Het huidige protocol beschrijft een techniek om op grote schaal en kosteneffectief weefselsferoïden te produceren met behulp van een 3D-geprint stempelachtig apparaat.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Genereren van weefselsferoïden via een 3D-geprint stempelachtig apparaat
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Vooruitgang in 3D-celcultuur heeft geleid tot meer fysiologisch relevante in vitro modellen, zoals weefselsferoïden. Cellen die als sferoïden worden gekweekt, hebben meer realistische biologische reacties die lijken op de in vivo-omgeving . Vanwege hun voordelen vertegenwoordigen weefselsferoïden een opkomende trend in de richting van superieure, betrouwbaardere en meer voorspellende onderzoeksmodellen met een breed scala aan biotechnologische toepasbaarheid. Reproduceerbare platforms die grootschalige productie van weefselsferoïden kunnen bereiken, zijn echter een onvervulde behoefte geworden om hun potentieel volledig te verkennen en te vergroten. Hierin wordt de grootschalige productie van homogene weefselsferoïden gerapporteerd met behulp van een goedkope en tijdbesparende methodologie. Een 3D-geprint stempelachtig apparaat is ontwikkeld om tot 4.716 sferoïden per plaat met 6 putjes te genereren. Het apparaat wordt vervaardigd volgens de stereolithografiemethode met behulp van een fotocureerbare hars. Het uiteindelijke apparaat bestaat uit cilindrische micropins, met een hoogte van 1,3 mm en een breedte van 650 μm. Deze aanpak maakt het mogelijk om snel homogene sferoïden en co-gekweekte sferoïden te genereren met een uniforme vorm en grootte en >95% levensvatbaarheid van de cellen. Bovendien is het stempelachtige apparaat afstembaar voor verschillende maten putplaten en petrischalen. Het is gemakkelijk te steriliseren en kan gedurende lange perioden worden hergebruikt. De efficiënte grootschalige productie van homogene weefselsferoïden is essentieel om hun vertaling te benutten voor meerdere gebieden van de industrie, zoals weefselmanipulatie, geneesmiddelenontwikkeling, ziektemodellering en gepersonaliseerde geneeskunde op aanvraag.
Inleiding
Weefselsferoïden zijn 3D-microweefsels gevormd door celsuspensies die zichzelf assembleren zonder externe krachten1. Deze sferoïden zijn veel gebruikt in biofabricageprotocollen vanwege hun gelijkenis met de belangrijkste kenmerken van het menselijke fysiologische systeem 2,3. Weefselsferoïden bieden meer vergelijkbare stofwisseling, cytoskeletdynamiek, cellevensvatbaarheid en metabole en secretieactiviteit dan traditionele monolaagse celcultuur1. Vanwege hun fusievermogen kunnen ze ook worden gebruikt als bouwstenen (bijv. bioprintprotocollen) om complexe weefselgemanipuleerde constructies te vormen met verhoogde biologische relevantie 4,5.
Vanwege hun biologische relevantie zijn weefselsferoïden gebruikt als een biotechnologisch hulpmiddel voor protocollen variërend van weefselmanipulatie, geneesmiddelenontwikkeling, ziektemodellering en nanotoxicologische beoordeling, waardoor tijd, ruimtekosten en dierproeven worden verminderd 3,6,7,8. Om het potentieel van weefselsferoïden volledig te verkennen en te benutten, zijn echter zeer noodzakelijke betrouwbare en reproduceerbare methoden die gericht zijn op de grootschalige productie ervan, en deze blijven een voortdurende uitdaging.
Verschillende methodologieën produceren sferoïden, zoals hangende druppel, gecoate u-vormige bodemputten, microfluïdica en met behulp van een polymere matrix 9,10. Hoewel deze methodologieën de weg hebben geëffend binnen de sferoïde productiemarkt, zijn ze nog steeds complex, tijdrovend, arbeidsintensief of duur10.
Het huidige protocol rapporteert de grootschalige productie van homogene weefselsferoïden met behulp van een goedkope en tijdbesparende methodologie. We hebben een 3D-geprint stempelachtig apparaat ontwikkeld om tot 4.716 sferoïden per plaat met 6 putjes te genereren. Bovendien kan het stempelachtige apparaat op maat worden gemaakt om meer sferoïden per put te produceren, geschikt voor verschillende celkweekplaten. Het is gemakkelijk te steriliseren en kan gedurende lange perioden worden hergebruikt. De efficiënte grootschalige productie van homogene weefselsferoïden is essentieel om het gebruik ervan naar de klinieken te vertalen en bij te dragen aan meerdere gebieden van de industrie, zoals weefselmanipulatie, geneesmiddelenontwikkeling, ziektemodellering en gepersonaliseerde geneeskunde op aanvraag.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De L929-cellijn, fibroblasten van muizen, werd gebruikt voor de huidige studie. Het postzegelachtige 3D-geprinte biodevice is verkregen uit een commerciële bron (zie Materiaaltabel). Goede celkweekpraktijken en steriele technieken werden gedurende het hele protocol gevolgd. Het gefabriceerde apparaat werd gesteriliseerd door het af te vegen met 70% alcohol en het gedurende 15 minuten bloot te stellen aan UV-licht. De celkweekmedia en -oplossingen werden verwarmd tot 37 °C voordat ze in contact kwamen met de cellen of weefselsferoïden. Een schematische weergave van het protocol is weergegeven in figuur 1.
1. Bereiding van niet-hechtende mallen van het stempelachtige apparaat
- Bereid 2% (m/v) agarosegel volgens de onderstaande stappen.
- Verdun het agarosepoeder in fosfaatgebufferde zoutoplossing (1x PBS) en homogeniseer de resulterende suspensie met cirkelvormige bewegingen.
OPMERKING: Deze oplossing kan in een glazen fles worden gedaan. In deze stap zal de agarose-oplossing niet doorschijnend zijn. - Plaats de glazen fles in de magnetron en stel deze 30 s in. Stop elke 5 s de magnetron, verwijder de glazen fles en homogeniseer de oplossing handmatig met cirkelvormige bewegingen. Het verwarmingsproces moet worden uitgevoerd totdat de oplossing een vloeistof-heldere toestand bereikt.
NOTITIE: Een kookplaat kan ook worden gebruikt als alternatief voor de magnetron. Na het verhittingsproces moet de oplossing doorschijnend/helder zijn. - Voeg 1 ml van de agarose-oplossing toe aan elk putje van een plaat met 6 putjes die voor het experiment is gepland.
- Wacht ~15 minuten of tot de agarose stolt.
NOTITIE: Een koelplaat kan worden gebruikt om de stollingstijd te verkorten. - Voeg 1-2 ml van de agarose-oplossing toe en plaats het apparaat voorzichtig boven de vloeibare agarose.
NOTITIE: De plaatsing van het apparaat moet zorgvuldig gebeuren om luchtbellen in de interface van het agarose-apparaat te voorkomen. - Wacht ~30 minuten of tot de agarose stolt.
NOTITIE: Een koelplaat kan worden gebruikt om de stollingstijd te verkorten. - Haal het apparaat voorzichtig uit de agarose.
OPMERKING: De verwijdering is van cruciaal belang. Men moet het voorzichtig verwijderen om de agarose-kenmerken intact te houden; Anders kan de agarose worden verstoord. - Voeg 2 ml DMEM-media toe, wacht 10 minuten, gooi de media weg en vervang deze door verse DMEM. Herhaal dit drie keer om de put goed te wassen.
- Voeg 2 ml DMEM toe en plaats de plaat met 6 putjes in een incubator (bij 37 °C bij 5% CO2 en 80% luchtvochtigheid) totdat de cel is uitgezaaid (Figuur 2A-F, aanvullende video 1).
- Verdun het agarosepoeder in fosfaatgebufferde zoutoplossing (1x PBS) en homogeniseer de resulterende suspensie met cirkelvormige bewegingen.
2. Generatie van weefselsferoïden
OPMERKING: Verschillende cellijnen hebben verschillende hechtingseigenschappen. Daarom is het mogelijk dat sommige soorten cellen met behulp van deze methodologie de weefselsferoïden niet goed vormen.
- Kweek de cellen volgens traditionele monolaagcultuur (d.w.z. kweek de cellen in celkweekkolven met behulp van DMEM met lage glucose aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 μg/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine) (zie materiaaltabel). Houd de cellen op 37 °C in een 5% CO2 -incubator en controleer totdat ze 80% van de samenvloeiing bereiken.
- Na het bereiken van de gewenste samenvloeiing, wast u de cellen met 1x PBS.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 5 ml te gebruiken voor kolven van 25 cm2 , 10 ml voor kolven van 75 cm2 en 15 ml voor kolven van 150 cm2 . - Voeg het dissociatie-enzym toe en incubeer de cellen gedurende 2-5 minuten bij 37 °C in 5% CO2 en 80% vochtigheid.
OPMERKING: In de huidige studie werd 0,125% trypsine met 0,78 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) als dissociatie-enzym gebruikt (zie Materiaaltabel). - Observeer de loslating van de cellen van de celkweekkolven en voeg een groeimedium toe aangevuld met FBS om het celdissociatie-enzym te neutraliseren.
OPMERKING: Voor de huidige studie werd DMEM met lage glucose (zie Materiaaltabel) gebruikt aangevuld met 10% FBS. - Centrifugeer de celsuspensie bij 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Tel vervolgens de cellen handmatig.
- Neem 50 x 105 cellen per buisje en voeg 5 ml van 1x PBS toe.
OPMERKING: Het aantal gezaaide cellen is van invloed op de uiteindelijke diameter van de weefselsferoïde. Daarom kan men het aantal cellen verhogen om weefselsferoïden met grotere diameters te genereren. - Centrifugeer de celsuspensie bij 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatans met een pipet, voeg 1 ml van het celkweekmedium toe en homogeniseer de oplossing.
OPMERKING: In de huidige studie werd een compleet kweekmedium van DMEM met lage glucose gebruikt, aangevuld met 10% FBS, 100 μg/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine. - Verwijder 2 ml medium van de plaat met 6 putjes (stap 1.1.9) en voeg 1 ml van de celsuspensie toe aan het midden van de agarosevorm gevormd door het 3D-geprinte bio-apparaat (stap 1.1.7). Wacht tot de cellen bezinken in de microresecties (~20-30 min) en voeg voorzichtig 1 ml celkweekmedium toe aan het putje.
OPMERKING: Men moet extra voorzichtig zijn in deze stap. Het wordt aanbevolen om het medium voorzichtig toe te voegen, de pipetpunt dicht bij de putwand te plaatsen en in kleine hoeveelheden te doseren. - Plaats de plaat met 6 putjes in de incubator (bij 37 °C bij 5% CO2 en 80% luchtvochtigheid) om de weefselsferoïden te vormen (ongeveer 24-48 uur, afhankelijk van het celtype) (Figuur 3).
OPMERKING: Verschillende celtypen (bijv. kankercellen, primaire cellen) hebben verschillende kinetiek voor zelfassemblage11.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Genereren van homogene microresecties met behulp van het 3D-geprinte stempelachtige apparaat
Het 3D-geprinte, postzegelachtige apparaat werd met succes vervaardigd door middel van stereolithografiemethode12 met behulp van een fotouithardende hars (Figuur 2A). Het uiteindelijke apparaat bestond uit cilindrische micropinnen met een hoogte van 1,3 mm en een breedte van 650 μm (figuur 2A)....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft een eenvoudige, snelle en goedkope methode voor de grootschalige productie van weefselsferoïden. Een stempelachtig 3D-geprint apparaat werd gebruikt als een hoofdmal, die tot 4.716 sferoïden per plaat met 6 putjes genereerde. Het is aangetoond dat cellen die als sferoïden worden gekweekt, meer realistische biologische reacties hebben die sterk lijken op de in vivo omgeving1. Vanwege hun voordelen vertegenwoordigen weefselsferoïden ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De 3D-geprinte stempelachtige apparaten werden aangeboden door de startup Bioedtech, waarvan Janaína Dernovsek medeoprichter en innovatiedirecteur is. De auteurs verklaren dat er geen concurrerende financiële belangen zijn.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Foundation for Research Support of the State of Rio de Janeiro (FAPERJ, Brazilië), de Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES, Brazilië) en de Braziliaanse Nationale Raad voor Wetenschappelijke en Technologische Ontwikkeling (CNPq, Brazilië). We danken Bioedtech voor het leveren van de stempelachtige apparaten die in deze studie zijn gebruikt en professor Bartira Bergmann van het Immunopharmacology Laboratory voor het gebruik van hun celkweekfaciliteiten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 6 well plate | Merck | CLS3516 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| Biodevice | Bioedtech | ||
| Biological Safety Cabinet | ThermoFisher | 51029701 | |
| Centrifugue | ThermoFisher | 75004031 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | Merck | CLS430829-500EA | |
| Corning cell culture flasks surface area 75 cm2 | Merck | CLS430641 | |
| Draft Resin | FormLabs | FLDRBL01 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - low glucose | Merck | D6046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| Form 2 | FormLabs | ||
| Incubator | ThermoFisher | 51033782 | |
| L929 cell lines | Stablished in the lab | ||
| Penicillin and Streptomycin (PS) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Merck | 806552 | |
| Trypsin with EDTA | Merck | T3924 |
Referenties
- Laschke, M., Menger, M. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Mekhileri, N., et al. Automated 3D bioassembly of micro-tissues for biofabrication of hybrid tissue engineered constructs. Biofabrication. 10 (2), 024103(2018).
- Itoh, M., et al. Scaffold-free tubular tissues created by a bio-3D printer undergo remodeling and endothelialization when implanted in rat aortae. PLoS One. 10 (12), 0145971(2015).
- Kronemberger, G., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
- Mironov, V., et al. Organ printing: Tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
- Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
- Garcez, P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Charelli, L., et al. Biologically produced silver chloride nanoparticles from B. megaterium modulate interleukin secretion by human adipose stem cell spheroids. Cytotechnology. 70 (6), 1655-1669 (2018).
- Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), 20160877(2017).
- Achilli, T., Meyer, J., Morgan, J. Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids. Expert Opinion on Biological Therapy. 12 (10), 1347-1360 (2012).
- Rolver, M., Elingaard-Larsen, L., Pedersen, S. Assessing cell viability and death in 3D spheroid cultures of cancer cells. Journal of Visualized Experiments. (148), e59714(2019).
- Quan, H., et al. Photo-curing 3D printing technique and its challenges. Bioactive Materials. 5 (1), 110-115 (2020).
- Rodriguez-Salvador, M., Perez-Benitez, B., Padilla-Aguirre, K. Discovering the latest scientific pathways on tissue spheroids: Opportunities to innovate. International Journal of Bioprinting. 7 (1), 331(2021).
- Baptista, L., et al. Adult stem cells spheroids to optimize cell colonization in scaffolds for cartilage and bone tissue engineering. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1285(2018).
- Shakeri, A., Khan, S., Didar, T. Conventional and emerging strategies for the fabrication and functionalization of PDMS-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 21 (16), 3053-3075 (2021).
- vander Valk, J. Fetal bovine serum (FBS): Past - present - future. ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).
- vander Valk, J., Brunner, D., et al. Optimization of chemically defined cell culture media - Replacing fetal bovine serum in mammalian in vitro methods. Toxicology in Vitro. 24 (4), 1053-1063 (2010).
- Smyrek, I., et al. microtubules and FAK dominate different spheroid formation phases and important elements of tissue integrity. Biology Open. 8 (1), 037051(2018).
- McMillen, P., Holley, S. Integration of cell-cell and cell-ECM adhesion in vertebrate morphogenesis. Current Opinion in Cell Biology. 36, 48-53 (2015).
- Tung, Y., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Guo, X., Li, S., Ji, Q., Lian, R., Chen, J. Enhanced viability and neural differential potential in poor post-thaw hADSCs by agarose multi-well dishes and spheroid culture. Human Cell. 28 (4), 175-189 (2015).
- Andréa Dernowsek, J., Rezende, R., Lopes daSilva, J. The role of information technology in the future of 3D biofabrication. Journal of 3D Printing in Medicine. 1 (1), 63-74 (2017).
- Garcez, P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Skardal, A., et al. Multi-tissue interactions in an integrated three-tissue organ-on-a-chip platform. Scientific Reports. 7, 8837(2017).
- Armoiry, X., et al. Autologous chondrocyte implantation with chondrosphere for treating articular cartilage defects in the knee: An evidence review group perspective of a NICE single technology appraisal. PharmacoEconomics. 37 (7), 879-886 (2018).
- Nakamura, A., et al. Bio-3D printing iPSC-derived human chondrocytes for articular cartilage regeneration. Biofabrication. 13 (4), 044103(2021).
- Mesquita, C., Charelli, L., Baptista, L., Naveira-Cotta, C., Balbino, T. Continuous-mode encapsulation of human stem cell spheroids using droplet-based glass-capillary microfluidic device for 3D bioprinting technology. Biochemical Engineering Journal. 174, 108122(2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
