Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van hele celproteïnelysaten uit gezichtsprocessen van muizen en gekweekte palatale mesenchymcellen voor fosfoproteïne-analyse

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63834

⸱

1 april 2022

 ,  , 
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Het protocol presenteert een methode voor het isoleren van hele cel eiwitlysaten van ontleedde muis embryo gezichtsprocessen of gekweekte muis embryonale palatale mesenchym cellen en het uitvoeren van daaropvolgende western blotting om gefosforyleerde eiwitniveaus te beoordelen.

Samenvatting

Craniofaciale ontwikkeling bij zoogdieren is een complex morfologisch proces waarbij meerdere celpopulaties coördineren om het frontonasale skelet te genereren. Deze morfologische veranderingen worden geïnitieerd en in stand gehouden door verschillende signaalinteracties, waaronder vaak eiwitfosforylering door kinasen. Hier worden twee voorbeelden gegeven van fysiologisch relevante contexten waarin fosforylering van eiwitten tijdens de craniofaciale ontwikkeling van zoogdieren kan worden bestudeerd: gezichtsprocessen van muizen, in het bijzonder E11.5 maxillaire processen, en gekweekte embryonale palatale mesenchymcellen van muizen afgeleid van E13.5 secundaire palatale planken. Om de gemeenschappelijke barrière van defosforylering tijdens eiwitisolatie te overwinnen, worden aanpassingen en wijzigingen aan standaard laboratoriummethoden besproken die isolatie van fosfoproteïnen mogelijk maken. Daarnaast worden best practices verstrekt voor een goede analyse en kwantificering van fosfoproteïnen na western blotting van hele cel eiwitlysaten. Deze technieken, met name in combinatie met farmacologische remmers en/of murine genetische modellen, kunnen worden gebruikt om meer inzicht te krijgen in de dynamiek en rollen van verschillende fosfoproteïnen die actief zijn tijdens craniofaciale ontwikkeling.

Inleiding

Craniofaciale ontwikkeling bij zoogdieren is een complex morfologisch proces waarbij meerdere celpopulaties coördineren om het frontonasale skelet te genereren. Bij de muis begint dit proces op embryonale dag (E) 9,5 met de vorming van de frontonasale prominentie en paren van maxillaire en mandibulaire processen, die elk post-migrerende craniale neurale crestcellen bevatten. De laterale en mediale nasale processen ontstaan uit de frontonasale prominentie met het verschijnen van de neusputten en smelten uiteindelijk samen tot de neusgaten. Verder smelten de mediale neusprocessen en maxillaire processen samen om de bovenlip te genereren. Tegelijkertijd wordt palatogenese geïnitieerd met de vorming van verschillende uitwassen - de secundaire palatale planken - van de orale kant van de maxillaire processen bij E11.5. Na verloop van tijd groeien de palatale planken aan weerszijden van de tong naar beneden, verheffen zich tot een tegengestelde positie boven de tong en smelten uiteindelijk samen aan de middellijn om een continu gehemelte te vormen dat de neus- en mondholten scheidt door E16.51.

Deze morfologische veranderingen gedurende de craniofaciale ontwikkeling worden geïnitieerd en ondersteund door verschillende signaalinteracties, waaronder vaak eiwitfosforylatie door kinasen. Celmembraanreceptoren, zoals subfamilies van transformerende groeifactor (TGF)-β receptoren, waaronder botmorfogenetische eiwitreceptoren (BMPRs) en verschillende receptor tyrosinekinase (RTK) families, worden bijvoorbeeld autofosforyleerd op ligandbinding en activering in craniale neurale crestcellen 2,3,4 . Bovendien wordt de G-eiwit-gekoppelde transmembraanreceptor Smoothened gefosforyleerd in craniale neurale crestcellen en craniofacial ectoderm stroomafwaarts van Sonic hedgehog (SHH) ligandbinding aan de Patched1-receptor, wat resulteert in gladgestreken accumulatie op het ciliaire membraan en SHH-routeactivering5. Dergelijke ligand-receptor interacties kunnen optreden via autocriene, paracriene en / of juxtacrine signalering in craniofaciale contexten. Van BMP6 is bijvoorbeeld bekend dat het op een autocriene manier signaleert tijdens chondrocytendifferentiatie6, terwijl fibroblastgroeifactor (FGF) 8 wordt uitgedrukt in het faryngeale boogectoderm en bindt aan leden van de FGF-familie van RTK's uitgedrukt in het faryngeale boogmes mesenchym op een paracriene manier om patroonvorming en uitgroei van de faryngeale bogen te initiëren7, 8,9,10. Bovendien wordt Notch-signalering geactiveerd in zowel chondrocyten als osteoblasten tijdens craniofaciale skeletontwikkeling door juxtacrine-signalering wanneer transmembraandelta en / of gekartelde liganden binden aan transmembraan Notch-receptoren op naburige cellen, die vervolgens worden gesplitst en gefosforyleerd11. Er zijn echter andere ligand- en receptorparen die belangrijk zijn voor craniofaciale ontwikkeling die de flexibiliteit hebben om te functioneren in zowel autocriene als paracriene signalering. Tijdens morfogenese van muizentanden is bijvoorbeeld aangetoond dat van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF)-AA-ligand op een autocriene manier signaleert om de RTK PDGFRα in het glazuurorgaanepitheelte activeren 12. Daarentegen worden bij muriene gezichtsprocessen tijdens de zwangerschap transcripten die coderen voor de liganden PDGF-AA en PDGF-CC uitgedrukt in het craniofaciale ectoderm, terwijl de PDGFRα-receptor wordt uitgedrukt in het onderliggende craniale neurale crest-afgeleide mesenchym, wat resulteert in paracriene signalering 13,14,15,16,17 . Ongeacht het signaleringsmechanisme resulteren deze receptorfosforylatiegebeurtenissen vaak in de rekrutering van adaptoreiwitten en / of signaalmoleculen, die vaak zelf gefosforyleerd worden om intracellulaire kinasecascades te initiëren, zoals de mitogeen-geactiveerde eiwitkinase (MAPK) -route18,19.

De terminale intracellulaire effectoren van deze cascades kunnen vervolgens een reeks substraten fosforyleren, zoals transcriptiefactoren, RNA-binding, cytoskeletale en extracellulaire matrixeiwitten. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 en Sox926 behoren tot de transcriptiefactoren die gefosforyleerd zijn in de context van craniofaciale ontwikkeling. Deze posttranslationele modificatie (PTM) kan direct van invloed zijn op de gevoeligheid voor alternatieve PTM's, dimerisatie, stabiliteit, splitsing en/of DNA-bindende affiniteit, naast andere activiteiten 20,21,25,26. Bovendien wordt het RNA-bindende eiwit Srsf3 gefosforyleerd in de context van craniofaciale ontwikkeling, wat leidt tot zijn nucleaire translocatie27. Over het algemeen is aangetoond dat fosforylering van RNA-bindende eiwitten hun subcellulaire lokalisatie, eiwit-eiwitinteracties, RNA-binding en / of sequentiespecificiteitbeïnvloedt 28. Bovendien kan fosforylering van actomyosine leiden tot cytoskeletale herschikkingen gedurende de craniofaciale ontwikkeling29,30, en fosforylering van extracellulaire matrixeiwitten, zoals kleine integrinebindende ligand N-gebonden glycoproteïnen, draagt bij aan biomineralisatie tijdens de ontwikkeling van het skelet31. Door het bovenstaande en tal van andere voorbeelden is het duidelijk dat er brede implicaties zijn voor eiwitfosforylering tijdens craniofaciale ontwikkeling. Door een extra niveau van regulatie toe te voegen, wordt eiwitfosforylering verder gemoduleerd door fosfatasen, die kinasen tegengaan door fosfaatgroepen te verwijderen.

Deze fosforyleringsgebeurtenissen op zowel het receptor- als effectormolecuulniveau zijn van cruciaal belang voor de voortplanting van signaalroutes en resulteren uiteindelijk in veranderingen in genexpressie in de kern, waardoor specifieke celactiviteiten worden aangedreven, zoals migratie, proliferatie, overleving en differentiatie, die resulteren in de juiste vorming van het zoogdiergezicht. Gezien de contextspecificiteit van eiwitinteracties met kinasen en fosfatasen, de resulterende veranderingen in PTM's en hun effecten op celactiviteit, is het van cruciaal belang dat deze parameters worden bestudeerd in een fysiologisch relevante omgeving om volledig inzicht te krijgen in de bijdrage van fosforyleringsgebeurtenissen aan craniofaciale ontwikkeling. Hier worden voorbeelden gegeven van twee contexten waarin fosforylering van eiwitten en dus activering van signaalroutes tijdens de craniofaciale ontwikkeling van zoogdieren moet worden bestudeerd: gezichtsprocessen van muizen, in het bijzonder E11,5 maxillaire processen, en gekweekte embryonale palatale mesenchymcellen van muizen afgeleid van E13.5 secundaire palatale planken - zowel primaire32 als vereeuwigde33 . Bij E11.5 zijn de maxillaire processen in het proces van versmelting met de laterale en mediale nasale processen1, waardoor een kritisch tijdspunt wordt weergegeven tijdens de craniofaciale ontwikkeling van de muis. Verder werden hier maxillaire processen en cellen afgeleid van de palatale planken gekozen omdat de laatste structuren derivaten zijn van de eerste, waardoor onderzoekers de mogelijkheid krijgen om eiwitfosforylatie in vivo en in vitro in gerelateerde contexten te ondervragen. Dit protocol is echter ook van toepassing op alternatieve gezichtsprocessen en ontwikkelingstijdpunten.

Een cruciaal probleem bij het bestuderen van gefosforyleerde eiwitten is dat ze gemakkelijk worden gedefosforyleerd tijdens eiwitisolatie door overvloedige omgevingsfosfatasen. Om deze barrière te overwinnen, worden aanpassingen en aanpassingen aan standaard laboratoriummethoden besproken die isolatie van gefosforyleerde eiwitten mogelijk maken. Daarnaast worden best practices gegeven voor een goede analyse en kwantificering van gefosforyleerde eiwitten. Deze technieken, met name in combinatie met farmacologische remmers en/of muriene genetische modellen, kunnen worden gebruikt om meer inzicht te krijgen in de dynamiek en rollen van verschillende signaalroutes die actief zijn tijdens de craniofaciale ontwikkeling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures met betrekking tot dieren werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of Colorado Anschutz Medical Campus en uitgevoerd in overeenstemming met institutionele richtlijnen en voorschriften. Vrouwelijke 129S4-muizen op een leeftijd van 1,5-6 maanden en gehuisvest bij een subthermoneutrale temperatuur van 21-23 ° C werden gebruikt voor embryo-oogsten. Een schematische workflow van het protocol is weergegeven in figuur 1. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen, apparatuur, software, reagentia en dieren die in dit protocol worden gebruikt.

1. Het oogsten van E11.5 muizenembryo's

  1. Euthanaseer zwangere vrouwelijke muis 11,5 dagen na detectie van vaginale plug tijdens getimede paring in een CO2-kamer met behulp van IACUC-goedgekeurd CO2-debiet dat nodig is voor ongeveer 50% verplaatsing (2,95 l / min in een 360 in3 kamer) en duur van blootstelling (zie tabel met materialen). Voer cervicale dislocatie uit als een secundaire methode van euthanasie. Ga onmiddellijk over tot dissectie.
  2. Leg het muislichaam op een ontleedbord met de ventrale kant naar boven gericht. Spuit de muizenbuik in met 70% ethanol.
  3. Open de buikholte door de huidanterieur naar de vaginale opening te knijpen en op te tillen met een rechte Semken-tang en de opgetilde huid en onderliggende lagen te snijden met een rechte chirurgische schaar in een hoek van 45 ° aan weerszijden om een "V" -vorm te genereren die zich uitstrekt tot elk lateraal oppervlak ongeveer halverwege tussen de voorpoten en achterpoten.
  4. Pak met behulp van de Semken-tang een van de baarmoederhoorns vast en knip onder de eileider en boven de baarmoederhals met de chirurgische schaar. Snijd het mesometrium weg om de baarmoederhoorn volledig te kunnen verwijderen.
  5. Breng de ontleedde baarmoederhoorn over op 10 ml histologische fosfaatbuffered saline (PBS) [0,137 M NaCl, 2,68 mM KCl, 1,76 mM KH2PO4 monobasisch, 10,14 mM Na2HPO4 dibasisch, pH 7,4] in een petrischaaltje van 10 cm.
  6. Verwijder de tweede baarmoederhoorn aan de andere kant van de buikholte volgens dezelfde procedure als beschreven in stap 1.4-1.5.
  7. Plaats de petrischaal van 10 cm met beide baarmoederhoorns op ijs als u niet onmiddellijk overgaat tot de dissectie van individuele embryo's (d.w.z. als een tweede vrouwelijke muis wordt ontleed).
  8. Ontleed onder een ontleedende stereomicroscoop zorgvuldig elk embryo uit de baarmoederhoorns met Dumont #5 fijne tang. Trek langzaam het myometrium, decidua en chorion weg. Scheur en verwijder het relatief transparante amnion rond het embryo en breek de navelstreng door die het embryo met de placenta verbindt.
  9. Breng elk ontleed embryo over op 2,5 ml histologie PBS in een individuele put van een 12-well celkweekplaat op ijs met behulp van een gesneden plastic transferpipet of een embryolepel.
    OPMERKING: Als u werkt met een nest dat embryo's van meer dan één genotype kan bevatten, bewaar dan het amnion rond elk embryo voor genotypering door elk in zijn eigen vooraf gelabelde 0,5 ml microcentrifugebuis op ijs te plaatsen.

2. Ontleden van maxillaire processen van E11.5 muisembryo's

  1. Bereid drie petrischalen van 10 cm met 10 ml histologie PBS en bewaar ze op ijs om te worden gebruikt in rotatie tussen embryo's.
  2. Breng één embryo uit een individuele put van de 12-well celkweekplaat over naar een van de 10 cm petrischalen met histologie PBS op ijs met behulp van een gesneden plastic transferpipet of een embryolepel.
  3. Scheid onder de ontleedmicroscoop elk maxillair proces van het gezicht met behulp van de fijne tang. Snijd eerst de voorste zijde van een maxillair proces langs de natuurlijke inkeping die het laterale nasale proces en het maxillaire proces scheidt (figuur 2A).
  4. Snijd ten tweede de achterste kant van het maxillaire proces langs de natuurlijke inkeping die het maxillaire proces en het mandibulaire proces scheidt (figuur 2A).
  5. Ten derde, om het maxillaire proces volledig te scheiden, maakt u een verticale snede van de voorste naar de achterste zijden van het maxillaire proces aan de oogzijde van het maxillaire proces waar de natuurlijke inkepingen waarnaar boven het uiteinde wordt verwezen (figuur 2A-C).
  6. Herhaal deze drie sneden voor het maxillaire proces aan de andere kant van het gezicht.
  7. Breng met behulp van een 9" Pasteur pipet met een kleine latexbol van 2 ml het ontlede paar maxillaire processen en een klein druppeltje van ongeveer 30 μL histologie PBS over naar een gelabelde petrischaal van 35 mm op ijs (figuur 2D).
  8. Volg stappen 2,3-2,7 voor elk embryo en draai de drie petrischalen van 10 cm met histologie PBS op ijs tussen embryo's. Plaats afzonderlijke paren van ontleedde maxillaire processen in afzonderlijke petrischalen van 35 mm op ijs.
    OPMERKING: Scheiding van het maxillaire proces ectoderm en mesenchym (stappen 2.9-2.17) kan worden uitgevoerd na het ontleden van de maxillaire processen van alle embryo's in het nest. Als intacte maxillaire processen die zowel het ectoderm als het mesenchym bevatten gewenst zijn, gaat u verder met stap 2.18 hieronder.
  9. Bereid 250 μL vers 2% trypsine in weefselkweek PBS en 250 μL 10% foetaal runderserum (FBS) in weefselkweek PBS en bewaar op ijs.
  10. Plaats een tweede, klein druppeltje van ongeveer 30 μL 2% trypsine in de 35 mm petrischaal gescheiden van het eerste, kleine druppeltje histologie PBS met de maxillaire processen. Breng het paar maxillaire processen over op het kleine druppeltje van 2% trypsine met behulp van het Pasteur-pipet (figuur 2D).
  11. Incubeer het gerecht op ijs gedurende 15 minuten.
  12. Haal de 35 mm petrischaal van het ijs en leg deze onder de ontleedmicroscoop.
  13. Trek met behulp van de fijne tang langzaam en voorzichtig de laag ectoderm van elk maxillair proces af (figuur 2E).
    OPMERKING: Als het ectoderm niet scheidt van het mesenchym in een intacte plaat, incubeer dan in 2% trypsine bij kamertemperatuur (RT) gedurende maximaal 5 extra minuten voordat u doorgaat met scheiden. Als het weefsel begint te desintegreren in de 2% trypsine, verplaats dan de maxillaire processen naar de 10% FBS zoals hieronder beschreven om het trypsine te neutraliseren en de scheiding van het ectoderm en mesenchym te voltooien.
  14. Zodra het maxillaire proces ectoderm en mesenchym zijn gescheiden (figuur 2F), breng de gewenste weefsels van het paar maxillaire processen over naar een derde, kleine druppel van ongeveer 30 μL van 10% FBS - gescheiden van de twee vorige kleine druppeltjes - met behulp van de Pasteur pipet (figuur 2D).
  15. Plaats de 35 mm petrischaal op ijs om de trypsinisatie te stoppen.
  16. Incubeer de maxillaire procesweefsels op ijs in 10% FBS gedurende 1-2 minuten en breng vervolgens de weefsels van beide maxillaire processen over naar een vierde, kleine druppel van ongeveer 30 μL voorgekookte histologie PBS op ijs - gescheiden van de drie vorige kleine druppeltjes - met behulp van de Pasteur-pipet (figuur 2D).
  17. Incubeer de maxillaire procesweefsels in histologie PBS gedurende 1 minuut terwijl u de histologie PBS voorzichtig rond de maxillaire procesweefsels wervelt met de punt van de Pasteur-pipet om ervoor te zorgen dat alle FBS van het weefsel wordt gespoeld.
  18. Breng het paar maxillaire procesweefsels over naar een gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 ml op ijs met behulp van de Pasteur-pipet, waardoor de overdracht van histologie PBS wordt geminimaliseerd. Verwijder overtollige histologie PBS in de microcentrifugebuis van 1,5 ml met de Pasteur pipet.
  19. Volg de bovenstaande stappen om de maxillaire processen van elk embryo in het nest te ontleden.
  20. Verwerk de monsters onmiddellijk om hele celeiwitlysaten (hieronder) te isoleren of langdurig bij -80 °C te bewaren. Voordat u deze langdurig opslaat, vriest u de microcentrifugebuis van 1,5 ml in een bad van 100% EtOH gedurende 5 minuten in op droogijs.

3. Isoleren van hele cel eiwitlysaten van muis maxillaire processen

  1. Als maxillaire processen eerder bij -80 °C werden ingevroren, ontdooi ze dan op ijs.
  2. Voeg 0,1 ml ijskoude NP-40 lysisbuffer (20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA; bewaard bij 4 °C) toe met protease- en fosfataseremmers (1x complete mini-proteaseremmercocktail [opgelost in water; bewaard bij -20 °C], 1 mM PMSF [opgelost in isopropanol; bewaard bij 4 °C], 10 mM NaF [bewaard bij -20 °C; vermijd bevriezing/dooi], 1 mM Na3VO4 [bewaard bij -20 °C], 25 mM β-glycerofosfaat [opgeslagen bij 4 °C]) toegevoegd onmiddellijk voor gebruik op ijs.
    OPMERKING: Celfractionering kan als alternatief worden uitgevoerd om cytoplasmatische, nucleaire, membraan- of mitochondriale eiwitfracties te isoleren.
  3. Pipetteer 10 keer op en neer met een pipetman van 200 μL.
  4. Vortex gedurende 10 s, en pipetteer dan 10 keer op en neer met een 200 μL pipetman. Vermijd het genereren van bubbels.
  5. Incubeer bij 4 °C gedurende 2 uur terwijl u het uiteinde over het uiteinde draait met behulp van een peddel van 1,5 ml /2 ml met een buis revolver.
  6. Centrifugeer de monsters bij 13.500 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
  7. Verzamel het supernatant naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml op ijs met een pipetman van 200 ml.
  8. Kwantificeer de eiwitconcentratie met de eiwittestkit, met behulp van 10 μL eiwitlysaat + 10 μL NP-40 lysisbuffer voor experimentele monsters en 3-5 verdunningen van runderserumalbumine (fractie V) (BSA) in NP-40 lysisbuffer in een bereik van 0,25-2,0 mg / ml als eiwitstandaarden.
  9. Ga verder met natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) (stap 5) of vries de resterende lysaten snel in op droogijs en bewaar op -80 °C langdurig.

4. Isoleren van hele cel eiwitlysaten uit primaire en/of vereeuwigde muis embryonale palatale mesenchym (MEPM) cellen

OPMERKING: Isolatie en kweek van primaire MEPM-cellen van E13.5-muizenembryo's en onsterfelijke MEPM-cellen zijn eerder beschreven 32,33,34. Stimulatie van cellen met groeifactor (stappen 4.1-4.7) kan worden uitgevoerd voorafgaand aan cellysis. Als niet-gestimuleerde cellen gewenst zijn, ga dan verder met stap 4.8 hieronder.

  1. Zuig het groeimedium [Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met 50 U/ml penicilline, 50 μg/ml streptomycine, 2 mM L-glutamine, 10% FBS] uit de MEPM-cellen bij ~70% confluentie in een celkweekschaal van 6 cm met behulp van een 5,75" Pasteur pipet bevestigd aan een vacuümsysteem.
  2. Was de cellen met 1 ml weefselkweek PBS.
  3. Voeg 3 ml serumafhongermedium [DMEM met 50 E/ml penicilline, 50 μg/ml streptomycine, 2 mM L-glutamine, 0,1% FBS] toe, voorgewarmd in een waterbad van 37 °C.
  4. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 23 uur.
  5. Vervang het serumverhongeringsmedium door 3 ml vers, voorverwarmd serumverhongeringsmedium.
  6. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 1 uur.
  7. Stimuleer de cellen met de groeifactor van keuze in een empirisch bepaalde concentratie gedurende de gewenste tijdsduur.
  8. Zuig het medium uit de MEPM-cellen aan bij 80%-100% confluentie met behulp van een 5,75" Pasteur pipet bevestigd aan een vacuümsysteem.
  9. Was de cellen tweemaal met ijskoude weefselkweek PBS (1 ml voor een celkweekschaal van 6 cm); kantel de plaat tijdens de laatste wasbeurt opzij om ervoor te zorgen dat alle weefselkweek PBS wordt aangezogen.
  10. Lyseer de cellen door ijskoude NP-40 lysisbuffer met protease- en fosfataseremmers die vlak voor gebruik (0,1 ml voor een celkweekschaal van 6 cm) op ijs worden toegevoegd.
  11. Incubeer de plaat gedurende 5 minuten op ijs met rotatie ongeveer elke minuut om volledige dekking van de plaat te garanderen.
  12. Schraap de cellen van de plaat met behulp van een voorgekoelde cellifter en breng de celsuspensie over naar een voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 ml op ijs.
  13. Incubeer de celsuspensie bij 4 °C gedurende 30 minuten terwijl u uiteinde over uiteinde draait met behulp van een peddel van 1,5 ml / 2 ml met een buis revolver.
  14. Ga verder met de stappen 3.6-3.9 die hierboven zijn beschreven.

5. Western blotting van hele cel eiwit lysaten uit muis gezichtsprocessen en/of MEPM cellen voor fosfoproteïnen

  1. Bereid hele cel eiwit lysaat monsters voor SDS-PAGE.
    1. Bepaal de hoeveelheid eiwit die moet worden geladen, afhankelijk van de eiwitrijkdom in het weefsel / de cel; 12,5 μg is meestal voldoende voor robuust tot expressie gebrachte eiwitten in hele cel eiwitlysaten.
    2. Voeg een gelijk volume van 2x Laemmli buffer [20% glycerol, 4% SDS, 0,004% broomfenol blauw, 0,125 M Tris HCl pH 6,8] toe met 10% β-mercaptoethanol toegevoegd direct voor gebruik.
      LET OP: β-mercaptoethanol is huid- of oogcorroserend, giftig, gevaarlijk bij inslikken en heeft aquatische toxiciteit. Draag handschoenen, een laboratoriumjas, gezichtsscherm en een veiligheidsbril in een chemische zuurkast. Weggooien volgens de richtlijnen voor milieuhygiëne en -veiligheid.
    3. Meng door vortexing.
    4. Verwarm de monsters gedurende 5 minuten op 100 °C in een minidroog bad.
    5. Meng door vortexing en plaats de monsters op ijs.
    6. Centrifugeer bij 9.400 × g gedurende 5 min bij 4 °C.
    7. Plaats de monsters kort op ijs voordat ze in SDS-PAGE-gel worden geladen of bewaar ze langdurig bij -20 °C.
  2. Voer SDS-PAGE uit met behulp van een elektroforesecel met een 4%-15% prefab eiwitgel en elektroforesebuffer35.
  3. Elektrotransfer van de eiwitten naar een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan met behulp van transferbuffer met 0%-20% methanol (0%-10% voor eiwitten groter dan 100 kDa; 20% voor eiwitten kleiner dan 100 kDa) toegevoegd onmiddellijk voor gebruik35.
  4. Blokkeer het membraan en sonde voor fosfoproteïne van belang.
    1. Was het membraan na overdracht gedurende 5 minuten in 1x tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) [20 mM Tris, 0,137 M NaCl, pH 7,6] in een western blot box.
    2. Incubeer het membraan in 5 ml blokkeerbuffer [1x TBS, 0,1% Tween 20, 5% w/v BSA; goed gemengd en gefilterd door een 25 mm spuitfilter met 0,2 μm poriën met behulp van een 10 ml spuit met luerpunt] gedurende 1 uur in een western blot box met agitatie op een orbitale shaker.
      OPMERKING: Gebruik melk niet als een blokkerend middel bij het karakteriseren van fosfoproteïnen, omdat het de fosfoproteïnecaseïne bevat, wat een hoog, niet-specifiek achtergrondsignaal kan veroorzaken.
    3. Was het membraan driemaal gedurende 5 minuten elk in TBS-T [1x TBS, 0,1% Tween 20] in een western blot box met agitatie op een orbitale shaker.
    4. Incubeer het membraan in 5 ml primair antilichaam verdund in blokkerende buffer bij 4 °C 's nachts in een conische buis van 50 ml met behulp van een peddel van 50 ml met een buis revolver.
      OPMERKING: Raadpleeg de antilichaam datasheet voor de juiste concentratie voor western blotting.
    5. Was het membraan driemaal bij RT gedurende 5 minuten elk in TBS-T in een western blot box met agitatie op een orbitale shaker.
    6. Incubeer het membraan in 5 ml geschikte mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerd secundair antilichaam verdund in blokkerende buffer gedurende 1 uur in een western blot box met agitatie op een orbitale shaker.
    7. Was het membraan driemaal gedurende 5 minuten elk in TBS-T in een western blot box met agitatie op een orbitale shaker.
    8. Incubeer het membraan in enhanced chemiluminescence (ECL) western blotting substrate [mengen van gelijke volumes uit flessen 1 en 2; 0,5 ml van elk voor grote (8,6 cm x 6,7 cm) membranen] gedurende 1 minuut, zodat het hele membraan voortdurend wordt blootgesteld aan het ECL western blotting substraat.
    9. Giet het membraan van overtollig ECL western blotting substraat af en ontwikkel onmiddellijk met behulp van een chemiluminescentie imager.
  5. Strip het membraan en reprobe voor totaal eiwit van belang.
    1. Plaats het PVDF-membraan in een transparant zakje met polyethyleen voering met 5 ml strippingbuffer [2% SDS, 62,5 mM Tris HCl pH 6,8] met 8 μL/ml β-mercaptoethanol dat onmiddellijk voor gebruik wordt toegevoegd.
    2. Incubeer bij 50 °C gedurende 30 minuten met schommelen in een hybridisatieoven met 11 omwentelingen per minuut.
    3. Was het membraan driemaal bij RT gedurende 5 minuten elk in TBS-T in een western blot box met agitatie op een orbitale shaker.
    4. Ga verder met de stappen 5.4.2-5.4.9 die hierboven zijn beschreven.
  6. Kwantificeer western blot band dichtheden met behulp van ImageJ-software, normaliseren van de niveaus van het gefosforyleerde eiwit van belang tot de niveaus van het totale eiwit van belang36.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Bij pogingen om de fosforylering van eiwitten geïsoleerd uit gezichtsprocessen van muizen en/of gekweekte palatale mesenchymcellen te karakteriseren, zullen de representatieve resultaten idealiter een duidelijke, reproduceerbare band onthullen na western blotting met een antifosfoproteïne-antilichaam dat op of nabij de hoogte van de overeenkomstige totale eiwitband loopt (figuur 3 ). Als er echter uitgebreide fosforylering van het eiwit optreedt, kan er een lichte opwaartse verschuiving van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hier beschreven protocol stelt onderzoekers in staat om kritische fosforyleringsafhankelijke signaleringsgebeurtenissen tijdens craniofaciale ontwikkeling op een robuuste en reproduceerbare manier te onderzoeken. Er zijn verschillende kritieke stappen in dit protocol die zorgen voor een goede verzameling van gegevens en analyse van resultaten. Of het nu gaat om het isoleren van fosfoproteïnen van gezichtsprocessen van muizen en / of gekweekte palatale mesenchymcellen, het is noodzakelijk om snel en efficiënt te beweg...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

129S4 muizen waren een geschenk van Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine op de berg Sinaï. Dit werk werd ondersteund met fondsen van de National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 en K02 DE028572 tot K.A.F., F31 DE029976 tot M.A.R. en F31 DE029364 tot B.J.C.D.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Equipment
Block voor mini droge badResearch Products International Corp400783
ChemiDoc XRS+ beeldvormingssysteem met Image Lab softwareBio-Rad1708265chemiluminescentie imager
CO2 incubator, luchtmantelVWR10810-902
Dissectiebord, 11 x 13 inchFisher Scientific09 002 12
Elektroforese cel, 4-gel, voor mini voorgegoten gels met mini trans-blot moduleBio-Rad1658030
Hybridisatie ovenFisher ScientificUVP95003001
Microcentrifuge 5415 D met F45-24-11 rotor (Eppendorf)Sigma AldrichZ604062
Mini droge badResearch Products International Corp400780
Orbitale shakerVWR89032-092
pH meterVWR89231-662
Voeding voor SDS-PAGEBio-Rad1645050
Rechthoekige ijslade, maxi 9 LFisher Scientific07-210-093
Stemi 508 stereomicroscoop met standaard K LAB, LED-ringlichtZeiss4350649020000000dissectiemicroscoop
TimerVWR62344-641
Buis revolverFisher Scientific11 676 341
Vortex mixerFisher Scientific02 215 414
WaterbadVWR89501-472
Western blot boxFisher ScientificNC9358182
Materialen
Celcultuur schalen, 6 cmFisher Scientific12-565-95
Celcultuur platen, 12 wellFisher Scientific07-200-82
Cel liftersFisher Scientific08-100-240
CO2AirgasCD USP50
Conische buizen, polypropyleen, 50 mLFisher Scientific05-539-13
Dumont #5 fijne pincetFine Science Tools11254-20
Embryo lepelFine Science Tools10370-17
Microcentrifugebuizen, 0,5 mLVWR89000-010
Microcentrifugebuizen, 1,5 mLVWR20170-038
Pasteur pipet, 5,75"Fisher Scientific13-678-6A
Pasteur pipet, 9"VWR14672-380
Petrischalen, 10 cmFisher Scientific08-757-100D
Petrischalen, 35 mmFisher ScientificFB0875711YZ
Zakjes, transparant, polyethyleen voeringFisher Scientific01-812-25B
PVDF membraanFisher ScientificIPVH00010
Semken pincetFine Science Tools11008-13
Kleine latex klep, 2 mLVWR82024-554
Chirurgische schaarFine Science Tools14002-12
Spuit met luer-tip, 10 mLVWRBD309604
TransferpipetFisher Scientific13-711-22
Western blot cassette opening hendelBio-Rad4560000
Whatmann 3MM chr chromatografie papierFisher Scientific05-714-5
Reagentia
4-15% Voorgegoten eiwit gels, 10-wel, 30 µLBio-Rad4561083
β-glycerofosfaat dinatriumzouthydraatSigma AldrichG5422-25Gstock concentratie 1 M
β-mercaptoethanolSigma AldrichM3148-100ML
Rundserumalbumine, fractie V, hitteschok getestFisher ScientificBP1600-100
BromofenolblauwFisher ScientificAC403140050
Complete mini protease remmer cocktailSigma Aldrich11836153001stock concentratie 25x
DC protein assay kit IIBio-Rad500-0112
DMEM, hoge glucoseGibco11965092
E7, muis monoklonaal bèta tubuline primaire antilichaam, concentraat 0,1 mLDevelopmental Studies Hybridoma BankE71:1.000
ECL western blotting substraatFisher ScientificPI32106lage picogram reeks
ECL western blotting substraatGenesee Scientific20-302Blage femtogram reeks
Elektroforese buffer, 5 LBio-Rad1610772stock concentratie 10x
Ethanol, 200 proof, 1 gallonDecon Laboratories, Inc.2705HCEtOH
Ethyleendiaminetetraazijnzuur, Di Na zout dihydr. (kristallijn poeder/elektrofor.)Fisher ScientificBP120-500EDTA
Foetaal bovien serum, gekarakteriseerd, US oorsprong, 500 mLHyCloneSH30071.03
Glycerol (gecertificeerd ACS)Fisher ScientificG33-4
HRP-geconjugeerd secundair antilichaam, geit anti-muis IgGJackson ImmunoResearch Laboratories115-035-1461:20.000
HRP-geconjugeerd secundair antilichaam, geit anti-konijn IgGJackson ImmunoResearch Laboratories111-035-0031:20.000
Zoutzuur oplossing, 6N (gecertificeerd)Fisher ScientificSA56-500

Referenties

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
  3. Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).
  4. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time. Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).
  5. Xavier, G. M., et al. Hedgehog receptor function during craniofacial development. Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).
  6. Grimsrud, C. D., et al. BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).
  7. MacArthur, C. A., et al. FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development. Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).
  8. Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch. Development. 126 (1), 51-61 (1999).
  9. Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch. Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).
  10. Tabler, J. M., et al. Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes. Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).
  11. Pakvasa, M., et al. Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development. Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).
  12. Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro. Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).
  13. Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells. Development. 115 (1), 133-142 (1992).
  14. Orr-Urtreger, A., Lonai, P. Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo. Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).
  15. Ding, H., et al. The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis. Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).
  16. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  17. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851(2013).
  18. Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103 (2), 211-225 (2000).
  19. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  20. Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).
  21. Firulli, B. A., Firulli, A. B. Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical. Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).
  22. Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).
  23. Jeong, H. M., et al. Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).
  24. Seo, J. H., et al. Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).
  25. Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation. Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).
  26. Schock, E. N., LaBonne, C. Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development. Frontiers in Physiology. 11, 606889(2020).
  27. Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme. Development. 148 (14), (2021).
  28. Stamm, S. Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).
  29. Szabo, A., Mayor, R. Mechanisms of neural crest migration. Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).
  30. Kindberg, A. A., Bush, J. O. Cellular organization and boundary formation in craniofacial development. Genesis. 57 (1), 23271(2019).
  31. Faundes, V., et al. Raine syndrome: an overview. European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).
  32. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  33. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078(2017).
  34. Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151(2021).
  35. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
  36. Miller, L. Analyzing gels and western blots with ImageJ. , Available from: https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/ (2010).
  37. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  38. Wang, Y., et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Scientific Reports. 5, 15709(2015).
  39. Sharma, S. K., Carew, T. J. Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).
  40. Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
  41. Hooper, J. E., et al. Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme. Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).
  42. Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. Serum contains a platelet-derived transforming growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).
  43. Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry. Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).
  44. Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149(2014).
  45. Salinovich, O., Montelaro, R. C. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Isolatie van eiwitlysaatcraniofaciale ontwikkelingeiwitfosforyleringWestern blotfosfataseremmerscellysisbuffersignaaltransductie
Isolatie van hele celproteïnelysaten uit gezichtsprocessen van muizen en gekweekte palatale mesenchymcellen voor fosfoproteïne-analyse
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.