Verbeterde reproduceerbaarheid en precisie van kwantificering van bacteriegroeigegevens met hoge doorvoer met behulp van een microplaatlezer

Summary

Hier wordt een protocol met hoge doorvoer gepresenteerd om groeigegevens te meten, waaronder groeicurves, groeisnelheid en maximale groeisnelheid. Het protocol werd geverifieerd en gevalideerd met behulp van twee biofilmproducerende bacteriën. De resultaten en aanpak die in dit onderzoek zijn toegepast, kunnen worden uitgebreid naar andere high-throughput-protocollen met behulp van microplaatlezers.

Abstract

Deze studie had tot doel een herhaalbaar, betrouwbaar protocol met hoge doorvoer te ontwikkelen om de bacteriegroei in platen met 96 putjes te volgen en de maximale groeisnelheid te analyseren. De groeicurves en maximale groeisnelheden van twee bacteriesoorten werden bepaald. Kwesties zoals (i) condensatie van het deksel, (ii) correctie van de weglengte, (iii) inoculatiegrootte, (iv) bemonsteringstijdsinterval en (v) ruimtelijke vertekening werden onderzocht. De herhaalbaarheid van het protocol werd beoordeeld met drie onafhankelijke technische replicaties, met een standaarddeviatie van 0,03 tussen de runs. De maximale groeisnelheden van Bacillus mycoides en Paenibacillus toendrae werden bepaald als respectievelijk (gemiddelde ± SD) 0,99 ^h-1 ± 0,03 ^h-1 en 0,85 ^h-1 ± 0,025 ^h-1. Deze bacteriën zijn moeilijker optisch te monitoren vanwege hun affiniteit om samen te klonteren. Deze studie toont het cruciale belang aan van inoculatiegrootte, correctie van de padlengte, opwarming van het deksel, bemonsteringstijdsintervallen en ruimtelijke vooringenomenheid van de putplaat om betrouwbare, nauwkeurige en reproduceerbare gegevens over microplaatlezers te verkrijgen. Het ontwikkelde protocol en de verificatiestappen kunnen worden uitgebreid naar andere methoden met behulp van microplaatlezers en protocollen met hoge doorvoer, waardoor de aangeboren fouten en materiaalkosten van de onderzoekers worden verminderd.

Introduction

De toenemende interesse in multi-omics-manipulatie, inclusief mechanisme- en metabolische studies van bacteriën, benadrukt het belang van high-throughput en geautomatiseerde methoden zoals het registreren van groeigegevens ^1,2. Groeigegevens die kinetische parameters bevatten, zoals maximale groeisnelheden, kunnen helpen bij het karakteriseren van bacteriële reacties op verschillende fysische, chemische en antibacteriële omstandigheden. Gegevens over de groeisnelheid zijn een standaard responsvariabele die wordt gebruikt om potentiële genotype-fenotypes-verbanden^{1 aan het} licht te brengen of om de microbiële veiligheid en houdbaarheid van voedselproducten aan te geven ^3,4. Technieken zoals adaptieve laboratoriumevolutie ^5,6,7, genoombrede screening, bepaalde chemische assays⁸ en verschillende voorwaartse genetische screenings⁹ zijn afhankelijk van groeisnelheden om de resultaten te evalueren.

Optische dichtheidsmetingen (OD) van bacterieculturen zijn een standaard microbiologische methode om de groei van bacteriën te volgen. OD-metingen worden vaak geregistreerd bij een golflengte van 600 nm, afhankelijk van lichtverstrooiing en de celdichtheid ^10,11. De wet van Beer-Lambert verklaart de afhankelijkheid van de OD-waarden van de concentratie (d.w.z. celdichtheid, celaantal), padlengte en absorptiecoëfficiënt. De geometrie en het optische systeem van een spectrofotometer beïnvloeden de OD-metingen¹¹. Klassieke methoden voor OD-metingen kunnen zeer tijdrovend en arbeidsintensief zijn, en de gegevens kunnen een verscheidenheid aan menselijke fouten bevatten. In dit protocol wordt een microplaatlezer gebruikt om de analistentijd met^12,13 en de kans op biologische besmetting te verkleinen. High-throughput analyse met behulp van microplaatlezers wordt breed toegepast in verschillende microbiologische gebieden, zoals het screenen van biofilmproducerende bacteriën^14,15, bacteriegroeiremming¹⁶, gistcelgroei¹⁷, de bepaling van schimmelwerende gevoeligheid¹⁸ en toxiciteitsscreening van nanomaterialen¹⁹.

Een paar onderzoekers hebben protocollen voor de groeisnelheid van bacteriën gepubliceerd met behulp van een microplaatlezer 12,20,21. Een grondig protocol dat de betrouwbaarheid van de verzamelde gegevens onderzoekt, is echter nog niet volledig vastgesteld. Er wordt gemeld dat factoren zoals het type soort 22,23,24 en afdichtingstapes van invloed zijn op de herhaalbaarheid vanwege de ontoereikende zuurstofoverdracht in een plaat met 96 putjes ^25,26. Delaney et al. rapporteerden grote clusters van Methylorubrum extorquens (wildtype stam) in het groeimedium bij gebruik van een microplaatlezer, wat extreem luidruchtige groeigegevens veroorzaakte²⁴. Het probleem werd opgelost door de genen te verwijderen die verband houden met de productie van biofilm²⁴. Door de afscheiding van extracellulaire polymere stoffen hebben biofilmproducerende bacteriën een grotere affiniteit om samen te smelten en celclusters te creëren. Daarom is het een grotere uitdaging om hun groei te volgen met behulp van lichtverstrooiingstechnieken (bijv. spectrofotometers en microplaatlezers).

Dit protocol is bedoeld om stappen vast te stellen om reproduceerbare gegevens te verkrijgen in een high-throughput-methode met behulp van een microplaatlezer. Bacillus mycoides en Paenibacillus toendra's werden gebruikt vanwege hun snelle groei en biofilmproducerende vermogen, die traditioneel een uitdaging zijn bij handmatige en geautomatiseerde benaderingen. Factoren zoals (i) correctie van de weglengte, (ii) condensatie op het deksel, (iii) inoculumgrootte, (iv) bemonsteringstijdsinterval en (v) ruimtelijke vertekening werden onderzocht om de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de gegevens te beoordelen. Dit protocol bevat stappen voor het nauwkeurig monitoren van de bacteriegroei en het meten van specifieke groeisnelheden met behulp van een microplaatlezer.

Protocol

OPMERKING: Alle stappen in dit protocol moeten worden gevolgd in steriele omstandigheden (d.w.z. tussen twee vlammen of een bioveiligheidskast). Alle materialen en gereedschappen worden gedurende 20 minuten geautoclaveerd. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt. Gehandschoende handen worden gedesinfecteerd, nat gehouden met handdesinfectiemiddel of 70% alcoholoplossing gedurende ten minste 1 minuut en daarna niet uit de veiligheidskast gehaald. Anders moet de desinfectieprocedure worden herhaald voordat de handen weer in de veiligheidskast worden gestoken. LET OP: Zorg ervoor dat het ontsmettingsmiddel volledig is verdampt voordat u een open vuur gebruikt.

OPMERKING: Twee bacteriën werden geïsoleerd uit biofiltratie van drinkwater, zoals eerder uitgelegd²⁷ vanwege hun vermogen om biofilm te produceren. Ze werden geïdentificeerd door de full-16S rRNA-sequencing en bij NCBI ingediend als Bacillus mycoides (SAMN10518261) en Paenibacillus toendra (SAMN10452279).

1. Bereiding van bacteriële bouillon in glycerol

1. Weeg 3 g tryptische sojabouillonpoeder (TSB) af en los het op in 100 ml gedestilleerd water. Autoclaveer de bouillon 20 minuten en laat afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg 50 ml TSB toe aan een kolf van 50 ml.
2. Breng de bacteriën over naar agarplaten ^27,28. Pluk met behulp van een lus een kolonie bacteriën van de agarplaat. Voeg de inhoud van de lus toe aan de kolf door de lus voorzichtig rond te draaien. Incubeer de kolf een nacht bij 30 °C ± 1 °C met orbitaal schudden bij 150 tpm.
   NOTITIE: De temperatuur en het schudden moeten worden aangepast aan het type soort.
3. Bereid nog een kolf van 50 ml voor met 47,5 ml TSB. Breng 2,5 ml van de nachtcultuur over in de kolf. Incubeer het gedurende 5-6 uur om OD₆₀₀ = 0,6 0,05 te bereiken (om in de mid-exponentiële fase te komen).
4. Breng de cultuur over in een gesteriliseerde centrifugebuis van 50 ml. Centrifugeer de cultuur bij 2.200 × g gedurende 10 min. Decanteer de bouillon voorzichtig om te voorkomen dat er cellen verloren gaan die zich op de bodem van de tube hebben verzameld.
5. Voeg 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan dezelfde buis en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 2.200 × g . Herhaal deze stap 3x.
6. Stel de OD₆₀₀ van de cellen in op 0,6 0,05 door met een pipet een voldoende hoeveelheid PBS-oplossing te titreren. Registreer nauwkeurig de toegevoegde hoeveelheid PBS voor toekomstig gebruik.
7. Titreer glycerol tot de suspensie om 20% v/v te bereiken. Sluit de buis en vortex af gedurende 15 s.
8. Breng 1,5 ml van de suspensie over naar cryovials van 2 ml. Doe de cryovials in een geschikte doos en bewaar ze in een vriezer bij -80 °C.

2. Bereid 's nachts cultuur voor.

1. Laat de cryovials met bacteriebouillon 30 minuten ontdooien bij kamertemperatuur of tot de inhoud vloeibaar is.
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het ontdooiproces niet te versnellen.
2. Bereid een gesteriliseerde buis voor met 10 ml TSB. Breng 50 μL van de suspensie over in de buis. Incubeer de buis een nacht (16-18 uur) bij 30 °C ± 1 °C met orbitaal schudden bij 150 tpm.

3. Bereid het inoculum voor.

1. Bereid een tube voor met 10 ml gesteriliseerde TSB. Breng 500 μL van de nachtcultuur over in de buis. Incubeer het gedurende 6-8 uur om OD₆₀₀ = 0,6 0,05 te bereiken (of bereik de mid-exponentiële fase).
2. Breng de cultuur over in een centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer de buis gedurende 10 minuten bij 2.200 × g . Decanteer de bouillon voorzichtig.
3. Voeg 5 ml PBS toe en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 2.200 × g . Herhaal deze stap 3x.
4. Stel de OD₆₀₀ van de cellen in op 0,6 0,05 door PBS-oplossing te titreren met behulp van een pipet. Registreer nauwkeurig de toegevoegde hoeveelheid PBS voor toekomstig gebruik.

4. Groeimedium overbrengen naar de microplaatlezer

1. Kies een transparante, steriele putplaat met platte bodem en een deksel (d.w.z. plaat met 96 putjes, plaat met 6 putjes, plaat met 12 putjes).
2. Meet de padlengtecorrectie voor de microtiterplaat met behulp van DI-water voordat u het protocol uitvoert, zoals uitgelegd in stap 1.10.
3. Teken een referentietabel op basis van de geselecteerde putplaat om de posities van de monsters te specificeren voordat u ze laadt. Teken bijvoorbeeld een tafel van 8 x 12 voor een plaat met 96 putjes.
   OPMERKING: De referentietabel voorkomt verwarring tijdens de incubatie- en resultatenverzamelingsstappen.
4. Plaats de volgende items in een bioveiligheidskast: een microplaat met deksel, pipettor 1.000 μL en 200 μL, 1.000 μL en 200 μL pipetpunten, verschillende cryovials, een bekerglas van 25 ml, het groeimedium en het inoculum.
   OPMERKING: De genoemde items moeten aseptisch naar de bioveiligheidskast worden overgebracht.
5. Voeg 10 ml groeimedium toe aan het bekerglas. Breng de berekende hoeveelheid entmateriaal over naar het bekerglas met het groeimedium.
   OPMERKING: De inoculumverhoudingen in dit protocol zijn 1% en 5%. Om bijvoorbeeld een inoculumverhouding van 5% en 1% te bereiken, voegt u 500 μL en 100 μL van het inoculum toe aan respectievelijk 9,5 ml en 9,9 ml van het groeimedium.
6. Schud het bekerglas na het toevoegen van het entmateriaal voorzichtig om een gelijkmatige verdeling te krijgen. Doseer 200 μl van het geëoculeerde medium in de aangewezen putjes met behulp van de referentietabel. Kies ten minste drie putjes om als controle te fungeren door 200 μL van het groeimedium toe te voegen (zonder inoculum).
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de controleputjes duidelijk zijn gemarkeerd in de referentietabel. Als er in deze putten enige groei (besmetting) wordt waargenomen, moet het experiment worden herhaald.
7. Doseer 200 μL DI-water in de randputten waar de verdampingssnelheid hoger is. Plaats het deksel voorzichtig voordat u de plaat met 96 putjes uit de veiligheidskast haalt. Plaats de plaat met 96 putjes voorzichtig in de plaatlezer en zorg ervoor dat er geen plotselinge bewegingen zijn.

5. Instellingen microplaatlezer

1. Schakel de microplaatlezer in en gebruik vervolgens de ingebouwde software om het aangepaste protocol te maken. Open in Taakbeheer het protocol en kies Nieuw maken | Standaard protocol. Open de procedure en pas de instellingen als volgt aan:
   1. Stel de temperatuur in op 30 °C (of de beoogde waarden) met behulp van Set Temperature.
   2. Klik op Incubator On en stel vervolgens de Gradient in op 1 °C.
      OPMERKING: Om onbetrouwbare gegevens als gevolg van condensatie op het deksel te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat Gradiënt is ingesteld op 1 °C.
   3. Kies de optie Voorverwarmen en zorg voor een gelijkmatige warmteverdeling langs de putplaat.
   4. Open Start Kinetic en kies de gewenste incubatieduur met behulp van de looptijd (bijv. 12:00:00 of 24:00:00, enz.) en het interval tussen de metingen voor 00:30:00 (staat voor 30 min) of 01:00:00 (staat voor 1 uur).
      OPMERKING: Het lezen van elke plaat met 96 putjes duurt ongeveer 1 minuut.
   5. Stel de schudinstellingen als volgt in: open Schudden; stel de Shake-modus in op Lineair; klik op Continu schudden; en stel de frequentie in op 567 cpm (of een andere gewenste waarde).
   6. Stel de OD-leesinstellingen als volgt in: klik op Lezen | Absorptie; selecteer Eindpunt/Kinetiek en Monochromatoren; stel de golflengte in op 600 nm; en klik op Valideren | Sla op om het op te slaan als een nieuw protocol met de juiste naam en datum.

6. Groeigegevens registreren

1. Open Taakbeheer | Lees nu.
2. Kies het opgeslagen protocol en klik vervolgens op OK om het protocol te starten.
3. Sla de meetwaarden op voor gegevensanalyse.

7. Gegevensanalyse

1. Breng de OD_{600-resultaten} (groeigegevens) over naar spreadsheetformaat. Klik in het resultatengedeelte op de afbeeldingsoptie voor elke put om de uiteindelijke groeicurves te bekijken.
2. Open het spreadsheetbestand en herschik de opgenomen gegevens op basis van de referentietabel. Trek de gemiddelde waarde van de lege lezingen af van de andere lezingen.
   OPMERKING: Blanco's zijn de OD-waarden op tijdstip nul. In dit protocol worden OD_600-waarden in aanmerking genomen voor berekening. Celdichtheid kan worden gebruikt als de kalibratiecurve voor OD₆₀₀ versus celgetal beschikbaar is.

8. Bepaling van de groeisnelheid

1. Gebruik de overgedragen gegevens in de spreadsheet die in stap 1.6 is gemaakt. Gebruik de hieronder beschreven methode en vergelijking (1) om de groeisnelheid te evalueren.
   (1)
   waarbij μ de groeisnelheid is, OD_i de OD₆₀₀ in elk tijdstip is, OD_i-1 de initiële OD_600-waarde in het laatste tijdstip is, t_i en t_i-1 de tijdsverschillen zijn tussen de twee genoemde punten (bijv. 0,5 voor tijdsintervallen van 30 minuten, 1 voor tijdsintervallen van 1 uur).
2. Bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie van vijf opeenvolgende groeipercentages met behulp van de gewenste data-analysesoftware. Merk op dat het grootste gemiddelde met de laagste standaarddeviatie de maximale groeisnelheid (μ_m) ¹² is.

9. Ruimtelijke vooringenomenheid bepalen

OPMERKING: Microplaatlezers en -platen introduceren vertekening in de resultaten. Het is van cruciaal belang om de ruimtelijke vertekeningen van de platen die in een specifieke microplaatlezer worden gebruikt, te beoordelen om de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de resultaten te garanderen. Gebruik de volgende stappen om dat te bereiken:

1. Herhaal stap 1.2-1.6.
2. Noteer de gegevens en analyseer deze volgens stap 1.7 en stap 1.8 om de groeisnelheid voor elke put te berekenen.
3. Maak een heatmap om de veranderingen in de groeisnelheid in de plaat met 96 putjes te visualiseren.
4. Voer de statistische analyse uit (zie de aanvullende tabellen) en zorg ervoor dat er geen significante verschillen tussen de putten zijn.
   OPMERKING: Het is essentieel om in alle putjes hetzelfde type bacterie en dezelfde inoculumgrootte te gebruiken.

10. Validatie van OD-metingen en correctiefactor van het traject

OPMERKING: Het bepalen van de padlengtecorrectiefactor is cruciaal om de gegevens te valideren en de betrouwbaarheid en validiteit op verschillende apparaten te garanderen.

1. Gebruik stap 1.2 en stap 1.3 om het nachtelijke inoculum van B. mycoides voor te bereiden.
2. Bereid drie gesteriliseerde kolven van 50 ml voor en voeg 49,5 ml verse TSB toe aan elke kolf. Voeg aseptisch 500 μl van het inoculum toe aan elke kolf in een veiligheidskast. Voeg 50 ml niet-geïnoculeerde TSB toe aan een gesteriliseerde kolf, die als controle zal dienen.
3. Incubeer de kolven bij 30 °C en 150 tpm. Neem elke 30 minuten aseptisch monsters uit elke kolf en lees OD₆₀₀ af en noteer deze in de spectrofotometer.
4. Voeg 9,9 ml TSB toe aan een bekerglas van 25 ml. Voeg 100 μl inoculum toe aan het bekerglas en schud voorzichtig.
5. Voeg 200 μl van het mengsel in het bekerglas toe aan de zes putjes in een selecte kolom op een plaat met 96 putjes. Voeg ter controle 200 μl niet-geënte TSB toe aan drie putjes. Vul de randputjes met 200 μL DI-water.
6. Plaats het deksel en breng de plaat met 96 putjes voorzichtig over naar de microplaatlezer. Volg stap 1.5 en stap 1.6 om de groeigegevens vast te leggen.
7. Zet de OD₆₀₀ van de microplaatlezer uit tegen de OD₆₀₀ van de spectrofotometer. Merk op dat de helling de offset is tussen de twee sets metingen, de zogenaamde padlengtecorrectiefactor.
   OPMERKING: De incubatie van de couveuse en de microplaatlezer moet tegelijkertijd op dezelfde dag worden uitgevoerd.

Results

OD-leesvalidatie en pathlengtecorrectiefactor
Gesplitste monsters van B. mycoides-cultuur werden op verschillende tijdstippen genomen en gemeten met behulp van de microplaatlezer en de spectrofotometer (Figuur 1A). Deze stap werd genomen om de resultaten op verschillende apparaten te valideren. De OD_600-gegevens correleerden, maar kwamen niet overeen (Figuur 1B). De correlatie was lineair ...

Discussion

Microplaatlezers zorgen voor het verkrijgen van consistente en herhaalbare groeisnelheden. Deze technologie minimaliseert menselijke fouten en maakt high-throughput sampling mogelijk. De kleine hoeveelheid cultuur die per monster nodig is, maakt deze aanpak tot een aantrekkelijk, goedkoop alternatief voor celtellingen met behulp van kolven of reageerbuisjes. Microplaatlezers maken een grote steekproefomvang mogelijk, waardoor de statistische power wordt vergroot en vervolgens betrouwbare...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Centrifuge tubes - 15 mL	ThermoFisher- Scientific	339650	Steriele
Centriguge tubes - 50 mL	ThermoFisher- Scientific	339652	Steriele
Disposable inoculating loop, 10 µL	Cole-Parmer	UZ-06231-08	Steriele
Erlenmeyer flasks - 250 mL	Cole-Parmer	UZ-34502-59	Glas
Isopropanol	ThermoFisher- Scientific	396982500	≥99,0
Phosphate Buffer Saline	Sigma-Aldrich	P4417
Pipett tips 1,000 µL	ThermoFisher- Scientific	UZ-25001-76
Pipett tips 10 mL	ThermoFisher- Scientific	UZ-25001-83
Pipett tips 200 µL	ThermoFisher- Scientific	UZ-25001-85
Pipett tips 5 mL	ThermoFisher- Scientific	UZ-25001-80
Pipettor 1,000 µL	Cole-Parmer	UZ-07909-11
Pipettor 10 mL	Cole-Parmer	UZ-07909-15
Pipettor 200 µL	Cole-Parmer	UZ-07909-09
Pipettor 5 mL	Cole-Parmer	UZ-07859-30
Tryptic Soy Broth	Millipore	22091	Geschikt voor microbiologie