Hier beschrijven we het gebruik van een set organelmarkers op basis van fluorescerende eiwitten bij beeldvorming van levende cellen van de ontluikende gist, Saccharomyces cerevisiae.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Visualisatie van gistorganellen met fluorescerende eiwitmarkers
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De ontluikende gist, Saccharomyces cerevisiae, is een klassiek modelsysteem voor het bestuderen van de functie en dynamiek van organellen. In ons eerdere werk hebben we fluorescerende eiwitgebaseerde markers geconstrueerd voor belangrijke organellen en endomembraanstructuren, waaronder de kern, endoplasmatisch reticulum (ER), Golgi-apparaat, endosomen, vacuolen, mitochondriën, peroxisomen, lipidedruppeltjes en autofagosomen. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft de procedures voor het gebruik van deze markers in gist, inclusief DNA-voorbereiding voor gisttransformatie, selectie en evaluatie van transformatoren, fluorescerende microscopische waarneming en de verwachte resultaten. De tekst is gericht op onderzoekers die vanuit andere achtergronden het gebied van gistorganelstudie betreden. Essentiële stappen komen aan bod, evenals technische opmerkingen over overwegingen voor microscoophardware en enkele veelvoorkomende valkuilen. Het biedt een startpunt voor mensen om subcellulaire entiteiten van gisten te observeren door middel van fluorescerende microscopie met levende cellen. Deze tools en methoden kunnen worden gebruikt om subcellulaire lokalisatie van eiwitten te identificeren en organellen te volgen die van belang zijn in time-lapse-beeldvorming.
Inleiding
Subcellulaire compartimentalisatie in membraangebonden organellen is een veelgebruikt principe bij de organisatie van eukaryote cellen. Elk organel vervult specifieke functies. Net als in veel andere aspecten van de eukaryote biologie, is de ontluikende gist, Saccharomyces cerevisiae, een klassiek modelsysteem geweest bij het ophelderen van de basisprincipes van organelorganisatie en -dynamiek. Voorbeelden zijn de baanbrekende ontdekkingen in de eiwitsecretieroute, de peroxisomale eiwitimportroute en de autofagieroute 1,2,3.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Gist stam constructie
- Zorg voor markerplasmiden en een geschikte giststam.
OPMERKING: De plasmiden zijn verkrijgbaar bij Addgene. Dit protocol maakt gebruik van TN124 (MATa ura3 trp1 pho8Δ60 pho13Δ::LEU2), BY4741 (MATa leu2Δ0 ura3Δ his3Δ1 met15Δ0) en DJ03 (BY4741 trp1Δ::MET15) als voorbeelden. Een belangrijke overweging bij de keuze van de stam, afgezien van de aard van de wetenschappelijke vraag, is de compatibiliteit van selectiemarkers. De organelmarkerplasmiden die hier worden beschreven, gebruiken URA3 en TRP1 als selectiemarkers. Daarom moet het geno....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De morfologie en dynamiek van organellen zijn onderhevig aan verandering omdat gistcellen reageren op externe en interne signalen. Hier geven we representatieve beelden van gistorganellen in de mid-logfase (Figuur 3A,B). Zoals eerder vermeld, hebben verschillende organellen hun verschillende morfologische kenmerken, dus zijn ze gemakkelijk te herkennen zonder uitgebreide vergelijking met andere organelmarkers. Deze omvatten ER, mitochondriën.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het hier beschreven protocol biedt een eenvoudige start voor mensen die vanuit andere onderzoeksgebieden binnenkomen om beeldvormende gistorganellen te verkennen. Voordat we verder gaan met specifieke onderwerpen, willen we nog een keer benadrukken dat men zich moet onthouden van overmatig gebruik van automatische functies in beeldvormingssoftware. Microscopiebeelden zijn niet alleen mooie plaatjes, het zijn wetenschappelijke gegevens, en daarom moet hun verwerving en interpretatie dieno.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
De auteurs willen de leden van het Xie-lab bedanken voor hun genereuze hulp bij de voorbereiding van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidie 91957104), de Shanghai Municipal Education Commission (subsidie 2017-01-07-00-02-E00035) en de Shanghai Municipal Science and Technology Commission (subsidie 22ZR1433800).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Adenine | Sangon Biotech | A600013 | |
| Casaminoacid | Sangon Biotech | A603060 | |
| Concanavalin A uit canavalia ensiformis (Jack bean) | Sigma Aldrich | L7647 | |
| D-Glucose | Sangon Biotech | A501991 | |
| Fiji | https://fiji.sc/ | ||
| Glass-bottom petrischaal | NEST | 706001 | Φ35 mm |
| ImageJ | https://imagej.net/ | ||
| Omgekeerde fluorescentiemicroscoop | Olympus | IX83 uitgerust met UPLXAPO 100X olie-immersie objectief, Lumencor Spectra X lichtbron en Hamamatsu Orca Flash4.0 LT camera. | |
| L-Histidine | Sangon Biotech | A604351 | |
| L-Leucine | Sangon Biotech | A100811 | |
| L-Lysine | Sangon Biotech | A602759 | |
| L-Methionine | Sangon Biotech | A100801 | |
| L-Tryptophan | Sangon Biotech | A601911 | |
| Microscope dekglas | CITOTEST | 10222222C | 22 mm x 22 mm, 0.16–0.19 mm |
| Microscope slides | CITOTEST | 1A5101 | 25 mm x 75 mm, 1–1.2 mm |
| Peptone | Sangon Biotech | A505247 | |
| Uracil | Sangon Biotech | A610564 | |
| Visiview | Visitron System GmbH | https://www.visitron.de/products/visiviewr-software.html | |
| Gist extract | Sangon Biotech | A100850 | |
| Gist stikstof base zonder aminozuren | Sangon Biotech | A610507 | |
| YNB zonder aminozuren en ammoniumsulfaat | Sangon Biotech | A600505 |
Referenties
- Levine, B., Klionsky, D. J. Autophagy wins the 2016 Nobel prize in physiology or medicine: Breakthroughs in baker's yeast fuel advances in biomedical research. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (2), 201-205 (2017).
- Spang, A.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
