Verbeterde reproduceerbaarheid en precisie van kwantificering van bacteriegroeigegevens met hoge doorvoer met behulp van een microplaatlezer

Leili Abkar; Florentin M. Wilfart; Marta Piercey; Graham A. Gagnon

doi:10.3791/63849

Method Article

Verbeterde reproduceerbaarheid en precisie van kwantificering van bacteriegroeigegevens met hoge doorvoer met behulp van een microplaatlezer

DOI:

10.3791/63849

⸱

July 27th, 2022

Leili Abkar¹ , Florentin M. Wilfart² , Marta Piercey³ , Graham A. Gagnon⁴

¹Chemical and Biological Engineering Department, University of British Columbia, ²Process Engineering and Applied Science, Dalhousie University, ³Food Science and Technology, Dalhousie University, ⁴Center for Water Resources Studies, Civil and Resource Engineering, Dalhousie University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een protocol met hoge doorvoer gepresenteerd om groeigegevens te meten, waaronder groeicurves, groeisnelheid en maximale groeisnelheid. Het protocol werd geverifieerd en gevalideerd met behulp van twee biofilmproducerende bacteriën. De resultaten en aanpak die in dit onderzoek zijn toegepast, kunnen worden uitgebreid naar andere high-throughput-protocollen met behulp van microplaatlezers.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie had tot doel een herhaalbaar, betrouwbaar protocol met hoge doorvoer te ontwikkelen om de bacteriegroei in platen met 96 putjes te volgen en de maximale groeisnelheid te analyseren. De groeicurves en maximale groeisnelheden van twee bacteriesoorten werden bepaald. Kwesties zoals (i) condensatie van het deksel, (ii) correctie van de weglengte, (iii) inoculatiegrootte, (iv) bemonsteringstijdsinterval en (v) ruimtelijke vertekening werden onderzocht. De herhaalbaarheid van het protocol werd beoordeeld met drie onafhankelijke technische replicaties, met een standaarddeviatie van 0,03 tussen de runs. De maximale groeisnelheden van Bacillus mycoides en Paenibacillus toendrae werden bepaald als respectievelijk (gemiddelde ± SD) 0,99 ^h-1 ± 0,03 ^h-1 en 0,85 ^h-1 ± 0,025 ^h-1. Deze bacteriën zijn moeilijker optisch te monitoren vanwege hun affiniteit om samen te klonteren. Deze studie toont het cruciale belang aan van inoculatiegrootte, correctie van de padlengte, opwarming van het deksel, bemonsteringstijdsintervallen en ruimtelijke vooringenomenheid van de putplaat om betrouwbare, nauwkeurige en reproduceerbare gegevens over microplaatlezers te verkrijgen. Het ontwikkelde protocol en de verificatiestappen kunnen worden uitgebreid naar andere methoden met behulp van microplaatlezers en protocollen met hoge doorvoer, waardoor de aangeboren fouten en materiaalkosten van de onderzoekers worden verminderd.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De toenemende interesse in multi-omics-manipulatie, inclusief mechanisme- en metabolische studies van bacteriën, benadrukt het belang van high-throughput en geautomatiseerde methoden zoals het registreren van groeigegevens ^1,2. Groeigegevens die kinetische parameters bevatten, zoals maximale groeisnelheden, kunnen helpen bij het karakteriseren van bacteriële reacties op verschillende fysische, chemische en antibacteriële omstandigheden. Gegevens over de groeisnelheid zijn een standaard responsvariabele die wordt gebruikt om potentiële genotype-fenotypes-v....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Alle stappen in dit protocol moeten worden gevolgd in steriele omstandigheden (d.w.z. tussen twee vlammen of een bioveiligheidskast). Alle materialen en gereedschappen worden gedurende 20 minuten geautoclaveerd. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt. Gehandschoende handen worden gedesinfecteerd, nat gehouden met handdesinfectiemiddel of 70% alcoholoplossing gedurende ten minste 1 minuut en daarna niet uit de veiligheidskast gehaald. Anders moet de desinfectieprocedure worden herhaald voordat de handen weer in de veiligheid....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OD-leesvalidatie en pathlengtecorrectiefactor
Gesplitste monsters van B. mycoides-cultuur werden op verschillende tijdstippen genomen en gemeten met behulp van de microplaatlezer en de spectrofotometer (Figuur 1A). Deze stap werd genomen om de resultaten op verschillende apparaten te valideren. De OD_600-gegevens correleerden, maar kwamen niet overeen (Figuur 1B). De correlatie was lineair .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microplaatlezers zorgen voor het verkrijgen van consistente en herhaalbare groeisnelheden. Deze technologie minimaliseert menselijke fouten en maakt high-throughput sampling mogelijk. De kleine hoeveelheid cultuur die per monster nodig is, maakt deze aanpak tot een aantrekkelijk, goedkoop alternatief voor celtellingen met behulp van kolven of reageerbuisjes. Microplaatlezers maken een grote steekproefomvang mogelijk, waardoor de statistische power wordt vergroot en vervolgens betrouwbare.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door de Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) / Halifax Water Industrial Research Chair in Water Quality and Treatment (Grant No. IRCPJ 349838-16). Het team van auteurs wil ook de hulp van Anita Taylor erkennen bij het beoordelen van dit artikel.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Centrifuge tubes - 15 mL	ThermoFisher- Scientific	339650	Sterile
Centriguge tubes - 50 mL	ThermoFisher- Scientific	339652	Sterile
Disposable inoculating loop , 10 µL	Cole-Parmer	UZ-06231-08	Sterile
Erlenmeyer flasks - 250 mL	Cole-Parmer	UZ-34502-59	Glass
Isopropanol	ThermoFisher- Scientific	396982500	≥99.0
Phosphate Buffer Saline	Sigma-Aldrich	P4417
Pipett tips 1,000 µL	ThermoFisher- Scientific	UZ-25001-76
Pipett tips 10 mL	ThermoFisher- Scientific	UZ-25001-83
Pipett tips 200 µL	ThermoFisher- Scientific	UZ-25001-85
Pipett tips 5 mL	ThermoFisher- Scientific	UZ-25001-80
Pipettor 1,000 µL	Cole-Parmer	UZ-07909-11
Pipettor 10 mL	Cole-Parmer	UZ-07909-15
Pipettor 200 µL	Cole-Parmer	UZ-07909-09
Pipettor 5 mL	Cole-Parmer	UZ-07859-30
Tryptic Soy Broth	Millipore	22091	Suitable for microbiology

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reuß, D. R., et al. Large-scale reduction of the Bacillus subtilis genome: Consequences for the transcriptional network, resource allocation, and metabolism. Genome Research. 27 (2), 289-299 (2017).
Sparkes, A., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Verbeterde reproduceerbaarheid en precisie van kwantificering van bacteriegroeigegevens met hoge doorvoer met behulp van een microplaatlezer

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles