Method Article

Isogene nierglomeruluschip ontworpen uit door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen

DOI:

10.3791/63821

⸱

November 4th, 2022

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Pratt School of Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine, 3Department of Cell Biology, Duke University, 4Center for Biomolecular and Tissue Engineering, Duke University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een protocol gepresenteerd om een gepersonaliseerd orgaan-op-een-chip-systeem te ontwikkelen dat de structuur en functie van de nierglomerulaire filtratiebarrière samenvat door genetisch gematchte epitheel- en vasculaire endotheelcellen te integreren die zijn gedifferentieerd van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen. Dit bio-technische systeem kan nierprecisiegeneeskunde en aanverwante toepassingen bevorderen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chronische nierziekte (CKD) treft 15% van de Amerikaanse volwassen bevolking, maar de oprichting van gerichte therapieën is beperkt door het gebrek aan functionele modellen die de menselijke biologische reacties en nefrotoxiciteit nauwkeurig kunnen voorspellen. Vooruitgang in nierprecisiegeneeskunde kan helpen deze beperkingen te overwinnen. Eerder vastgestelde in vitro modellen van de menselijke nierglomerulus - de primaire plaats voor bloedfiltratie en een belangrijk doelwit van veel ziekten en medicijntoxiciteiten - maken echter meestal gebruik van heterogene celpopulaties met beperkte functionele kenmerken en ongeëvenaarde genetische achtergronden. Deze kenmerken beperken hun toepassing voor patiëntspecifieke ziektemodellering en therapeutische ontdekking aanzienlijk.

Dit artikel presenteert een protocol dat door de mens geïnduceerde pluripotente stam (iPS) cel-afgeleid glomerulair epitheel (podocyten) en vasculair endotheel van een enkele patiënt integreert om een isogene en gevasculariseerde microfluïdische nierglomeruluschip te ontwikkelen. De resulterende glomeruluschip bestaat uit van stamcellen afgeleide endotheel- en epitheelcellagen die afstammingsspecifieke markers tot expressie brengen, keldermembraaneiwitten produceren en een weefsel-weefselinterface vormen die lijkt op de glomerulaire filtratiebarrière van de nier. De gemanipuleerde glomeruluschip filtert selectief moleculen en recapituuleert door geneesmiddelen geïnduceerde nierschade. Het vermogen om de structuur en functie van de nierglomerulus te reconstitueren met behulp van isogene celtypen creëert de mogelijkheid om nierziekte te modelleren met patiëntspecificiteit en het nut van organen-op-chips voor nierprecisiegeneeskunde en aanverwante toepassingen te bevorderen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organ-on-a-chip-apparaten zijn dynamische 3D-in vitromodellen die moleculaire en mechanische stimulatie gebruiken, evenals vascularisatie, om weefsel-weefselinterfaces te vormen die de structuur en functie van specifieke organen modelleren. Eerder gevestigde organ-on-a-chip-apparaten die gericht waren op het recapituleren van de glomerulus (glomeruluschips) van de nier bestonden uit dierlijke cellijnen1 of menselijke primaire en onsterfelijke cellijnen van heterogene bronnen 2,3. Het gebruik van genetisch heterogene celbronnen vertoont variaties die de studies van patiëntspecifieke responsen en genetica of ziektemechanismen aanzienlijk beperken 4,5. Het aanpakken van deze uitdaging hangt af van de beschikbaarheid van isogene cellijnen afkomstig van specifieke individuen met geconserveerde moleculaire en genetische profielen om een nauwkeurigere micro-omgeving te bieden voor het ontwikkelen van in vitro modellen 2,3,6. Isogene cellijnen van menselijke oorsprong kunnen nu gemakkelijk worden gegenereerd als gevolg van vooruitgang in de menselijke iPS-celcultuur. Omdat menselijke iPS-cellen meestal niet-invasief afkomstig zijn, zichzelf voor onbepaalde tijd kunnen vernieuwen en differentiëren in bijna elk celtype, dienen ze als een aantrekkelijke bron van cellen voor het opzetten van in vitro modellen, zoals de glomeruluschip 7,8. De glomerulaire filtratiebarrière is de primaire plaats voor bloedfiltratie. Bloed wordt eerst gefilterd door vasculair endotheel, het glomerulaire keldermembraan, en ten slotte door gespecialiseerd epitheel genaamd podocyten. Alle drie de componenten van de filtratiebarrière dragen bij aan de selectieve filtratie van moleculen. Hier wordt een protocol gepresenteerd om een orgaan-op-een-chip-apparaat vast te stellen dat is gekoppeld aan vasculair endotheel en glomerulair epitheel van een enkele menselijke iPS-celbron. Hoewel dit protocol vooral nuttig is om een isogene en gevasculariseerde chip te engineeren om de glomerulaire filtratiebarrière te recapituleren, biedt het ook een blauwdruk voor het ontwikkelen van andere soorten gepersonaliseerde organen-op-chips en multi-orgaanplatforms zoals een isogene 'body-on-a-chip'-systeem.

Het hierin beschreven protocol begint met divergente differentiatie van menselijke iPS-cellen in twee afzonderlijke afstammingslijnen - laterale mesoderm- en mesodermcellen, die vervolgens worden gedifferentieerd in respectievelijk vasculair endotheel en glomerulair epitheel. Om laterale mesodermcellen te genereren, werden menselijke iPS-cellen gezaaid op keldermembraanmatrix 1-gecoate platen en gedurende 3 dagen gekweekt (zonder media-uitwisseling) in N2B27-medium aangevuld met de Wnt-activator, CHIR 99021, en de krachtige mesoderminductor, botmorfogenetisch 4 (BMP4). De resulterende laterale mesodermcellen werden eerder gekenmerkt door de expressie van brachyury (T), mix paired-like homeobox (MIXL) en eomesodermin (EOMES)9. Vervolgens werden de laterale mesodermcellen gedurende 4 dagen gekweekt in een medium aangevuld met VEGF165 en Forskolin om vasculaire endotheelcellen te induceren die werden gesorteerd op basis van VE-Cadherine en / of PECAM-1-expressie met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS). De resulterende vasculaire endotheelcellen (viEC) werden uitgebreid door ze te kweken op keldermembraanmatrix 3-gecoate kolven totdat ze klaar waren om te zaaien in het microfluïdische apparaat.

Om mesodermcellen te genereren, werden menselijke iPS-cellen gezaaid op keldermembraanmatrix 2-gecoate platen en gedurende 2 dagen gekweekt in een medium dat Activine A en CHIR99021 bevat. De resulterende mesodermcellen werden gekenmerkt door de expressie van HAND1, goosecoid en brachury (T) zoals eerder beschreven 2,10,11. Om intermediair mesoderm (IM) celdifferentiatie te induceren, werden de mesodermcellen gedurende 14 dagen gekweekt in een medium aangevuld met BMP-7 en CHIR99021. De resulterende IM-cellen brengen Wilm's Tumor 1 (WT1), gepaard boxgen 2 (PAX2) en odd-skippped related protein 1 (OSR-1)2,10,11 tot expressie.

Een tweekanaals polydimethylsiloxaan (PDMS) gebaseerde microfluïdische chip werd ontworpen om de structuur van de glomerulaire filtratiebarrière in vitro samen te vatten. Het urinekanaal is 1.000 μm x 1.000 μm (b x h) en de dimensie van het capillaire kanaal is 1.000 μm x 200 μm (b x h). Cyclische rek- en ontspanningscycli werden vergemakkelijkt door de holle kamers die aan elke kant van de vloeistofkanalen aanwezig waren. Cellen werden gezaaid op een flexibel PDMS-membraan (50 μm dik) dat de urine- en capillaire kanalen scheidt. Het membraan is uitgerust met zeshoekige poriën (7 μm diameter, 40 μm uit elkaar) om intercellulaire signalering te bevorderen (figuur 1A)2,12. Twee dagen voordat de IM-inductie was voltooid, werden de microfluïdische chips gecoat met keldermembraanmatrix 2. viEC's werden in het capillaire kanaal van de microfluïdische chip gezaaid met behulp van endothelial maintenance medium 1 dag voordat IM-inductie was voltooid, en de chip werd ondersteboven gekeerd om celadhesie aan de basale kant van het ECM-gecoate PDMS-membraan mogelijk te maken. Op de dag dat im-inductie werd voltooid, werden de cellen in het urinekanaal van de microfluïdische chip gezaaid met behulp van een medium aangevuld met BMP7, Activine A, CHIR99021, VEGF165 en alle trans-retinoïnezuur om podocytendifferentiatie in de chip te induceren. De volgende dag werden de mediareservoirs gevuld met Podocyte Induction medium en Endothelial Maintenance medium, en 10% mechanische spanning bij 0,4 Hz en vloeistofstroom (60 μL/h) werden op de chips aangebracht.

De gecelluliseerde microfluïdische chips werden gedurende 5 extra dagen gekweekt met behulp van Podocyte Induction medium (in het urinekanaal) en Endothelial Maintenance medium (in het vasculaire kanaal). De resulterende nierglomeruluschips werden tot 7 extra dagen gekweekt in onderhoudsmedia voor zowel de podocyten- als de endotheelcellen. De gedifferentieerde podocyten drukten positief afstammingsspecifieke eiwitten uit, waaronder podocine en nefroline13,14, terwijl viEC's de afstammingsidentificatie-eiwitten PECAM-1 en VE-Cadherine positief tot expressie brachten, die allemaal essentiële moleculen zijn voor het behoud van de integriteit van de glomerulaire filtratiebarrière15,16 . De podocyten en viEC's bleken beide het meest voorkomende glomerulaire keldermembraaneiwit, collageen IV, af te scheiden, wat ook belangrijk is voor weefselrijping en -functie.

Het driecomponentensysteem van de filtratiebarrière - endotheel, keldermembraan en epitheel - in de glomeruluschips bleek selectief moleculen te filteren en te reageren op een chemotherapeutische, nefrotoxische medicamenteuze medicamenteuze behandeling. Resultaten van de medicamenteuze behandeling gaven aan dat de glomeruluschip kan worden gebruikt voor nefrotoxiciteitsstudies en voor ziektemodellering. Dit protocol biedt de algemene richtlijn voor het ontwerpen van een functionele microfluïdische nierglomeruluschip uit isogene iPS-celderivaten. Downstream analyses van de engineered chip kunnen naar wens door de onderzoeker worden uitgevoerd. Voor meer informatie over het gebruik van de glomeruluschip om door geneesmiddelen geïnduceerde glomerulaire schade te modelleren, raadpleegt u eerdere publicaties 2,12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereid keldermembraanmatrixoplossingen en gecoate substraten voor

  1. Ontdooi keldermembraanmatrix 1 's nachts op ijs bij 4 °C. Aliquot volgens de suggestie van de fabrikant voor verdunningsverhouding. Gebruik een conische buis en pipet van 50 ml en meng grondig een geschikte hoeveelheid keldermembraanmatrix 1 in 25 ml koude DMEM / F12 totdat deze volledig is ontdooid en opgelost.
    1. Om een bevroren aliquot op te lossen, neemt u ~ 200 μL uit de 25 ml koude DMEM / F12 en brengt u deze over naar de bevroren aliquotbuis. Pipetteer op en neer totdat de matrix grondig is ontdooid en opgelost. Breng het volledige buisgehalte van keldermembraanmatrix 1 over in de rest van de koude DMEM/F12.
  2. Pipetteer 1 ml keldermembraanmatrix 1 oplossing in elke put van een 6-well plaat. Om de gecoate platen dezelfde dag te gebruiken, incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur.
    1. Als alternatief kunnen de gecoate platen worden omwikkeld met parafilm en maximaal 2 weken bij 4 °C worden bewaard. Wanneer u klaar bent voor gebruik, incubeer dan bij 37 °C gedurende 30 minuten.
  3. Verdun keldermembraanmatrix 2 in 9 ml steriel gedestilleerd water om een eindconcentratie van 5 μg / ml te bereiken. Pipetteer 700 μL keldermembraanmatrix 2-oplossing in elke put van een 12-wellsplaat. Wikkel de keldermembraanmatrix 2-gecoate platen met parafilm en bewaar bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken.
  4. Reconstitueer gelyofiliseerde keldermembraanmatrix 3 om een eindconcentratie van 1 mg / ml in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, Ca + 2- en Mg + 2-vrij) te bereiken, zoals voorgesteld door de fabrikant. Verdun één aliquot van 250 μL tot een eindconcentratie van 25 μg/ml in 9,75 ml PBS (Ca+2 en Mg+2 vrij). Gebruik 6 ml van deze oplossing om één T75-kolf te coaten (een eindconcentratie van 2 μg/cm2). Bewaar de kolven met matrixcoating bij 4 °C gedurende maximaal 1 week.

2. Menselijke iPS-celkweek

OPMERKING: De DU11-lijn die in dit protocol wordt gebruikt, is getest en bleek vrij te zijn van mycoplasma en karyotype-afwijkingen.

  1. Incubeer keldermembraanmatrix 1-gecoate platen bij 37 °C gedurende 1-2 uur.
  2. Was elk putje van de 6-wells plaat 3x met 1 ml warme (37 °C) DMEM/F12. Voeg 2 ml humaan iPS-celkweekmedium (CCM) (aanvullende tabel S1) toe aan elk putje van de 6-wellsplaat. Incubeer de platen bij 37 °C terwijl de cellen worden voorbereid voor het zaaien zoals hieronder beschreven.
  3. Was elk putje van de 6-wells plaat met menselijke iPS-cellen met 1 ml warme DMEM/F12.
  4. Aspirateer de DMEM/F12. Voeg 1 ml warme cellosmiddel toe aan elk putje van de 6-wellsplaat. Incubeer bij 37 °C gedurende 1 min.
  5. Inspecteer elke put visueel onder een microscoop op dissociatie rond de randen van de celkolonie. Zuig de celdetachementbuffer voorzichtig op van de cellen. Was elk goed voorzichtig met 1 ml warme DMEM/F12.
  6. Inspecteer de platen onder de microscoop om er zeker van te zijn dat de cellen niet volledig van de plaat zijn losgemaakt of per ongeluk zijn geaspireerd.
  7. Voeg 3 ml warme menselijke iPS CCM toe aan elk putje van de 6-well plaat met cellen. Gebruik een cellifter om de kolonies voorzichtig te schrapen. Gebruik een serologische pipet van 5 ml en meng de celsuspensie in elke put voorzichtig op en neer.
  8. Haal de nieuwe keldermembraanmatrix 1-gecoate plaat uit de incubator. Breng 0,5 ml van de celsuspensie over naar elke put van de nieuwe keldermembraanmatrix 1-gecoate plaat. Verplaats de plaat in een beweging van acht om de cellen gelijkmatig te verdelen. Incubeer bij 37 °C in een 5% CO2-incubator .
  9. Aspirateer het gebruikte medium en vervang door 3 ml humaan iPS CCM elke dag van cultuur totdat cellen 70% confluent zijn (ongeveer 4 dagen na passage).

3. Dag 0-16: differentiatie van menselijke iPSC's in intermediaire mesodermcellen

  1. Dag 0-2: mesoderm inductie
    1. Verplaats keldermembraanmatrix 2-gecoate platen van 4 °C naar kamertemperatuur gedurende 2 uur om na opslag in evenwicht te komen.
    2. Aspirateer het gebruikte medium uit elke put van de 6-well plaat die ongeveer 70% confluente menselijke iPS-cellen bevat. Was de cellen voorzichtig 3x met 1 ml warme DMEM/F12.
    3. Aspirateer de DMEM/F12. Voeg 1 ml cellosmiddel toe aan elke put van de 6-well plaat van menselijke iPS-cellen. Incubeer bij 37 °C gedurende 5-7 min.
    4. Inspecteer elke put visueel onder een microscoop op dissociatie rond de randen van de celkolonie. Gebruik een cellifter om de kolonies voorzichtig te schrapen.
    5. Breng de celsuspensies over van alle putten van de 6-wellsplaat naar een conische buis van 15 ml en gebruik een P1000 om meerdere keren op en neer te pipetteren om een eencellige suspensie van de iPS-cellen te verkrijgen.
    6. Vul de celsuspensie in de conische buis tot 14 ml met DMEM/F12. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 × g bij kamertemperatuur.
    7. Aspirateer het supernatant. Resuspendeer de celpellet in 14 ml warme DMEM/F12. Herhaal de centrifugatie gedurende 5 minuten bij 200 × g bij kamertemperatuur.
    8. Aspirateer het supernatant. Resuspendeer de cellen in 1 ml Mesoderm Inductie medium (Aanvullende Tabel S1). Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Verdun in Mesoderm Inductie medium om een eindconcentratie van 1 × 105 cellen/ml te bereiken.
    9. Aspirateer de coating van de keldermembraanmatrix 2-gecoate plaat. Spoel elke put van de keldermembraanmatrix 2-gecoate plaat 2x af met 1 ml warme DMEM/F12.
    10. Pipetteer de celsuspensie 2x op en neer. Breng 1 ml van de celsuspensie over naar elke put van de keldermembraanmatrix 2-gecoate plaat. Beweeg de plaat voorzichtig in een beweging van acht om de cellen gelijkmatig te verdelen.
    11. Incubeer de plaat bij 37 °C 's nachts. De volgende dag (dag 1) aspirateer het gebruikte medium uit elke put van de 12-well plaat. Vervang door 1 ml warm Mesoderm Inductiemedium. Incubeer bij 37 °C 's nachts.
  2. Dag 2-16: intermediaire mesoderm inductie
    1. Aspirateer het gebruikte Mesoderm Inductie medium. Vervang door 1m L warm Intermediate Mesoderm Inductiemedium (Aanvullende Tabel S1). Aspirateer het gebruikte medium en vervang het door 1 ml warme Intermediate Mesoderm Inductie medium elke dag gedurende 14 dagen.

4. Dag 0-15: differentiatie en uitbreiding van menselijke iPSC's in vasculaire endotheelcellen

  1. Dag 0: humane iPS cell seeding
    1. Bereid 15 ml humane iPS CCM met ROCK-remmer (aanvullende tabel S1). Warm houden bij 37 °C.
    2. Incubeer een keldermembraanmatrix 1-gecoate plaat gedurende 1-2 uur bij 37 °C. Aspirateer de keldermembraanmatrix 1. Was 3x met 1 ml warme DMEM/F12.
    3. Aspirateer de DMEM/F12. Voeg 2 ml humane iPS CCM met ROCK-remmer toe aan elk putje van de 6-wellsplaat. Incubeer de platen bij 37 °C terwijl de cellen worden voorbereid voor het zaaien zoals hieronder beschreven.
    4. Aspirateer het gebruikte medium uit elke put van de 6-well plaat die ongeveer 70% confluente menselijke iPS-cellen bevat. Was de cellen voorzichtig 3x met 1 ml warme DMEM/F12.
    5. Aspirateer de DMEM/F12. Voeg 1 ml cellosmiddel toe aan elke put van de 6-well plaat van menselijke iPS-cellen. Incubeer bij 37 °C gedurende 5-7 minuten om de cellen in afzonderlijke cellen te dissociëren.
      OPMERKING: Vanwege inherente verschillen tussen iPS-cellijnen, moet de gebruiker de cellen na 5 minuten visueel inspecteren om de optimale incubatietijd te bepalen.
    6. Breng de cellen over naar een conische buis van 15 ml. Breng de celsuspensie op 14 ml met warme DMEM/F12 om de loslatingsbuffer te neutraliseren. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200× g bij kamertemperatuur.
    7. Zuig het supernatant voorzichtig aan. Resuspendeer de cellen in 1 ml humane iPS CCM met ROCK-remmer. Tel het totale aantal cellen met behulp van een hemocytometer.
    8. Zaai de cellen tussen 37.000 en 47.000 cellen/cm2 (355.200 tot 451.200 cellen/put van een 6-well plaat). Incubeer bij 37 °C 's nachts.
      OPMERKING: Vanwege inherente verschillen tussen iPS-cellijnen, moet de gebruiker de optimale zaaidichtheid bepalen.
  2. Dag 1-3: laterale mesoderm inductie
    1. De volgende dag (dag 1) aspirateert u het gebruikte medium uit elke put van de 6-well plaat van menselijke iPS-cellen. Vervang elke put van de 6-wells plaat door 5 ml lateraal mesoderm inductiemedium (aanvullende tabel S1). Vervang bij het opschalen van het kweekvat (bijv. kolven) over het algemeen door 3x het werkvolume in het kweekvat.
    2. Verander dit medium gedurende 3 dagen niet.
      OPMERKING: Laterale Mesoderm Inductie Medium in de putten zal normaal gesproken van kleur veranderen van rood naar geel als de cellen de voedingsstoffen opgebruiken. Troebel medium of medium met bacteriegroei is echter niet normaal en moet als zodanig worden ontsmet en weggegooid.
  3. Dag 4-6: endotheelcelinductie
    1. Aspirateer het gebruikte medium uit elke put van de 6-well plaat. Vervang elk putje van de 6-wells plaat door 3 ml warm endotheelinductiemedium (aanvullende tabel S1). Incubeer de plaat bij 37 °C 's nachts.
    2. Verzamel gedurende de volgende 2 dagen (dag 5 en 6) het gebruikte medium uit alle putten in een conische buis van 50 ml. Bewaar de conische buis bij 4 °C. Vul de cellen aan met 3 ml warm endotheelinductiemedium. Incubeer de plaat bij 37 °C.
  4. Dag 7: endotheelcel (viEC) sortering
    1. Haal keldermembraanmatrix 3 kolven eruit en laat 1 uur op kamertemperatuur staan.
    2. Bereid 50 ml MACS-buffer (aanvullende tabel S1).
    3. Plaats celdetachementbuffer, MACS-buffer, Endotheel CCM en PBS (Ca2+ en Mg2+ vrij) op ijs in de weefselkweekkap.
    4. Plaats de magneet op de MACS-standaard. Plaats twee conische buizen van 50 ml en een conische buis van 15 ml in een conische buishouder.
    5. Plaats de MACS-standaard (met magneet bevestigd) en één LS-kolom in de weefselkweekkap. Plaats de conische buishouder (met conische buizen erin) op de MACS-standaard, onder de magneet (supplementale figuur S1A).
    6. Verzamel het gebruikte medium uit elke put van de 6-wellsplaat in de conische buis van 50 ml vanaf stap 4.3.2. Was elk putje van de 6-well plaat met PBS (Ca2+ en Mg2+ gratis).
    7. Aspirateer de PBS. Voeg 1 ml cellosmiddel toe. Incubeer bij 37 °C gedurende 5-7 minuten om de cellen volledig te dissociëren.
    8. Breng de cellen over naar een conische buis van 50 ml. Breng de celsuspensie op 15 ml met koude endotheel-CCM. Centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    9. Aspirateer het supernatant. Resuspendeer de cellen in 1 ml koude MACS-buffer. Tel de cellen met een hemocytometer.
    10. Voeg 10 ml MACS-buffer toe aan de celsuspensie. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 × g bij kamertemperatuur.
    11. Aspirateer het supernatant. Resuspensieer de cellen in 80 μL MACS-buffer per 10 miljoen cellen. Voeg 20 μL per 10 miljoen cellen FcR Blocking Reagent, CD31 microbeads en CD144 microbeads toe. Incubeer gedurende 15 minuten op ijs.
    12. Terwijl de celsuspensie broedt, centrifugeert u het medium dat is verzameld uit endotheelinductie (stap 4.3.2) bij 200 × g gedurende 10 minuten.
    13. Vang het supernatant op in een vacuümfilter van 0,22 μm van 500 ml. Bereid het endotheelgeconditioneerde medium voor (aanvullende tabel S1). Filtreer het medium onder steriele omstandigheden en houd het medium warm bij 37 °C.
      OPMERKING: De proliferatiesnelheid van endotheelcellen zal beginnen af te nemen na passage 3. Om exponentiële groei na passage 3 te bereiken, kan endotheel geconditioneerd en onderhoudsmedium worden aangevuld met 10 μM TGF-Beta-remmer (SB431542) vanaf passage 1.
    14. Voeg na de incubatie van 15 minuten in stap 4.4.11 10 ml MACS-buffer per 10 miljoen cellen (maximaal 30 ml MACS-buffer) toe aan de celsuspensie. Centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 min.
    15. Aspirateer het supernatant. Resuspend in 1 ml MACS-buffer.
    16. Neem de LS-kolom en trek de zuiger uit de spuit. Plaats de zuiger terug in de plastic huls. Plaats de kolom op de magneet.
    17. Plaats de eerste conische buis van 50 ml onder de kolom. Voeg 1 ml MACS-buffer toe aan de kolom. Verzamel in de conische buis van 50 ml eronder.
    18. Laat de vloeistof doorstromen, maar niet helemaal om te voorkomen dat de kolom uitdroogt. Wanneer de vloeistofdruppels langzaam beginnen te druppelen, voegt u de celsuspensie toe aan de kolom. Verzamel de flowthrough in dezelfde conische buis van 50 ml.
    19. Wanneer de vloeistofdruppels langzaam beginnen te druppelen, plaatst u de volgende conische buis van 50 ml onder de kolom. Voeg de eerste flowthrough (stap 4.4.18) toe aan de kolom. Verzamel in de conische buis van 50 ml eronder.
    20. Wanneer de vloeistofdruppels langzaam beginnen te druppelen, voegt u 500 μL MACS-buffer 3x toe om de kolom te wassen.
    21. Verwijder de kolom van de magneet. Plaats de kolom op de conische buis van 15 ml. Voeg 1 ml koude PBS toe aan de kolom.
    22. Om de cellen te verzamelen, neemt u de zuiger uit de plastic huls en duwt u deze stevig in de kolom.
    23. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Breng de celsuspensie met PBS op 5 ml. Centrifugeer gedurende 5 min bij 200 × g.
    24. Terwijl de cellen centrifugatie ondergaan, wast u de keldermembraanmatrix 3x met 5 ml PBS om zich voor te bereiden op het zaaien van cellen. Aspirateer de PBS en voeg 20 ml endotheelgeconditioneerd medium toe aan de keldermembraanmatrix 3-gecoate kolf.
    25. Verwijder de cellen uit de centrifuge en zuig het supernatant aan. Resuspendeer de cellen in endotheelgeconditioneerd medium om te worden gezaaid op 26.000 cellen / cm2 (1,95 × 106 cellen / T75 kolf). Zaai de cellen.
    26. Om de sorteerefficiëntie en celopbrengst te berekenen, deelt u het celgetal van stap 4.4.23 door het celgetal van stap 4.4.9.
  5. Dag 8-15: uitbreiding van viEC's
    1. Haal de volgende dag (dag 8) het gebruikte medium uit de kolf. Vervang door 10 ml endotheelgeconditioneerd medium. Vervang het endotheel geconditioneerde medium om de andere dag totdat de kolf voor 90% samenvloeit of totdat de endotheliale geconditioneerde mediumfles volledig is gebruikt.
    2. Aspirateer het gebruikte medium en vervang om de andere dag door 10 ml endotheelonderhoudsmedium (aanvullende tabel S1) voor verdere expansie.
    3. Om de viEC's te passeren, bereidt u twee keldermembraanmatrix 3-gecoate T75-kolven voor. Laat de kolven 1 uur op kamertemperatuur staan. Was de vers bereide kolven 3x met 5 ml PBS grondig.
    4. Aspirateer de PBS. Voeg 10 ml warm endotheelonderhoudsmedium toe aan elke vers bereide kolf. Incubeer de platen bij 37 °C terwijl de cellen worden voorbereid voor het zaaien zoals hieronder beschreven.
    5. Voeg 5 ml cellosmiddelbuffer toe aan een 90% confluent T75-kolf met viEC's. Incubeer bij 37 °C gedurende 5-7 min. Breng de cellen over naar een conische buis van 15 ml. Voeg 5 ml warme DMEM/F12 toe. Centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 min.
    6. Aspirateer het supernatant. Resuspenderen in 1 ml warm endotheelonderhoudsmedium. Voeg 500 μL van de celsuspensie toe aan elk van de vers bereide T75-kolven.
    7. De volgende dag adem je het gebruikte medium. Vervang door 10 ml endotheelonderhoudsmedium. Giet het gebruikte medium aan en vervang om de dag door 10 ml endotheelonderhoudsmedium totdat de kolf voor 90% samenvloeit.

5. Dag 14: voorbereiding van microfluïdische orgaanchipapparaten voor celkweek

  1. Plasmabehandeling en keldermembraan matrix 2 coating
    1. Bereid de keldermembraanmatrix 2-oplossing voor (stap 1.3). Zet het opzij.
    2. Pak in een steriele weefselkweekkap de steriele ronde petrischaal van 100 mm x 15 mm uit. Plaats de bovenkant van de petrischaal, naar beneden gericht, onder de onderkant van de petrischaal (aanvullende figuur S1B).
    3. Haal met een pincet de microfluïdische chips uit de verpakking en plaats ze in de petrischaal. Sluit de petrischaal met het deksel van onder de schaal.
    4. Plaats bij de plasma-asher het deksel van de petrischaal onder de schaal, naar beneden gericht, en houd ze bij elkaar als één eenheid. Plaats de petrischaaleenheid in de plasma-asherkamer. Start de plasma asher met zuurstof op 100 W, 15 SCCM, 30 s.
    5. Tijdgevoelig: Zodra de behandeling is voltooid, haalt u de petrischaaleenheid uit de plasma-asher. Veeg het deksel van de petrischaal snel en lichtjes af met 70% ethanol op een laboratoriumdoekje gespoten. Bedek de petrischaal met het deksel.
    6. Breng de petrischaal naar de steriele weefselkweekkap. Voeg voorzichtig 25 μL keldermembraanmatrix 2-oplossing toe aan het urinekanaal (boven) van de chip. Voeg 20 μL keldermembraanmatrix 2-oplossing toe aan het capillaire (onderste) kanaal van de chip.
    7. Neem twee steriele conische buisdoppen van 15 ml en vul ze met steriel gedestilleerd water (~ 500 μL). Plaats de dop in de petrischaal om te voorkomen dat de chipkanalen en het membraan uitdrogen. Plaats het deksel op de schaal. Incubeer bij 37 °C 's nachts.

6. Zaaien van viEC's en intermediaire mesodermcellen in de microfluïdische apparaten

  1. Dag 15: viEC's
    1. Aspirateer het medium uit T75-kolven die 90% confluente viEC's bevatten. Voeg 5 ml cellosmiddel toe en incubeer bij 37 °C gedurende 5-7 minuten.
    2. Breng de cellen over naar een conische buis van 15 ml. Voeg 5 ml DMEM/F12 toe. Centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 min.
      OPMERKING: Elke T75-kolf met ongeveer 90% confluente viEC's levert ~ 3 miljoen cellen op.
    3. Aspirateer het supernatant. Resuspendeer de cellen in 300 μL endotheelonderhoudsmedium om ongeveer 2 miljoen cellen/300 μL te verkrijgen. Tel de cellen met een hemocytometer. Zet de celsuspensie opzij.
    4. Breng de petrischaal met de microfluïdische chips over op de weefselkweekkap. Bevestig een P200-barrièrepunt aan de punt van een aspirator.
    5. Spoel zowel de bovenste als de onderste kanalen van de microfluïdische chip met 200 μL DMEM/F12 en zuig tegelijkertijd de periferie van de uitlaat aan.
    6. Houd de chip stevig vast met de P200-barrièrepunt bevestigd aan de aspirator, uit de buurt van de uitlaat van het onderste kanaal. Injecteer stevig 20 μL van de viEC-suspensie met ongeveer 134.000 cellen in het capillaire (onderste) kanaal van de chip. Zuig het medium voorzichtig op uit de periferie van de uitlaat.
    7. Controleer onder de microscoop op bubbels of een ongelijke viEC-zaaidichtheid.
    8. Draai de chip voorzichtig om om deze om te keren, zodat de viEC's zich kunnen hechten aan de basale kant van het flexibele PDMS-membraan. Plaats de chip in de houdercartridge. Voeg 3 ml PBS toe aan de cartridge van de chiphouder om te voorkomen dat het membraan uitdroogt. Incubeer de chip bij 37 °C gedurende 3 uur.
    9. Controleer het onderste kanaal onder de microscoop op een confluente laag viEC's die aan het flexibele PDMS-membraan zijn bevestigd. Laat 200 μL endotheelonderhoudsmedium op de inlaat van het onderste kanaal vallen en laat het door het kanaal stromen om het kanaal van niet-vastgemaakte endotheelcellen te wassen terwijl u voorzichtig uit de periferie van de capillaire (onderste) kanaaluitlaat zuigt.
    10. Plaats de chip terug in de houdercartridge. Incubeer bij 37 °C 's nachts.
  2. Dag 16: intermediaire mesoderm (IM) cellen
    1. Spoel het capillaire (onderste) kanaal voorzichtig door met 200 μL Endotheelonderhoudsmedium terwijl u voorzichtig de periferie van de uitlaatpoort aanzuigt.
    2. Spoel het urinekanaal (boven) met 200 μL DMEM/F12 terwijl u voorzichtig de periferie van de uitlaat opzuigt. Laat ~50 μL DMEM/F12 op de inlaat- en uitlaatpoorten vallen.
    3. Aspirateer het Intermediate Mesoderm Induction medium uit elke put van de 12-well plaat.
      OPMERKING: Elke put aan het einde van de differentiatie geeft ongeveer 1,5 miljoen IM-cellen.
    4. Voeg 1 ml Trypsin-EDTA toe aan elk putje van de 12-wellsplaat en incubeer bij 37 °C gedurende 5 min.
    5. Schraap de cellen voorzichtig met behulp van een cellifter en pipetteer op en neer om de cellen te dissociëren met behulp van een P1000. Voeg 2 ml Trypsine Neutralisatie-oplossing (aanvullende tabel S1) toe aan elk putje. Breng de cellen over naar een conische buis van 50 ml. Breng het celsuspensievolume op 50 ml met DMEM/F12 en centrifugeer gedurende 5 minuten op 200 × g .
    6. Aspirateer het supernatant. Resuspendeer de cellen in 500 μL Intermediate Mesoderm Inductie medium om ongeveer 3 miljoen cellen/500 μL te verkrijgen. Tel de cellen met een hemocytometer.
    7. Houd de chip stevig vast met de P200-barrièrepunt bevestigd aan de aspirator, uit de buurt van de uitlaat van het urinekanaal (boven). Injecteer stevig 25 μL celsuspensie met ongeveer 112.500 IM-cellen in het urinekanaal (boven) van de chip en zuig het medium voorzichtig op uit de periferie van de uitlaat.
    8. Controleer onder de microscoop op bubbels of een ongelijke IM-celzaaidichtheid. Voeg 3 ml PBS toe aan de cartridge van de chiphouder. Incubeer bij 37 °C gedurende 3 uur.
    9. Spoel beide kanalen met 200 μL van hun respectieve celkweekmedium terwijl ze zorgvuldig de periferie van de chipuitlaten opzuigen om achterwaartse stroming van het gebruikte medium en celafval te voorkomen.
    10. Bevestig lege P200-barrièrepunten in beide uitgangen van de urine- en capillaire kanalen. Pipetteer 200 μL endotheelonderhoudsmedium en injecteer de helft ervan in de capillaire kanaalinlaat. Laat de pipetpunt in de inlaat los, zodat zowel de inlaat als de uitlaat van het kanaal nu zijn bevestigd aan pipetpunten gevuld met medium.
    11. Pipetteer 200 μL IM-onderhoudsmedium en injecteer de helft in de urinekanaalinlaat. Laat de pipetpunt in de inlaat los, zodat zowel de inlaat als de uitlaat van het kanaal nu zijn bevestigd aan pipetpunten gevuld met medium. Incubeer de chips met tips ingebed bij 37 °C 's nachts.
  3. Sluit chips aan op organ chip bioreactor om vloeistofstroom en mechanische spanning toe te passen.
    1. Verwijder P200-tips uit de urine- en capillaire kanalen. Voeg druppels van de respectieve media toe aan de in- en uitlaat van de urine- en capillaire kanalen om uitdroging te voorkomen.
    2. Voeg 3 ml warm podocyteninductiemedium (aanvullende tabel S1) toe aan het urine-inlaatreservoir. Voeg 3 ml warm endotheelonderhoudsmedium toe aan het capillaire inlaatreservoir.
    3. Voeg 300 μL warm Podocyte Inductiemedium toe aan het uitlaatreservoir van het urinekanaal direct boven de uitlaatpoort. Voeg 300 μL warm Enddothelial Maintenance-medium toe aan het capillaire kanaaluitlaatreservoir direct boven de uitlaatpoort.
    4. Schuif de pods op de lade en in de Organ Chip Bioreactor.
    5. Gebruik de draaiknop op de organchipbioreactor om de Prime Cycle (2 min) te selecteren en te starten. Inspecteer de onderkant van de pod visueel op kleine druppeltjes bij alle vier de vloeistofpoorten.
    6. Om vloeistof-vloeistofcontact tussen de Pod-onderkant en microfluïdische chippoorten te bereiken, schuift u de chipdrager voorzichtig in de Pod. Druk zachtjes op het tabblad van de chipdrager in en omhoog. Aspirateer overtollig medium van het chipoppervlak.
    7. Stel het debiet van de organchipbioreactor in op 60 μL/h. Stel de cyclische belasting in op 10% bij 0,4 Hz. Gebruik de draaiknop op de organchipbioreactor om de regelcyclus te selecteren en 2 uur te laten draaien.
    8. Inspecteer de uitlaatreservoirs visueel op een toename van het mediumniveau.
    9. Gebruik de draaiknop op de Organ Chip Bioreactor om de regelcyclus te selecteren.

7. Dagen 17-21 en daarna: podocyteninductie en chiponderhoud

  1. Zuig het medium uit de uitlaatreservoirs van het urinekanaal diagonaal weg van de poort, maar houd elke dag van de kweek een medium in het reservoir. Vul het urinekanaalinlaatreservoir aan met maximaal 3 ml Podocyte Inductiemedium om de 2 dagen gedurende 5 dagen.
    1. Na 5 dagen aspirateer het medium uit het urinekanaal, maar houd wat medium in het reservoir. Vul het inlaatreservoir van het urinekanaal dagelijks aan met 3 ml Podocyte Maintenance-medium.
  2. Haal het medium uit de capillaire kanaaluitlaatreservoirs diagonaal weg van de haven, maar houd elke dag van cultuur een medium in het reservoir. Vul het capillaire kanaalinlaatreservoir dagelijks aan met maximaal 3 ml endotheelonderhoudsmedium.

8. Functionele assay en immunofluorescentie beeldvorming

OPMERKING: Zie aanvullend bestand 1 voor meer informatie over flowcytometrieanalyse, ELISA voor chipafval en mRNA-isolatie.

  1. Functionele assay (moleculaire filtratie) met behulp van inuline en albumine
    1. Adem het medium uit het capillaire kanaaluitlaatreservoir diagonaal weg van de poort, maar houd een medium in het reservoir. Vervang door 3 ml endotheelonderhoudsmedium aangevuld met inuline en albumine (aanvullende tabel S1) gedurende 6 uur.
    2. Meet met behulp van een serologische pipet van 5 ml het volume (in ml) van het medium uit het urinekanaal en breng over naar een conische buis van 15 ml. Wikkel de buis in aluminiumfolie om te beschermen tegen licht en minimaliseer fotobleaching van de fluorofoor-geconjugeerde inuline en albumine. Vul het reservoir aan met 3 ml Podocyte Maintenance medium.
    3. Bereid een stockoplossing van inuline in Podocyte Maintenance medium. Bereid vanaf 25 μg/ml inuline acht normen voor inuline via een 2x seriële verdunning in podocytenonderhoudsmedium.
    4. Bereid op dezelfde manier een stockoplossing van albumine in Podocyte Maintenance medium. Bereid vanaf 150 μg/ml albumine acht standaarden van albumine voor via een 2x seriële verdunning in Podocyte Maintenance medium.
    5. Pipetteer in duplicaat 100 μL van elke standaard inulineconcentratie in elk putje van een zwarte plaat met 96 putten (of 16 totale putten inuline). Pipetteer in duplicaat 100 μL van elke standaard albumineconcentratie in elke put van dezelfde 96-well plaat (16 totale putten albumine). Pipet in duplicaat 100 μL Podocyte Maintenance medium om te dienen als de blanco (of twee totale putten van Podocyte Maintenance medium).
    6. Pipetteer in duplicaat 100 μL effluentmedium uit het urinekanaal in elke put van dezelfde 96-well plaat. Pipetteer in duplicaat 100 μL effluentmedium uit het capillaire kanaal.
    7. Steek de plaat in de plaatlezer en meet de fluorescentie voor albumine bij excitatie 550 nm en emissie 615 nm. Meet dezelfde plaat voor inuline bij excitatie 513 nm en emissie 577 nm.
    8. Op basis van de gegenereerde gegevens wordt het gemiddelde van de dubbele metingen (per chip) uitgevoerd. Trek de lege waarde die overeenkomt met die plaatlezing af van de rest van de gegevens op het werkblad.
    9. Plot de waarden die overeenkomen met de albuminestandaarden om een standaardcurve te creëren met concentratie [μg/ml] op de x-as en fluorescentie op de y-as. Zet de waarden uit die overeenkomen met de inulinenormen om een standaardcurve te creëren met concentratie [μg/ml] op de x-as en fluorescentie op de y-as.
    10. Gebruik een softwarepakket voor statistische analyse en lineaire interpolatie om de urineconcentratie van respectievelijk inuline en albumine in het effluentmedium van de chips te bepalen.
    11. Bepaal de urineklaring van inuline/albumine uit de chips met behulp van vergelijking (1)2:
      Urineklaring = ([U] × UV) / [P] (1)
      Waarbij [U] de urineconcentratie is vanaf stap 8.1.10, UV het volume van het verzamelde urinekanaal effluent uit stap 8.1.2 en [P] de capillaire concentratie van inuline of albumine (10 μg/ml inuline of 100 μg/ml albumine).
  2. Immunofluorescentie beeldvorming
    1. Injecteer een lege P200-tip in de uitlaatpoorten van de urine- en capillaire kanalen. Om de cellen te fixeren, pipetteer 200 μL van 4% formaldehyde en injecteer de helft ervan in de onderste kanaalinlaat. Laat de pipetpunt in de inlaat los.
    2. Pipetteer 200 μL van 4% formaldehyde en injecteer de helft ervan in de urinekanaalinlaat. Laat de pipetpunt in de inlaat los, zodat zowel de inlaat als de uitlaat van het kanaal nu zijn bevestigd aan pipetpunten gevuld met fixatief.
    3. Incubeer de chips op kamertemperatuur gedurende 20 min.
    4. Gooi na 20 minuten alle pipetpunten weg. Injecteer schone, lege P200-tips in de uitlaatpoorten van de urine- en capillaire kanalen. Om de cellen te permeabiliseren, pipetteer u 200 μL van 0,125% Triton X-100 / PBS en injecteert u de helft ervan in de capillaire kanaalinlaat. Laat de pipetpunt in de inlaat los.
    5. Pipetteer 200 μL van 0,125% Triton X-100/PBS en injecteer de helft ervan in de urinekanaalinlaat. Laat de pipetpunt in de inlaat los. Incubeer de chip bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
    6. Gooi alle pipetpunten weg. Injecteer schone, lege P200-tips in de uitlaatpoorten van de urine- en capillaire kanalen. Om de cellen te blokkeren, pipetteer u 200 μL 1% runderserumalbumine (BSA) in 0,125% Triton X-100/PBS en injecteert u de helft ervan in de capillaire kanaalinlaat. Laat de pipetpunt in de inlaat los.
    7. Pipetteer 200 μL van 1% BSA in 0,125% Triton X-100/PBS en injecteer de helft ervan in de urinekanaalinlaat. Laat de pipetpunt in de inlaat los. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
    8. Gooi alle pipetpunten weg. Was beide kanalen 3x door 200 μL van 0,125% Triton X-100/PBS in elk kanaal te pipetteren en gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te broeden.
    9. Bereid 100 μL primair antilichaam per kanaal met de door de fabrikant aanbevolen verdunning in 0,125% Triton X-100/PBS. Injecteer schone, lege P200-tips in de uitlaatpoorten van de urine- en capillaire kanalen. Pipetteer 100 μL primair antilichaam en injecteer de helft in de respectievelijke kanalen. Laat de pipetpunt in de inlaat los.
    10. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of, voor betere resultaten, 's nachts bij 4 °C.
      OPMERKING: Meerdere primaire antilichamen kunnen tegelijkertijd worden toegepast; de primaire antilichaamoplossing moet echter worden verdund volgens de instructies van de fabrikant.
    11. Was de kanalen 3 x 10 min zoals beschreven in stap 8.2.8.
    12. Bereid 100 μL secundair antilichaam per kanaal met de door de fabrikant aanbevolen verdunningsfactor in 0,125% Triton X-100/PBS. Injecteer schone, lege P200-tips in de uitlaatpoorten van de urine- en capillaire kanalen. Pipetteer 100 μL secundair antilichaam en injecteer de helft in de respectieve kanalen. Laat de pipetpunten in de inlaat los. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Elk secundair antilichaam moet afzonderlijk worden aangebracht. Was minstens 3 x 10 minuten tussen elke toepassing volgens stap 8.2.8.
    13. Was de kanalen 3 x 10 min zoals beschreven in stap 8.2.8.
    14. Spoel beide kanalen eenmaal met 200 μL gedestilleerd water terwijl de restvloeistof uit de omtrek van de chipuitlaatpoorten wordt gehaald.
    15. Injecteer schone, lege P200 in de uitlaatpoorten van de urine- en capillaire kanalen. Om de cellen tegen te gaan, pipetteer u 200 μL 4',6-diamidino-2-fenylboon (DAPI, 1:1.000 verdunning in gedestilleerd water) en injecteert u de helft ervan in de capillaire kanaalinlaat. Laat de pipetpunt los in de inlaat en pipetteer 200 μL DAPI en injecteer de helft ervan in de urinekanaalinlaat. Laat de pipetpunt los in de inlaat en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    16. Gooi alle pipetpunten weg. Injecteer schone, lege P200-tips in de uitlaatpoorten van de urine- en capillaire kanalen. Om de cellen tegen te gaan, pipetteer u 200 μL falloïdine (1:1.000 verdunning in PBS zonder Ca2+ en Mg2+) en injecteert u de helft ervan in de capillaire kanaalinlaat en laat u de pipetpunt in de inlaat los. Pipetteer 200 μL falloidine (1:1.000 verdunning in PBS zonder Ca2+ en Mg2+) en injecteer de helft ervan in de urinekanaalinlaat en laat de pipetpunt in de inlaat los. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
    17. Spoel de kanalen 3x met 200 μL PBS zonder Ca2+ en Mg2+, en zuig overtollig vocht uit de periferie van de uitlaatpoorten.
    18. Visualiseer de chips.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier laten we zien dat een functioneel 3D in vitro model van de glomerulus kan worden gevasculariseerd en gepitheliseerd vanuit een isogene bron van menselijke iPS-cellen. In het bijzonder biedt dit protocol instructies over het toepassen van menselijke iPS-celtechnologie, met name hun vermogen om te differentiëren in gespecialiseerde celtypen, om nierglomerulair epitheel (podocyten) en vasculair endotheel (viEC's) te genereren die kunnen worden geïntegreerd met microfluïdische apparaten om de structuur en funct...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit rapport schetsen we een protocol om vasculair endotheel en glomerulair epitheel (podocyten) af te leiden uit een isogene menselijke iPS-cellijn en het gebruik van deze cellen om een 3D-orgaan-op-een-chip-systeem te ontwikkelen dat de structuur, weefsel-weefselinterface en moleculaire filtratiefunctie van de nierglomerulus nabootst. Deze glomeruluschip is uitgerust met endotheel en glomerulair epitheel die samen een barrière vormen om selectief moleculen te filteren.

Onderzoekers die ge...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.M. is een uitvinder van een patent met betrekking tot podocytendifferentiatie van menselijke iPS-cellen. De andere auteur heeft niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Pratt school of Engineering aan de Duke University, de afdeling Nefrologie aan de Duke Department of Medicine, een Whitehead Scholarship in Biomedical Research en een Genentech Research Award voor S. Musah. Y. Roye is een ontvanger van de Duke University-Alfred P. Sloan Foundation Scholarship en William M. "Monty" Reichert Graduate Fellowship van Duke University's Department of Biomedical Engineering. De DU11 (Duke University kloon #11) iPS-cellijn werd gegenereerd in de Duke iPSC Core Facility en aan ons verstrekt door het Bursac Lab aan de Duke University. De auteurs bedanken N. Abutaleb, J. Holmes, R. Bhattacharya en Y. Zhou voor technische assistentie en nuttige discussies. De auteurs willen ook leden van het Musah Lab bedanken voor hun nuttige opmerkingen over het manuscript. De auteurs bedanken het Segura Lab voor de gift van een Acuri C6 flowcytometer.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Antilichamen
Alexa Fluor 488- en Alexa Fluor 594-geconjugeerde secundaire antilichamenThermo/Life TechnologiesA32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015
Collageen IVThermo/Life Technologies14-9871-82
NephrinProgenGP-N2
PECAM-1R&D SystemsAF806
PodocinAbcamab50339
VE-CadherineSanta Cruzsc-9989
Basement membrane matrices
Corning Fibronectin, HumanCorning356008Basement membrane (3)
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragmentIwai North AmericaN8922012Basement membrane matrix (2)
Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vialBD Biosciences354277Basement membrane matrix (1); may show lot-to-lot variation
Cellen
DU11 humane iPS cellenThe DU11 (Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. The line has been tested and found to be free of mycoplasma (last test in November 2021) and karyotype abnormalities (July 2019)
Cultuur medium groeifactoren en mediasupplementen
0.5M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020
2-MercaptoethanolThermo/Life Technologies21985023
Albumine uit bovien serum, Texas Red-conjugaatThermo/Life TechnologiesA23017
All-trans retinoïnezuur (500 mg)Stem Cell Technologies72262
B27 serum-vrij supplementThermo/Life Technologies17504044
B-27 supplement (50x) zonder Vitamine AThermo/Life Technologies12587010
Bovine serum albumineSigma-AldrichA9418
CHIR99021Stemgent04-0004May show lot-to-lot variation
Complete medium kit met CultureBoost-RCell Systems4Z0-500-RPodocyte onderhoudsmedia
DMEM/F12Thermo/Life Technologies12634028
DMEM/F12 met GlutaMAX supplementThermo/Life Technologies10565042DMEM/F12 met glutamine
Forskoline (Adenylyl cyclase activator)Abcamab120058
GlutaMAX supplementThermo/Life Technologies35050061glutamine supplement
Heat-inactiveerd FBSThermo/Life Technologies10082147
Heparine oplossingStem Cell Technologies7980
Human Activin AThermo/Life TechnologiesPHC9544
Human BMP4Preprotech120-05ET
Human BMP7Thermo/Life TechnologiesPHC9544
Human VEGFThermo/Life TechnologiesPHC9394
Inuline-FITCSigma-AldrichF3272
mTeSR1 mediumStem Cell Technologies05850Human iPS cell cultuurmedia (CCM). Voeg 5x supplement toe volgens de fabrikant. Human iPS CCM kan tot 6 maanden worden bewaard bij -20 °C.
N-2 Supplement (100x)Thermo/Life Technologies17502048
Neurobasal mediaThermo/Life Technologies21103049Lateraal mesoderm basaal media
PBS (Fosfaat-gebufferde zoutoplossing)Thermo/Life Technologies14190-250
Penicilline-streptomycine, vloeibaar (100x)Thermo/Life Technologies15140-163
ROCK inhibitor (Y27632)Tocris1254
StemPro-34 SFMThermo/Life Technologies10639011Endotheel celcultuur medium (CCM). Voeg supplement toe volgens de fabrikant. Endotheel CCM kan tot twee weken worden bewaard bij 4 °C of -20 °C voor maximaal 6 maanden.
TGF-Beta inhibitor (SB431542)Stem Cell Technologies72234
Enzymen en andere reagentia
AccutaseThermo/Life TechnologiesA1110501Celloslaap buffer
Dimethyl Suloxide (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Ethanol oplossing, 70% (vol/vol), biotechnologisch graadVWR97065-058
Paraformaldehyde (PFA)Thermo/Life Technologies28906
Steriliseerd gedistilleerd waterThermo/Life Technologies15230162
Triton X-100VWR97062-208
Apparatuur
Trypsine EDTA, 0.05%Thermo/Life Technologies25300-120
(Orb) Hub moduleEmulateORB-HM1
100mm x 15 mm ronde petrischaalFisherbrandFB087579B
120 x 120 mm vierkante celcultuur schotelVWR688161
Accuri C6BD Biosciences
Aspiratie pipetten, individueel verpaktCorning29442-462
Aspiratie UnitSP Bel-ArtF19917-0150
Avanti J-15R CentrifugeBeckman CoulterB99516
Conische centrifugeerbuis, 15 mLCorning352097
Conische centrifugeerbuis, 50 mLCorning352098
EVOS M700

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, L., et al. A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice. Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).
  2. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), 1-12 (2017).
  3. Petrosyan, A., et al. A glomerulus-on-a-chip to recapitulate the human glomerular filtration barrier. Nature Communications. 10 (1), 3656(2019).
  4. Hass, R., Kasper, C., Böhm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling. 9, 12(2011).
  5. Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: when do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
  6. Da Sacco, S., et al. A novel source of cultured podocytes. PloS One. 8 (12), 81812(2013).
  7. Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2(2015).
  8. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of cardiovascular pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  9. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  10. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).
  11. Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions. Journal of Visualized Experiments. (161), e61299(2020).
  12. Roye, Y. A personalized glomerulus chip engineered from stem cell-derived epithelium and vascular endothelium. Micromachines. 12 (8), 967(2021).
  13. Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. The American Journal of Pathology. 160 (1), 131-139 (2002).
  14. Ruotsalainen, V., et al. Nephrin is specifically located at the slit diaphragm of glomerular podocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 7962-7967 (1999).
  15. Privratsky, J. R., Newman, P. J. PECAM-1: regulator of endothelial junctional integrity. Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).
  16. Menon, M. C., Chuang, P. Y., He, C. J. The glomerular filtration barrier: components and crosstalk. International Journal of Nephrology. 2012, 749010(2012).
  17. Abutaleb, N. O., Truskey, G. A. Differentiation and characterization of human iPSC-derived vascular endothelial cells under physiological shear stress. STAR Protocols. 2 (2), 100394(2021).
  18. Pammolli, F., Magazzini, L., Riccaboni, M. The productivity crisis in pharmaceutical R&D. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (6), 428-438 (2011).
  19. Atchison, L., et al. iPSC-derived endothelial cells affect vascular function in a tissue-engineered blood vessel model of Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Stem Cell Reports. 14 (2), 325-337 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Kidney Glomerulus ChipInduced Pluripotent Stem CellsIsogenic Organ ChipGlomerular Filtration BarrierPodocyte DifferentiationVascular Endothelial CellsMicrofluidic ChipNephrotoxicity TestingPrecision MedicinePatient Specific Disease Modeling

Related Articles