Het protocol dat hier wordt beschreven, biedt gedetailleerde instructies voor het analyseren van genomische gebieden die van belang zijn voor microproteïnecoderingspotentieel met behulp van PhyloCSF op de gebruiksvriendelijke UCSC Genome Browser. Daarnaast worden verschillende hulpmiddelen en middelen aanbevolen om de sequentiekenmerken van geïdentificeerde microproteïnen verder te onderzoeken om inzicht te krijgen in hun vermeende functies.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een geïntegreerde aanpak voor microproteïne-identificatie en sequentieanalyse
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Next-generation sequencing (NGS) heeft het veld van genomica vooruitgestuwd en hele genoomsequenties geproduceerd voor tal van diersoorten en modelorganismen. Ondanks deze schat aan sequentie-informatie zijn uitgebreide genannotatie-inspanningen echter een uitdaging gebleken, vooral voor kleine eiwitten. Met name conventionele eiwitannotatiemethoden werden ontworpen om opzettelijk vermeende eiwitten uit te sluiten die zijn gecodeerd door korte open leesframes (sORF's) met een lengte van minder dan 300 nucleotiden om het exponentieel hogere aantal onechte niet-coderende sORF's in het hele genoom te filteren. Als gevolg hiervan zijn honderden functionele kleine eiwitten genaamd microproteïnen (<100 aminozuren in lengte) ten onrechte geclassificeerd als niet-coderende RNA's of volledig over het hoofd gezien.
Hier bieden we een gedetailleerd protocol om gratis, openbaar beschikbare bio-informaticatools te gebruiken om genomische regio's te doorzoeken op microproteïne-codeerpotentieel op basis van evolutionair behoud. In het bijzonder bieden we stapsgewijze instructies over het onderzoeken van sequentiebehoud en coderingspotentieel met behulp van fylogenetische codonsubstitutiefrequenties (PhyloCSF) op de gebruiksvriendelijke Genome Browser van de University of California Santa Cruz (UCSC). Daarnaast beschrijven we stappen om efficiënt meerdere soorten uitlijningen van geïdentificeerde microproteïnesequenties te genereren om aminozuursequentiebehoud te visualiseren en middelen aan te bevelen om microproteïnekenmerken te analyseren, inclusief voorspelde domeinstructuren. Deze krachtige hulpmiddelen kunnen worden gebruikt om vermeende microproteïne-coderende sequenties in niet-canonische genomische regio's te helpen identificeren of om de aanwezigheid van een geconserveerde coderingssequentie met translationeel potentieel in een niet-coderend transcript van belang uit te sluiten.
Inleiding
De identificatie van de volledige set coderende elementen in het genoom is een belangrijk doel sinds de start van het Human Genome Project en blijft een centrale doelstelling voor het begrijpen van biologische systemen en de etiologie van genetisch gebaseerde ziekten 1,2,3,4. Vooruitgang in NGS-technieken heeft geleid tot de productie van hele genoomsequenties voor een groot aantal organismen, waaronder gewervelde dieren, ongewervelde dieren, gist en planten5. Bovendien hebben transcriptionele sequencingmethoden met h....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het protocol dat hieronder wordt beschreven, beschrijft stappen voor het laden en navigeren van de PhyloCSF-browsertracks op de UCSC Genome Browser (gegenereerd door Mudge et al.49). Voor algemene vragen over de UCSC Genome Browser is hier een uitgebreide Genome Browser User's Guide te vinden: https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html.
1. De PhyloCSF Track Hub laden in de UCSC Genome Browser
- Open een internetbrowservenster en navigeer naar de UCSC Genome Browser (https:....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hier zullen we het gevalideerde microproteïne mitoregulin (Mtln) als voorbeeld gebruiken om aan te tonen hoe een geconserveerde sORF een positieve PhyloCSF-score zal genereren die gemakkelijk kan worden gevisualiseerd en geanalyseerd op de UCSC Genome Browser. Mitoregulin werd eerder geannoteerd als een niet-coderend RNA (voorheen menselijk gen ID LINC00116 en muisgen ID 1500011K16Rik). Vergelijkende genomica en sequentieconserveringsanalysemethoden speelden een cruciale rol bij de eerste ontdekking
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het hier gepresenteerde protocol biedt gedetailleerde instructies over het ondervragen van genomische regio's die van belang zijn voor microproteïnecoderingspotentieel met behulp van PhyloCSF op de gebruiksvriendelijke UCSC Genome Browser 48,49,50,51. Zoals hierboven beschreven, is PhyloCSF een krachtig vergelijkend genomics-algoritme dat fylogenetische modellen en codonsubstitutiefrequenties i.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (HL-141630 en HL-160569) en Cincinnati Children's Research Foundation (Trustee Award).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen | |
|---|---|---|---|---|
| Website | Website Address | Vereisten | ||
| Clustal Omega Multiple Sequence Alignment Tool | https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ | Webbrowser | Multiple sequence alignment programma voor de efficiënte uitlijning van FASTA-sequenties (dwz voor cross-species vergelijking van geïdentificeerde microproteïnen) | |
| COXPRESSdb | https://coxpresdb.jp | Webbrowser | Biedt co-gereguleerde genrelaties om genrelaties te schatten | |
| EMBL-EBI Bioinformatica Tools FAQs | https://www.ebi.ac.uk/seqdb/confluence/display/JDSAT/Bioinformatics+Tools+FAQ | Webbrowser | Veelgestelde vragen (FAQ's) voor EMBL-EBI-tools. Bevat de kleurencoderingssleutel voor eiwitsequentie-uitlijningen | |
| European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI), Tools en databronnen | https://www.ebi.ac.uk/services/all | Webbrowser | Uitgebreide lijst van gratis beschikbare websites, tools en databronnen | |
| Expasy - Swiss Bioinformatica Resource Portal | https://www.expasy.org | Webbrowser | Suite van bio-informatica tools en resources voor eiwitsequentie-analyse die wordt onderhouden door het Swiss Institute of Bioinformatics (SIB) | |
| National Center for Biotechnology Information (NCBI) Conserved Domain Search | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi | Webbrowser | Zoektool om geconserveerde domeinen binnen eiwit- of coderende nucleotidesequenties te identificeren | |
| Pfam 35 | http://pfam.xfam.org | Webbrowser | Eiwitfamilie (Pfam) database, biedt uitlijningen en classificatie van eiwitfamilies en -domeinen | |
| PhyloCSF Track Hub Beschrijving | SignalP 6.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-6.0 | Webbrowser | Voorspelt de aanwezigheid van signaalpeptiden en de locatie van hun splitsingsplaatsen |
| TMHMM - 2.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0 | Webbrowser | Voorspelling van transmembraan-helices in eiwitten | |
| UCSC Genome Browser BLAT Search | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat | Webbrowser | Tool dat wordt gebruikt om genomische regio's te vinden met behulp van DNA- of eiwitsequentie-informatie | |
| UCSC Genome Browser Gateway | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway | Webbrowser | Directe link naar de UCSC Genome Browser Gateway | |
| UCSC Genome Browser Home | https://genome.ucsc.edu/ | Webbrowser | Startpagina van de UCSC Genome Browser | |
| UCSC Genome Browser Track Data Hubs | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgHubConnect#publicHubs | Webbrowser | Directe link naar de Track Data Hubs/Public Hubs-database om te zoeken naar en de PhyloCSF-tracks te laden | |
| UCSC Genome Browser Gebruikershandleiding | https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html | Webbrowser | Uitgebreide gebruikershandleiding met details over het navigeren in de UCSC Genome Browser | |
| WoLF PSORT | https://wolfpsort.hgc.jp | Webbrowser | Tool voor het voorspellen van subcellulaire lokalisatie van eiwitten |
Referenties
- Collins, F. S., Morgan, M., Patrinos, A. The human genome project: lessons from large-scale biology. Science. 300 (5617), 286-290 (2003).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
- Sachidanandam, R., <....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
