddikte kunnen verstoren, is het grove onderzoek van het hart uitdagend en vatbaar voor verschillende techniekgerelateerde of interpretatiefouten. Dit wordt versterkt door de interspecifieke morfologische variaties en door het feit dat veel klinische, belangrijke cardiale pathologieën (waaronder vroege gevallen van coronaire hartziekten, fibrose, arteritis en amyloïdose) niet geassocieerd zijn met grove veranderingen, in wezen histologische pathologieën. Een gestandaardiseerd dissectie- en histologisch monsteroogstprotocol kan consistentie tussen waarnemers en tegelijkertijd vergelijkbaarheid en reproduceerbaarheid van experimentele studies van hart- en vaatziekten brengen.

De monsters werden verzameld van twee honden (Canis lupus familiaris) (een 3-jarige, mannelijke Franse Bulldog en een 8-jarige, vrouwelijke gemengde ras), een kat (Felis catus) (een 6-jarige, mannelijke Europese korthaar), een gedomesticeerd varken (Sus scrofa domesticus) (een 1-jarige, mannelijke Large White) en een koe (Bos taurus) (een 2 maanden oude, vrouwelijke Holstein). Elk van de gekozen soorten heeft een bijzonder gebruik als cardiovasculair model voor een andere ziekte; honden zijn bijvoorbeeld een voorkeursmodel voor aritmiemodellering; katten hebben de voorkeur voor hypertrofische cardiomyopathie (HCM), omdat het de soort is met de hoogste prevalentie van HCM; varkens worden gebruikt als model voor acuut myocardinfarct; en herkauwers worden gebruikt als model voor intoxicatie vanwege hun blootstelling aan gifstoffen die gemakkelijk te vinden zijn op weilanden¹¹.

In dit manuscript worden één obductieprotocol en twee dissectieprotocollen van het hart gepresenteerd, ontworpen om het grove en histologische onderzoek van het hart bij experimentele hart- en vaatziekten te verbeteren. De beschreven protocollen zijn ontwikkeld op basis van informatie uit veterinaire handboeken 1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12, tijdschriftliteratuur ^3,13,14, officiële documenten¹⁵ en webinars^{16 ,17}. De monsters die in deze studie werden gebruikt, werden geoogst uit kadavers die werden ingediend bij de afdeling Pathologie van de USAMV Cluj-Napoca voor routinematige autopsiediagnostiek.

Protocol

Het experimentele protocol ontving een bio-ethische overeenkomst (nr. 311 vanaf 2022) en werd goedgekeurd door de Commissie Bio-ethiek van de Universiteit voor Landbouwwetenschappen en Diergeneeskunde Cluj-Napoca, in overeenstemming met zowel nationale (wet nr. 43 van 2014) als Europese (EU-richtlijn nr. 63 uit 2010) wetgeving. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.

1. Obductie protocol

OPMERKING: Het wordt aanbevolen om hetzelfde obductieprotocol te gebruiken voor alle soorten die worden gepresenteerd vanwege de gemakkelijkere toegang die het is wanneer het wordt uitgevoerd ^2,12. De volgende stappen vertegenwoordigen de obductie die wordt uitgevoerd bij een middelgrote hond. Pas de stappen aan bij het uitvoeren van obducties op verschillende onderwerpen.

1. Weeg het onderwerp en plaats het op de obductietafel aan de linkerkant (figuur 1A). Ga verder met het externe onderzoek van het onderwerp (door de cutis en mucosa's te inspecteren en te palpatie, waarbij alle veranderingen in kleur, consistentie en volume worden opgemerkt).
2. Gebruik een mes (of een scalpel) en maak een incisie van 7 cm in de rechter oksel (figuur 1A).
3. Zoek de coxofemorale kruising (figuur 1A,B). Open de capsule met een mes. Knip het ligament van de kop van het dijbeen door (figuur 1B).
4. Gebruik het mes om de huidincisie in de oksel cranial uit te breiden naar de mandibulaire symfyse en caudaal naar het perineum (figuur 1B).
5. Verwijder de huid met het scalpel en stel de thoracale en buikwand vanaf de ventrale middellijn bloot aan het niveau van de werveltransversale processen (figuur 1B).
6. Maak met het scalpel en de tang een flap door de buikwand, ventrocaudal naar de rechter ribbenboog. Open de buikholte met een schaar - volg het caudale aspect van het rechter hypochondrium (figuur 1B).
7. Verleng de incisie caudally langs het rechter paralumbale gebied tot de externe iliacale top. Verleng daarna de incisie tot de schaamstreek van de linea alba.
8. Kort, onderzoek de buikorganen in situ (door eventuele veranderingen in kleur, consistentie, volume en positie van de organen op te merken).
9. Prik met het scalpel en de tang het diafragma op het hoogste punt door (figuur 1B).
10. Betreed de thoracale holte door de rechter ribbenkast met twee lengtesecties te verwijderen met behulp van een botsnijdende tang. Sectie het parasternale kraakbeenachtige segment van de ribben. Sectie vervolgens het dorsale segment van de ribben, proximaal aan de costovertebrale gewrichten (figuur 1C).
11. Onderzoek het hart in situ (figuur 1C). Let op de grootte, positie, kleur, verbindingen met de aangrenzende weefsels en door palpatie, eventuele veranderingen in de consistentie⁹.
    OPMERKING: Als een trombose of aangeboren hartaandoening aanwezig is, moet het hart in situ worden ontleed (deze aanpak maakt volledig onderzoek van de grote bloedvaten mogelijk).
12. Gebruik een schaar om de pericardholte te onderzoeken en te openen met een lengtegedeelte van de basis tot de top van het hart. Onderzoek de pericardholte en het epicard (waarbij eventuele veranderingen in kleur, consistentie en volume worden opgemerkt)¹².
13. Laat het hart los met een schaar, waardoor dwarsdoorsneden van de aorta, longstam en beide vena cavae ontstaan. Sectie van de superieure vena cava minstens 1 cm boven de ingang in het rechter atrium om de crista terminalis^11,13 te behouden.
14. Onderzoek de uitwendige contour van het orgaan, het uiterlijk van het epicardium, het uiterlijk van het myocardium door de transparantie van het epicardium en het uiterlijk van de grote bloedvaten (figuur 2A).
    OPMERKING: Over het algemeen vertonen het openen en onderzoeken van het pericardium enkele verschillen tussen de soorten. Het onderzoek van de pericardholte begint met een externe inspectie en beoordeling door de transparantie van het pericardium van de totale pericardiale inhoud ^1,2. Bij een kat of hond bevat het hartzakje meestal ongeveer 0,25 ml / kg dunne, heldere, doorschijnende tot lichtgele vloeistof⁹. Als er pathologische effusies zijn, moeten deze worden verzameld met een steriele spuit of vacutainerbuis.

2. Dissectieprotocol

OPMERKING: Verschillende obductietechnieken worden gebruikt voor het hart, elk met verschillende voordelen. Voor dit protocol werden twee van de meest gebruikte technieken gekozen: 1) de "instroom-uitstroommethode", die een beter onderzoek van de kleppen en het endocardium mogelijk maakt en een protocol is dat wordt gebruikt voor de meeste soorten 2,11,12,16, en 2) de "vierkamerdissectie" / "echocardiografische vlak" -techniek, meestal gebruikt voor katten of kleine honden ^{1, 17}.

1. De "instroom-uitstroommethode" voor hartdissectie 2,11,12,16
   1. Plaats het hart met het atrium naar boven (figuur 2A).
   2. Gebruik een schaar en tandeloze tang om breed van de caudale vena cava naar het rechter atrium te knippen (figuur 2B). Vervolg de snede naar het rechter auriculaire aanhangsel om de crista terminalis/sinoatriale knoop (SA-knoop) bloot te leggen. Inspecteer de tricuspidalisklep vanuit het dorsale zicht.
   3. Snijd een gedeelte van het rechter atrium naar de kruising tussen de rechter ventrikel en het interventriculaire septum (figuur 2C). Geef de rechter atrioventriculaire klep weer.
   4. Sectie van de rechter ventrikel vrije wand langs het interventriculaire septum. Ga door met de sectie tot de oorsprong van de pulmonale romp (figuur 2C,D).
   5. Onderzoek grondig de rechter atrioventriculaire kleppen, inclusief de chordae tendineae, en de papillaire spieren (figuur 2D). Snijd de chordae tendineae.
   6. Plaats een tang door de longstam en snijd de romp in de lengterichting door (figuur 2E). Onderzoek het pulmonale uitstroomkanaal, de oorsprong van de pulmonale romp en de semilunaire kleppen.
   7. Snijd het linkeratrium van de longaders naar de punt van de linker oorschelp (figuur 2F). Inspecteer de bicuspide (mitralis) klep vanuit het dorsale zicht.
   8. Plaats het hart met het interventriculaire septum naar beneden gericht (figuur 2F). Maak een grote incisie in de ventriculaire vrije wand van de basis van de ventrikel naar de harttop. Geef de linker atrioventriculaire klep volledig weer.
   9. Snijd de chordae tendineae van de cusp van de linker atrioventriculaire klep.
   10. Plaats een tang door het linker ventriculaire uitstroomkanaal en gebruik deze als leidraad om de aorta te openen (figuur 2G).
   11. Gebruik een zoutoplossing om alle bloedstolsels te verwijderen. Zodra alle bloedstolsels zijn verwijderd, beoordeelt en vergelijkt u het hartgewicht met de lichaamsgewichtstabellen of standaard cardiale gewichtstabellen (tabel 1)^11,13.
   12. Weeg het hart.
   13. Als alleen de SA-knoop het aandachtspunt is, plaats dan na het onderzoek van de linker ventrikel het hele hart volledig in 10% neutraal gebufferd formaline (NBF) gedurende 24 uur en trim het rechter atrium om de crista terminalis te bemonsteren.
       OPMERKING: Door deze techniek kunnen de linker- en rechterventrikels gemakkelijk worden gewaardeerd. De verhouding tussen de linker en rechter ventriculaire wanddikte is 3:1, met kleine verschillen per soort en ras; voor het hart van de dierlijke foetus is de verhouding 1: 1¹².

3. Bemonsteringsprotocol voor histologie¹⁶

1. Maak met een scalpel twee longitudinale, parallelle sneden (ongeveer 5 mm uit elkaar) met betrekking tot het rechter atrium, de tricuspidalisklep en de rechter ventriculaire vrije wand (figuur 2I)
2. Maak twee longitudinale parallelle sneden (ongeveer 5 mm uit elkaar) met betrekking tot het linker atrium, mitralisklep, dorsale papillaire spier en linker ventrikel (figuur 2H).
3. Binnen het dorsale bovenste derde deel van het hart, transversaal sectie de basis van het hart volgens een lijn, inclusief het interventriculaire septum, rechter atrium, aorta, aortaklep en tricuspidalisklep (figuur 2J).
4. Maak twee longitudinale parallelle sneden met betrekking tot de basis van de aorta en het interventriculaire septum (figuur 2J).
5. Trim het rechter atrium rond de crista terminalis en zorg voor verschillende parallelle secties die transversaal op de lengteas van de crista zijn georiënteerd (ongeveer 3-4 mm uit elkaar) om zes stukken van de SA-knoop te verkrijgen (figuur 3, figuur 4I en figuur 5H).
6. Snijd de verkregen weefsels in histologische cassettes bij.
   OPMERKING: Aanbevolen blokkeringsprotocol: stap 3.1.-histologisch blok 1 (figuur 6 toont de resulterende dia van dit blok.), stap 3.2.-histologisch blok 2 (figuur 7 toont de resulterende dia van dit blok), stap 3.4.-histologisch blok 3 (figuur 8 toont de resulterende dia van dit blok), stap 3.5.-histologisch blok 4 (figuur 9 toont de resulterende dia uit dit blok).
7. Dompel de weefsels onder in 10% NBF gedurende ten minste 48 uur.

4. Bemonstering van kransslagaders ^3,10,14

1. Gebruik een tang en een scalpel om de kransslagaders uit de cardiale paraconale groef te ontleden (figuur 4K). Fixeer de kransslagader 's nachts in 10% NBF.
2. Ontkalk indien nodig voldoende in een 1:1 mengsel van 8% mierenzuur en zoutzuur.
3. Maak meerdere dwarssneden met intervallen van 3 mm. Plaats de secties in een cassette en plaats de cassette vervolgens in 10% NBF totdat deze is ingesloten.
   OPMERKING: Varkens kunnen worden gebruikt als een hartmodel voor mensen, vooral als het gaat om coronaire hartziekten. Daarom worden aanvullende monsters en histologische secties van kransslagaders aanbevolen ^3,10,14.

5. De "vier kamers"/"echocardiografisch vlak" dissectietechniek van het hart ^1,17

OPMERKING: De vierkamerdissectietechniek bestaat uit een snede van de basis naar de top van het hart om het standaardbeeld te verkrijgen¹. De "vierkamer"-techniek kan het beste worden toegepast op vaste weefsels.

1. Plaats het hele hart in 10% NBF gedurende ten minste 48 uur.
2. Nadat het hart gedurende ten minste 48 uur in 10% NBF is gefixeerd (figuur 10A), plaatst u twee tandeloze rechte dissectietangen, één door de craniale cava-rechter atrium-tricuspidalisklep-rechter ventrikel, en de tweede door de pulmonale ader-linker atrium-mitralisklep-linker ventrikel (figuur 10B).
3. Gebruik de ruimte tussen de tangarmen als leidraad voor het snijblad van de basis naar de top van het hart (figuur 10C). Zorg voor een extra lengtesectie van ongeveer 5 mm, afgezien van de sectie die in stap 5.2 is beschreven. op het hartsegment, dat de aorta omvat.
4. Met een transversale incisie scheidt u de hartbasis volledig van de top. Plaats elk weefselsegment in een histologische cassette.
   OPMERKING: Aanbevolen blokkeringsprotocol: het cardiale apex-histologische blok 5 (figuur 11A toont de resulterende dia van dit blok), het cardiale basis-histologische blok 6 (figuur 11B toont de resulterende dia van dit blok).
5. Plaats de cassettes in 10% NBF totdat ze zijn ingesloten. Fixeer alle hartmonsters in 10% NBF (meer dan 10 keer het volume weefsel), verwerk ze routinematig in paraffine, sectie op 4 μm dikte, en beits met hematoxyline en eosinekleuring (H &E-vlek) volgens een eerder beschreven protocol¹⁰.
   OPMERKING: Als myocarditis wordt vermoed, "moet een stuk vers hartweefsel onder steriele omstandigheden worden bewaard met steriel chirurgisch materiaal en steriele monstercontainer voor microbiologische en virale onderzoeken"¹³.

6. Fotografische documentatie

OPMERKING: Fotografische documentatie is een optionele stap in het obductieonderzoek. Fotografie en video-opnames zijn echter essentieel om een "nauwkeurige documentatie van de normale en abnormale anatomie" te hebben ³.

1. Voor een goede fotografische documentatie, maak digitale beelden tijdens het uitvoeren van "progressieve dissectie van hartweefsels"¹³. Raadpleeg de richtlijnen voor fotografische documentatie en foto¹⁵ de algemene view-anterior en posterior; een stukje van het hart; en eventuele vermoedelijke laesies.

Resultaten

Dit protocol werd gebruikt om anatomische kenmerken te visualiseren en monsters te verzamelen voor histologisch onderzoek van het hart bij vier verschillende soorten (hond, kat, varken en koe). Het obductieprotocol werd herhaald bij elk van de bovengenoemde soorten, maar alleen geïllustreerd bij honden. Het obductieprotocol begint met een uitgebreid extern onderzoek van het lichaam (figuur 1A) (inclusief de huid, verkenbare lymfeklieren en buitenslijmvlies), het meten van het totale gewicht ...

Discussie

Bij het uitvoeren van het huidige protocol moeten verschillende kritieke stappen zorgvuldig worden overwogen voor consistente resultaten. Bij jonge dieren verschillen hartmetingen van die bij volwassenen (inclusief ventriculaire wanddikte) en over het algemeen vertegenwoordigt het hart een groter deel van het lichaamsgewicht^11,12. De mate van ventriculaire hypertrofie kan worden gekwantificeerd door een algemene gewichtsformule toe te passen, waarbij de verhoudin...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.9% zoutoplossing	B. BRAUN MELSUNGEN AG	W04479004	Voor het wassen van al het bloed en bloedstolsels uit het hart.
10% neutraal gebufferd formaline (NBF)	Q Path	11699404	Materialen voor het verzamelen van histopathologische monsters.
Botsnijtang	HELEN SRL	LS109HV	Stevig instrument voor het snijden van bot.
Snijplank	Ambition	86304	Voor een gemakkelijkere manipulatie en het snijden van organen.
Decalcificerende oplossing	Thermo Scientific TBD-2	6764004	1:1 mengsel van 8% mierenzuur en zoutzuur.
Digitale camera	Canon Inc.	PowerShot SX540 HS	Voor fotografische en videografische documentatie.
Pincet	MKD-Medicale	15-430	Dissectie-instrumenten.
Histologische cassettes	Q Path	720-2215	Materialen voor het verzamelen van histopathologische monsters. Afmetingen: 3 × 2.5 × 0.4 cm
Mes	TEHNO FOOD COM SERV SRL	D2006/15	Scherp mes voor het snijden van zacht weefsel.
Latex handschoenen	MKD-Medicale	SANTEX-S	Beschermingsapparatuur.
Masker	MKD-Medicale	21221	Beschermingsapparatuur.
Petrischalen	MKD-Medicale	0598-1V	Materialen voor het verzamelen van aanvullende testmonsters.
Kunststof recipiënten	Corning Gosselin	TP200-02	Materialen voor het verzamelen van histopathologische monsters.
Weegschaal	ESPERANZA	MEEKS008	Voor het wegen van de organen.
Weegschaal	White Deals	72	Voor het wegen van de proefpersonen.
Schaar	MKD-Medicale	10322E	Scherp mes voor het snijden van zacht weefsel.
Schaar	MKD-Medicale	13-260	Dissectie-instrumenten.
Scrubba	MKD-Medicale	410100-52	Beschermingsapparatuur.
Spuiten	MKD-Medicale	10573EU	Materialen voor het verzamelen van aanvullende testmonsters.