Labelvrije beeldvorming met superresolutie, mogelijk gemaakt door trillingsbeeldvorming van gezwollen weefsel en analyse

Samenvatting

Door de hydrogelchemie van monsterexpansie te combineren met labelvrije chemisch-specifieke gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie, beschrijft het protocol hoe labelvrije volumetrische beeldvorming met superresolutie in biologische monsters kan worden bereikt. Met een aanvullend algoritme voor beeldsegmentatie op basis van machine learning werden eiwitspecifieke beelden met meerdere componenten in weefsels zonder antilichaamlabeling verkregen.

Samenvatting

Het universele gebruik van fluorescentiemicroscopie, met name superresolutiemicroscopie, heeft de kennis over de moderne biologie enorm verbeterd. Omgekeerd brengt de vereiste van fluorofooretikettering in fluorescerende technieken aanzienlijke uitdagingen met zich mee, zoals fotobleken en niet-uniforme etikettering van fluorescerende sondes en langdurige monsterverwerking. In dit protocol worden de gedetailleerde werkprocedures voor vibrationele beeldvorming van gezwollen weefsel en analyse (VISTA) gepresenteerd. VISTA omzeilt obstakels die verband houden met fluoroforen en bereikt labelvrije volumetrische beeldvorming met superresolutie in biologische monsters met een ruimtelijke resolutie tot 78 nm. De procedure wordt tot stand gebracht door cellen en weefsels in hydrogel in te bedden, de hybride van het hydrogelmonster isotroop uit te breiden en endogene eiwitverdelingen te visualiseren door middel van vibrationele beeldvorming met gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie. De methode wordt gedemonstreerd op zowel cellen als hersenweefsel van muizen. Er werden sterk correlatieve VISTA- en immunofluorescentiebeelden waargenomen, die de eiwitoorsprong van beeldvormingsspecificiteiten valideerden. Door gebruik te maken van een dergelijke correlatie werd een op machine learning gebaseerd algoritme voor beeldsegmentatie getraind om multi-component voorspelling van kernen, bloedvaten, neuronale cellen en dendrieten te bereiken op basis van labelvrije muizenhersenbeelden. De procedure werd verder aangepast om pathologische polyglutamine (polyQ) aggregaten in cellen en amyloïde-bèta (Aβ) plaques in hersenweefsel met hoge doorvoer te onderzoeken, wat het potentieel voor grootschalige klinische monsters rechtvaardigt.

Inleiding

De ontwikkeling van optische beeldvormingsmethoden heeft een revolutie teweeggebracht in het begrip van de moderne biologie, omdat ze ongekende ruimtelijke en temporele informatie bieden van doelen op verschillende schalen, van subcellulaire eiwitten tot hele organen¹. Onder hen is fluorescentiemicroscopie de meest ingeburgerde, met een groot palet van organische kleurstoffen met hoge extinctiecoëfficiënten en kwantumopbrengsten², gebruiksvriendelijke genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten³ en superresolutiemethoden zoals STED, PALM en STORM voor het afbeelden van structuren op nanometerschaal ^4,5. Bovendien maken recente ontwikkelingen op het gebied van monstertechniek en conserveringschemie, die monsters uitbreiden die zijn ingebed in zwellende polymeerhydrogels ^6,7,8, subdiffractie met beperkte resolutie mogelijk op conventionele fluorescentiemicroscopen. Typische expansiemicroscopie (ExM) verbetert bijvoorbeeld effectief de beeldresolutie met vier keer met viervoudige isotrope monsterexpansie⁷.

Ondanks de voordelen deelt fluorescentiemicroscopie met superresolutie beperkingen die voortkomen uit fluorofoorlabeling. Ten eerste brengen fotobleken en inactivatie van fluoroforen het vermogen voor repetitieve en kwantitatieve fluorescentie-evaluaties in gevaar. Fotobleken is een onvermijdelijke gebeurtenis wanneer licht elektronen in elektronisch opgewonden toestanden blijft pompen⁹. Ten tweede is het labelen van de fluoroforen naar de gewenste doelen niet altijd een eenvoudige taak. Immunokleuring vereist bijvoorbeeld een lang en moeizaam monstervoorbereidingsproces en belemmert de beeldvormingsdoorvoer¹⁰. Het kan ook artefacten introduceren als gevolg van inhomogene antilichaamlabeling, vooral diep in weefsels¹¹. Bovendien kunnen de juiste labelstrategieën die gericht zijn op fluoroforen voor de gewenste eiwitten onderontwikkeld zijn. Er waren bijvoorbeeld uitgebreide screenings nodig om effectieve antilichamen voor Aβ-plaques¹² te vinden. Kleinere organische kleurstoffen, zoals Congorood, hebben vaak een beperkte specificiteit en kleuren alleen de kern van de Aβ-plaque. Het is daarom zeer wenselijk om een labelvrije superresolutiemodaliteit te ontwikkelen die de nadelen van fluorofoor-labeling omzeilt en aanvullende beeldvorming met hoge resolutie biedt van cellen tot weefsels en zelfs tot grootschalige menselijke monsters.

Raman-microscopie biedt labelvrij contrast voor chemisch-specifieke structuren en brengt de verdeling van anders onzichtbare chemische bindingen in kaart door te kijken naar de geëxciteerde trillingsovergangen¹³. In het bijzonder is aangetoond dat gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) beeldvorming op labelvrije of piepklein gelabelde monsters een vergelijkbare snelheid en resolutie heeft als fluorescentiemicroscopie^14,15. Een gezond hersengebied is bijvoorbeeld gemakkelijk onderscheiden van het tumorgeïnfiltreerde gebied in weefsels van mensen en muizen^16,17. Aβ-plaques werden ook duidelijk in beeld gebracht door zich te richten op eiwit CH_3-vibratie (2940 ^cm-1) en amide I (1660 ^cm-1) op een vers ingevroren hersenplak zonder enige etikettering¹⁸. Raman-verstrooiing biedt daarom een robuust labelvrij contrast dat de beperkingen van fluoroforen overwint. De vraag werd toen hoe men superresolutiecapaciteit kan bereiken met behulp van Raman-verstrooiing, die structurele details op nanoschaal en functionele implicaties in biologische monsters zou kunnen onthullen.

Hoewel er uitgebreide inspanningen zijn geleverd om superresolutie voor Raman-microscopie te bereiken met elegante optische instrumentaties, is de resolutieverbetering op biologische monsters vrij beperkt geweest 19,20,21. Hier, op basis van de recente werken^22,23, presenteren we een protocol dat een sample-expansiestrategie combineert met gestimuleerde Raman-verstrooiing voor superresolutie-labelvrije vibrationele beeldvorming, genaamd Vibrational Imaging of Swelled Tissues and Analysis (VISTA). Eerst werden cellen en weefsels ingebed in hydrogelmatrices via een geoptimaliseerd eiwit-hydrogelhybridisatieprotocol. De hydrogelweefselhybriden werden vervolgens geïncubeerd in wasmiddelrijke oplossingen voor delipidatie, gevolgd door expansie in water. De geëxpandeerde monsters werden vervolgens in beeld gebracht door een gewone SRS-microscoop door te richten op CH_3-trillingen van achtergebleven endogene eiwitten. Dankzij de labelvrije beeldvormingsfunctie omzeilt VISTA fotobleken en inhomogene labeling als gevolg van fluorofoor-etikettering, met een veel hogere verwerkingsdoorvoer van monsters. Dit is ook de eerste gerapporteerde beeldvorming onder de 100 nm (tot 78 nm) zonder labels. Er is geen extra optische instrumentatie nodig naast de typische SRS-opstelling^22,24, waardoor het gemakkelijk toepasbaar is. Met correlatieve VISTA- en immunofluorescentiebeelden werd een gevestigd machine-learning beeldsegmentatiealgoritme getraind^25,26 om eiwitspecifieke multiplexbeelden te genereren uit enkelkanaals beelden. De methode werd verder toegepast om Aβ-plaques in hersenweefsel van muizen te onderzoeken, wat een holistisch beeld opleverde dat geschikt was voor subfenotypering op basis van de fijne beelden van de plaquekern en perifere filamenten omgeven door celkernen en bloedvaten.

Protocol

Alle dierprocedures die in dit onderzoek zijn uitgevoerd, zijn goedgekeurd door het California Institute of Technology Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en de protocolprocedures voldeden aan alle relevante ethische voorschriften.

1. Bereiding van voorraadoplossingen voor fixatie en monsterexpansie

1. Bereid 40 ml fixatieoplossing door eerst 12 g acrylamide (30% g/v) vast op te lossen in 26 ml nucleasevrij water. Voeg vervolgens 10 ml 16% PFA-stockoplossing toe aan het mengsel. Voeg ten slotte 4 ml 10x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) toe. De bereide oplossing kan maximaal 2 weken bij 4 °C worden bewaard.
   OPMERKING: Acrylamide is gevaarlijk, dus de stap van het oplossen van acrylamide in vaste stof in water moet in een zuurkast worden gedaan.
2. Bereid geleeroplossing (voorraad X) door 70 mg natriumacrylaat (7% g/v), 200 mg acrylamide (20% w/v) en 50 μl N, N'-methyleenbisacrylamide (0,1% g/v) op te lossen in 420 μl ultrapuur water. Voeg aan het einde 57 μL steriel gefilterde 10x PBS (pH 7,4) toe en bewaar deze oplossing maximaal 1 week bij -20 °C.
   OPMERKING: Vermijd vaste stof van natriumacrylaat die klonten vormt; Zorg ervoor dat het gebruikte natriumacrylaat de vorm heeft van dispersieve poeders. De voorraad die X heeft gemaakt, zal een kleurloze vloeistof zijn; Als de vloeistof er lichtgeel uitziet, zorg dan voor nieuw natriumacrylaat.
3. Bereid de polymerisatie-initiatoroplossing voor door 1 g ammoniumpersulfaat (APS, 10% g/g) op te lossen in 9 ml nucleasevrij water. Bereid op dezelfde manier een polymerisatieversnelleroplossing door 1 g tetramethylethyleendiamine (TEMED, 10% w/w) op te lossen in 9 ml nucleasevrij water. Verdeel de resulterende oplossingen en bewaar bij -20 °C.
4. Bereid 50 ml denatureringsbuffer voor door 2,88 g natriumdodecylsulfaat (SDS, 200 mM), 0,584 g natriumchloride (200 mM) en 2,5 ml 1M Tris-HCl-buffer (50 mM, pH 8) op te lossen in nucleasevrij water.
   OPMERKING: De concentratie van SDS ligt dicht bij de verzadigingstoestand. Enige kristallisatie in de buffer is normaal. Door het licht op te warmen tot 37 °C kan de oplossing helder en klaar voor gebruik worden.

2. Voorbereiding van monsters van zoogdiercellen

1. Zaai 3,5 x 10⁴ HeLa-cellen op een 12 mm borosilicaatdekglaasje (#1,5) in een plaat met 24 putjes en kweek de cellen vervolgens in 400 μL Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine-antibiotica (volledige DMEM) onder een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂ bij 37 °C.
2. Om cellen in verschillende mitotische stadia te verkrijgen, incubeert u de cellen in volledige DMEM tot 60% confluentie. Behandel de cellen vervolgens gedurende 20 uur met DMEM zonder foetaal runderserum om de celstadia te synchroniseren. Schakel na synchronisatie het medium voor de cellen om DMEM te voltooien en incubeer nog eens 2-6 uur om de verschillende stadia van mitose aan te pakken.
3. Was de HeLa-cellen op dekglaasjes met steriel PBS en incubeer ze met fixatieoplossing (4% PFA, 30% acrylamide [AA] in PBS) bij 37 °C gedurende 7-8 uur alvorens verder te verwerken.
   OPMERKING: Een hogere fixatietemperatuur in combinatie met een hoge concentratie acrylamide helpt de intermoleculaire verknoping tussen eiwitten tijdens de fixatieprocessen te doven en er wordt gemeld dat het de gedetailleerde ultrastructuren van eiwitten behoudt⁸.
4. Voor cellen met polyQ-aggregaten, laat de cellen in volledige DMEM groeien totdat ze een samenvloeiing van 70%-90% bereiken. Na het veranderen in nieuw volledig DMEM, transfecteert 1 μg plasmide coderend mHtt97Q-GFP in de cellen gebruikend transfectieagent (details in Lijst van Materialen). Voer transfectie uit volgens het protocol van de fabrikant.
5. Na 24-48 uur transfectie verwijdert u de kweekmedia en voegt u 800 μL fixatieoplossing (4% PFA, 30% AA) toe aan de dekglaasjes met cellen. Incubeer de dekglaasjes gedurende 6-8 uur bij 37 °C. Was het dekglaasje 3x met PBS en de resulterende celmonsters zijn klaar voor verdere verwerking.

3. Voorbereiding van hersenmonsters van muizen

1. Koop C57BL/6J-muizen (6 tot 8 weken oud, mannetje en vrouwtje, zes muizen) en Alzheimermuizen (9 maanden oud, vrouwtje, drie muizen) bij commerciële bronnen (details in Materiaaltabel). Voer euthanasie uit via kooldioxide-narcose volgens standaardprotocol²⁷. Kortom, plaats muizen in een kamer en vul de kamer met een stroom van 100% CO₂ in de orde van grootte van 30%-70% van het volume van de kamer/min en houd de stroom aan gedurende ten minste 1 minuut na klinische dood.
2. Na het bevestigen van de humane euthanasie, onthoofdt u de muizen snel met een schaar. Leg de schedel bloot met een grote incisie door de huid langs de middellijn. Trek de huid naar de neus van het dier om de schedel volledig bloot te leggen.
3. Knip de schedel langs de middellijn open met een fijne schaar en pel de twee helften van de schedel opzij weg. Gebruik een pincet om de hersenen uit te scheppen in een petrischaaltje op ijs met PBS. Was de verse muizenhersenen met ijskoude PBS en breng de hersenen over naar 10 ml fixatiebuffer (4% PFA, 30% AA).
4. Incubeer de muizenhersenen in een fixatiebuffer bij 4 °C gedurende 24-48 uur en breng ze vervolgens 's nachts over naar 37 °C. Snijd na het wassen met steriel PBS de muizenhersenen met behulp van een vibratoom in secties van 150 μm en bewaar in PBS bij 4 °C.

4. Inbedding in hydrogel, denaturatie en uitbreiding van cel- en weefselmonsters

1. Zorg ervoor dat de monsters gedurende de vereiste tijd in de fixatiebuffer zijn geïncubeerd, zoals hierboven aangegeven. Ontdooi voorraad X, vrije radicaleninitiator en versneller-voorraadoplossingen en houd ze tijdens het hele proces in de ijskast.
   OPMERKING: Onvoldoende incubatietijd kan leiden tot een verminderd aantal eiwitten dat op de hydrogelhybride wordt vastgehouden en daarom een afname van het signaal veroorzaken.
2. Pak het dekglaasje met cellen op en plaats het met een pincet op een glasplaatje. Pluk de hersenschijfjes (150 μm dik) en leg ze met een zachte wollen kwast op een andere glasplaat en zorg ervoor dat ze plat zijn. Verwijder overtollige vloeistof die bij de monsters wordt geleverd.
3. Stapel twee dekglaasjes (#1.5) op elkaar door er druppels water tussen toe te voegen, aan beide zijden van het monster op het glasplaatje om een geleerkamer te maken. Plaats het glasplaatje met het monster naar boven op een ijskoud warmteblok en koel het gedurende 1 minuut af tot 4 °C.
4. Voeg 10% (w/w) TEMED toe aan voorraad X en vervolgens 10% APS-oplossing. Draai snel en laat binnen 1 minuut na het mengen de resulterende oplossing langzaam in de kamer op de monsters vallen om het oppervlak van het monster te bedekken, waarbij luchtbellen worden vermeden. Bewaar de oplossing en de monsters op ijs (of een ijskoud warmteblok) om gelvorming (hoge polymerisatiegraad) te voorkomen voordat u ze aan het monster toevoegt.
5. Zodra het monster volledig is ondergedompeld in de oplossing, plaatst u een plat, transparant, met film bedekt dekglaasje op het monster als deksel voor de kamer. Laat de kamer nog 1 minuut op ijs of een ijskoud warmteblok staan voordat u deze gedurende 30 minuten in een bevochtigingsbroedmachine bij 37 °C incubeert.
6. Haal de geleerkamer op het glasplaatje uit de 37 °C-incubator. Een niet-transparante gel moet in acht worden genomen na het verwijderen van het deksel. Haal de gel op door met een scheermesje te snijden of plaats het glasplaatje 15 minuten in de denatureringsbuffer bij kamertemperatuur. De gel zal zich losmaken van de glasplaat.
7. Incubeer de geïsoleerde gel in denatureringsbuffer onder hitteomstandigheden om verdere denaturatie en delipidatie te bereiken. Denatureer de celmonsters gedurende 1 uur bij 95 °C. Voor 150 μm dikke hersenschijfjes, denatureren bij 70 °C gedurende 3 uur, gevolgd door 95 °C gedurende 1 uur.
   OPMERKING: De gel kan krullend worden wanneer deze voor het eerst wordt geïncubeerd met denatureringsbuffer bij kamertemperatuur. Het is normaal en wordt vlak na denaturatie bij hoge temperatuur. Bij het werken met dikkere weefselmonsters is een langere denaturatietijd nodig.
8. Was het gedenatureerde monster na de warmtebehandeling 3x met PBS gedurende 10 minuten. Op dit punt zou de gel moeten zijn uitgebreid tot ongeveer 1,5 keer de oorspronkelijke grootte. Incubeer de gewassen gel met ultrapuur water in een grote container (minstens 20 keer het volume van de gel) om een hogere expansieverhouding te bereiken. Ververs het water elke 1 uur 3x en laat het monster een nacht in het donker staan. De resulterende gel is klaar om in beeld te brengen.
   OPMERKING: De uitzettingsverhouding hangt grotendeels af van de mechanische eigenschappen van het originele monster. Een 4,2-voudige expansie voor de celmonsters en 3,4-voudige expansie voor het hersenweefselmonster werden verkregen.

5. Labelvrije beeldvorming van endogene eiwitdistributie in geëxpandeerde cel- en weefselmonsters

1. Bewaar de geëxpandeerde gelmonsters in water tijdens het beeldvormingsproces. De gel is kwetsbaar na expansie en moet dus met voorzichtigheid worden behandeld. Plaats de geëxpandeerde monsterdragende gel op een microscoopglaasje (1 mm dik) met een microscoopafstandhouder met de juiste openingsmaten en -dieptes, gevuld met water. Bedek het afstandsstuk met een dekstrookje (#1.5) en zorg ervoor dat het goed is afgedicht om beweging van het monster te voorkomen.
2. Plaats het monster met de geëxpandeerde cel of het weefsel op de gemotoriseerde tafel met het dekglaasje naar het doel gericht. Klik op Oculair op de software om het lichtpad te wijzigen in helder veld en pas de z-positie aan met een handmatige knop.
3. Voeg onderdompelingsolie toe aan de bovenkant van het monster en stel de condensor in op de juiste positie voor Köhler-verlichting tijdens het kijken onder helder veld met 25x vergroting vanaf het objectief. Voer 791,3 nm in het OPO-golflengtevenster op het laserpaneel in om de trilling van eiwit CH₃ te richten op 2940 cm⁻¹.
4. Schakel het licht van de microscoop over van helder veld (oculair) naar de laserscanmodus door op de LSM-knop te klikken en open de SRS-lasersluiter door op de sluiterknop op het laserbedieningspaneel te drukken. Druk op de LIVE-knop in de microscoopsoftware om real-time beeldacquisitie te starten.
5. Zoek de juiste focus door de z te wijzigen terwijl u naar het SRS-beeld kijkt onder een korte pixelverblijftijd (12,5 μs/pixel) en een lage beeldresolutie (256 pixels x 256 pixels). Zodra de ideale z-positie is gevonden, wijzigt u de scangrootte en de pixelverblijftijd door aan de betreffende balk in de microscoopsoftware te trekken.
6. Verkrijg het beeld door op de LSM-knop te drukken met behulp van de supersampling-voorwaarde (1024 pixels x 1024 pixels) met een langere pixelverblijftijd (80 μs/pixel) die overeenkomt met de tijdconstante van de lock-in amplifier. Verkrijg volumetrische afbeeldingen door een z-stack te verzamelen met een stapgrootte van 1 μm in de z-richting. Verwerk en analyseer het opgeslagen OIR-bestand van de software met behulp van ImageJ.
   OPMERKING: De gedetailleerde SRS-opstelling is onlangs gerapporteerd in Mutlu et ^al.24. Hier werd een afstembare picosecondelaser met een herhalingsfrequentie van 80 MHz en een bandbreedte van 2 ps voor pomp (770-990 nm) en stokes (1031,2 nm) naar een confocale laserscanmicroscoop geleid (gedetailleerd in Materiaaltabel). Optimaliseer de temporele en ruimtelijke overlapping van de twee bundels voor signalen met zuivere D₂O. Het kost wat moeite om de juiste z te vinden voor het geëxpandeerde monster onder helder veld, omdat de brekingsindex in de hele gel zeer homogeen is.
7. Bepaal de resolutie van VISTA door een SRS-beeld te maken van polystyreenkorrels (100 nm) met zowel een 25x objectief als een 60x objectief. Stel de pomplaser in op 784,5 nm, wat overeenkomt met een Raman-verschuiving van 3050 ^cm-1, kenmerkend voor de aromatische C-H rekt trillingen van polystyreen uit.
   OPMERKING: De hier gebruikte lasergolflengte van de pomp is vergelijkbaar met de golflengte die in VISTA voor eiwitten wordt gebruikt.
8. Met het 60x-objectief was het experimentele volledige golf halve maximum (FWHM, dat is de breedte van de lijnvorm bij de helft van de amplitude) van het kraalbeeld 276,17 nm. Modelleer de functie van het kraalobject als een halve cirkel.
   OPMERKING: Wanneer de PSF Gauss-functie een c (σ) = 269 nm/2,35 heeft, zou het ingewikkelde kraalbeeld een gemeten FWHM van 276,17 nm hebben. Als gevolg hiervan is de resolutie van het SRS-systeem 269 nm × 1,22 = 328 nm volgens het Rayleigh-criterium. Aangezien VISTA gemiddeld 4,2 keer groter is dan de celmonsters, is de effectieve resolutie gedaald tot 328 nm/4,2 = 78 nm.

6. Correlatieve VISTA en fluorescerende beeldvorming van immuno-gelabelde en geëxpandeerde weefselmonsters

1. Na denaturatie worden de in hydrogel ingebedde monsters (bijv. 150 μm coronale doorsnede van de hersenen) gedurende 15 minuten voorgeïncubeerd in 1% (v/v) Triton X-100 (PBST). Schakel de incubatiebuffer over op PBST met primair antilichaam in een verdunning van 1:100. Als er meerdere eiwitdoelen nodig zijn voor multiplexbeeldvorming, verdun dan de respectieve primaire antilichamen voor verschillende doelen tot de juiste concentraties in dezelfde cocktail en incubeer tegelijkertijd met de monsters.
2. Incubeer de gels met verdunde primaire antilichamen bij 37 °C en schud zachtjes bij 80 tpm gedurende 16-18 uur, gevolgd door 3x intensief wassen met PBST gedurende 1-2 uur bij 37 °C. Draai de gel tijdens de incubatie om inhomogene antilichaametikettering hier en in alle volgende incubaties te voorkomen.
3. Incubeer de monsters met secundaire antilichamen van overeenkomstige soortdoelen bij 1:100 verdunningen met PBST bij 37 °C gedurende 12-16 uur, beschermd tegen het licht. Was gelabelde hydrogelmonsters 3x met PBST gedurende 1-2 uur bij 37 °C en schud voorzichtig.
4. Verdun DAPI tot 3 μM eindconcentratie in PBS. Voeg een voldoende hoeveelheid DAPI-oplossing toe aan de monsterhydrogel zodat de gel in de oplossing wordt ondergedompeld. Incubeer gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur en schud zachtjes bij 80 tpm. Was het monster 3x met PBS.
5. Breid de immuno-gelabelde gelmonsters uit door te incuberen met een grote hoeveelheid dubbel gedeïoniseerde H₂O. Ververs het water elke 1 uur 3x en incubeer de monsters een nacht in H₂O, beschermd tegen licht. Tijdens het labelen moet de gel 1,5 keer uitzetten in vergelijking met de PBS-buffer.
6. Bereid het beeldvormende monster voor zoals beschreven in stap 5.1. Plaats het beeldmonster op de confocale laserscanmicroscoop met het 25x, 1.05 NA, wateronderdompelingsobjectief voor fluorescentiebeeldvorming.
7. Selecteer het juiste kanaal met de respectievelijke excitatielaser (405 nm, 488 nm, 561 nm en 640 nm) en PMT-paar volgens de gerichte antilichamen in het vervolgkeuzemenu op de microscoopsoftware. Druk op de LIVE-knop voor real-time beeldacquisitie.
8. Pas de scherpstelpositie aan met een handmatige knop op basis van het realtime fluorescentiesignaal. Optimaliseer het laservermogen, de pixelverblijftijd en de PMT-versterking in de microscoopsoftware volgens het realtime fluorescentiesignaal om een zwak signaal of oververzadiging te voorkomen.
   OPMERKING: Evalueer het uiterlijk en de kenmerken op basis van de gerapporteerde structuren van verschillende antilichamen om mogelijke kruisreactiviteiten van antilichamen te elimineren en om overspraak tussen verschillende fluorescentiekanalen te voorkomen.
9. Druk op de LSM-knop om te beginnen met het verkrijgen van correlatieve SRS- en fluorescerende beelden. Verzamel eerst volumetrische fluorescentiebeelden op immuno-gelabelde monsters. Zodra de fluorescentiebeeldvorming is voltooid, schakelt u het lichtpad van de microscoop over naar de transparante infrarood (IR) toestand.
10. Verander het detectiekanaal van fluorescentie PMT naar SRS op de microscoopsoftware. Open de sluiter voor de SRS-laser en voer SRS-volumetrische beeldvorming uit op het gezichtsveld van hetzelfde monster met hetzelfde bereik van z. Het normale bereik ligt tussen 100-200 μm en kan oplopen tot 700 μm.
    OPMERKING: Er is een lichte chromatische aberratie die een verschuiving in z-positie veroorzaakt tussen de fluorescerende beelden en de SRS-beelden vanwege het golflengteverschil in de excitatielasers. Handmatige zij-aan-zij vergelijking tussen de SRS- en fluorescentie z-stack-beelden is nodig. Zoek naar de exact overeenkomende kenmerken van zowel het SRS- als het fluorescentiekanaal om precies overeen te komen met de z-positie.

7. Bouw, training en validatie van U-Net architectuur

OPMERKING: Installatie op Linux wordt aanbevolen. Een grafische kaart met >10 GB RAM is vereist.

1. De omgeving inrichten
   1. Installeer Anaconda of Miniconda op een 3-5.3.0-linux-x86_64. Kloon of download de volgende bestanden: https://github.com/Li-En-Good/VISTA. Maak een Conda-omgeving voor het platform met behulp van de volgende opdrachtregel:
      Conda ENV maken -f environment.yml
2. Het voorspellingsmodel trainen
   1. Koppel de mappen met corresponderende SRS-afbeeldingen aan grondwaarheidsafbeeldingen in een csv-bestand. Plaats de mappen met SRS-afbeeldingen onder path_signal en grondwaarheidsafbeeldingen onder path_target kolommen.
   2. Zet het csv-bestand in de map data/csvs. Wijzig de configuratie indien nodig in scripts/train_model_2d.sh. Activeer de omgeving met behulp van de opdrachtregel:
      Conda activeren FNET
   3. Start modeltraining met behulp van de opdrachtregel:
      ./scripts/train_model_2d.sh 0
      De training gaat dan van start. De verliezen voor elke iteratie worden weergegeven in de opdrachtregel en opgeslagen met het model in de map save_models/.
3. Valideer de installatiekopieën in de trainingsset en testset met behulp van de opdrachtregel:
   ./scripts/train_model_2d.sh 0
   De voorspellingsresultaten worden opgeslagen in de map results/.

8. VISTA gecombineerd met U-Net voorspellingen voor eiwitspecifieke multiplexiteit in labelvrije beelden

1. Wijzig het csv-bestand in de bestandsnaam data/csvs//test.csv. Vervang de mappen van zowel path_signal als path_target door de directory met nieuwe SRS-afbeeldingen.
2. Verwijder de voorspellingsresultaten uit de training, dit is de mapresultaten/. Voer voorspellingen uit met behulp van de opdrachtregel:
   ./scripts/train_model_2d.sh 0
   De voorspellingsresultaten worden opgeslagen in de map results//test.

Resultaten

Na het vaststellen van het werkingsprincipe van de beeldvormings- en analysemethode, werd beeldregistratie uitgevoerd om de expansieverhouding te evalueren en om isotrope expansie tijdens de monsterverwerking te garanderen (Figuur 1A,B). Zowel onbehandelde als VISTA-monsters werden in beeld gebracht terwijl ze gericht waren op de bindingstrilling op 2940 ^cm-1, die afkomstig is van CH₃ van endogene eiwitten. In onbehande...

Discussie

Samenvattend presenteren we het protocol voor VISTA, een labelvrije modaliteit om eiwitrijke cellulaire en subcellulaire structuren van cellen en weefsels in beeld te brengen. Door zich te richten op endogene CH₃ uit eiwitten in in hydrogel ingebedde cellen en weefsels, bereikt de methode een effectieve beeldvormingsresolutie tot 78 nm in biologische monsters en lost kleine extrusie op in huntingtine-aggregaten en fibrillen in Aβ-plaques. Deze techniek is de eerste instantie d...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.0 M Tris pH 8	Sigma-Aldrich	648314
16% Paraformaldehyde	Electron microscopy science	15710	verdund tot 4% in PBS
25x water immersion objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	NA 1.05
5XFAD Muizen	Mutant Mouse Resource and Research Centers en het Jackson Laboratory	B6SJL-Tg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286 V) 6799Vas/Mmjax	Alzheimer hersenen
60x water immersion objective	Olympus	UPLSAPO60XWIR	NA 1.2
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
anti-MAP2	Cell Signaling Technology	8707
anti-NeuN	Cell Signaling Technology	24307
borosilicate coverslip #1.5	Fisher Scientific	1254581
C57BL/6J Muizen	Jackson Laboratory (JAX)	664	Normale muizen
D2O	Sigma-Aldrich	151882	voor SRS kalibratie
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM	GIBCO	10566-016
FBS	GIBCO	A4766
glass slide 3" x 1" x 1 mm	VWR	16004-430
goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21449
goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21236
goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
goat anti-rat IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11077
Grace Bio-Labs Press-To-Seal siliconen isolatoren	Sigma-Aldrich	GBL664108	microscoop spacer
Htt-97Q-GFP Plasmid	Gift van Prof. R. Kopito en Prof. F.-U.Hartl.
Laser scanning microscope	Olympus	FV3000	laser scanning confocal microscope
lipofectamine 3000	Thermo Fisher	L3000001	transfectie agent
Lycopersicon Esculentum Lectin DyLight®594 (lectine)	Vector Laboratories	DL-1177-1
Microscope spacer	Grace Bio-Labs	621502
N,N′-methylenebisacrylamide (BIS)	Sigma-Aldrich	M1533	gekocht als 2% oplossing in water
Nuclease vrij water	Thermo Fisher	10977-015
Penicilline-Streptomycine	GIBCO	15140-122
poly-strene kralen	Sigma-Aldrich	43302	voor resolutie karakterisering
Sodium Acrylaat	Sigma-Aldrich	408220
sodium dodecylsulfaat	Sigma-Aldrich	71725
soft-wool verf borstel #3	TANIS	000333
SRS Laser	A.P.E	picoEmerald	2ps pulsbreedte
tetramethylethyleendiamine	Sigma-Aldrich	T9281
Weefselkweekkolf 25 cm2	Corning	430639
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
pincet	Fine Science Tool	11295-51
Vibrotome	Leica	VT1200S	de vibratome