Method Article

Geavanceerde beeldvorming met hoge resolutie van virusassemblages in vloeistof en ijs

DOI:

10.3791/63856

⸱

July 20th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Materials Science and Engineering, McMaster University, 3Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 4Molecular, Cellular, and Integrative Biosciences Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 5Materials Research Institute, Pennsylvania State University, 6Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 7Applications team, Direct Electron, 8Application Scientist, Protochips, Inc., 9Department of Biology, Wake Forest University

* These authors contributed equally

In This Article

Retraction Notice

This article, Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice, has been retracted at the request of the Editors-in-Chief due to concerns about the integrity of the data presented. These concerns included: (a) Figure 3 was found to contain noise without structural features expected for a protein capsid; (b) critical half-map data necessary to verify resolution claims were not deposited; (c) there was a lack of system logs or controls to rule out stage drift regarding observed movements in Figure 3; and (d) the absence of protocols to address Brownian motion and beam-induced drift significantly weakened the reliability of the findings.<br/><br/>The corresponding author's indication she principally relied on RMEASURE program did not sufficiently address the publisher's concerns. After consulting external experts, the Editors-in-Chief concluded that the issues remain unresolved, and the data do not meet JoVE's standards for scientific reliability and reproducibility, requiring retraction. The corresponding author disagrees with the grounds for retraction. Co-authors DiCecco, Grandfield and Bator agree with the retraction. Other co-authors were unavailable for comment.

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier worden protocollen beschreven om virusassemblages voor te bereiden die geschikt zijn voor vloeistof-EM- en cryo-EM-analyse op nanoschaal met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De interesse in vloeistof-elektronenmicroscopie (liquid-EM) is de afgelopen jaren omhooggeschoten omdat wetenschappers nu real-time processen op nanoschaal kunnen observeren. Het is uiterst wenselijk om cryo-EM-informatie met hoge resolutie te koppelen aan dynamische waarnemingen, omdat veel gebeurtenissen zich op snelle tijdschalen voordoen - in het millisecondebereik of sneller. Verbeterde kennis van flexibele structuren kan ook helpen bij het ontwerpen van nieuwe reagentia om opkomende pathogenen, zoals SARS-CoV-2, te bestrijden. Wat nog belangrijker is, het bekijken van biologische materialen in een vloeibare omgeving biedt een unieke glimp van hun prestaties in het menselijk lichaam. Hier worden nieuw ontwikkelde methoden gepresenteerd om de nanoschaaleigenschappen van virusassemblages in vloeibaar en glasachtig ijs te onderzoeken. Om dit doel te bereiken, werden goed gedefinieerde monsters gebruikt als modelsystemen. Vergelijkingen van monstervoorbereidingsmethoden en representatieve structurele informatie worden naast elkaar gepresenteerd. Sub-nanometerkenmerken worden weergegeven voor structuren die zijn opgelost in het bereik van ~ 3,5-Å-10 Å. Andere recente resultaten die dit complementaire kader ondersteunen, omvatten dynamische inzichten van vaccinkandidaten en op antilichamen gebaseerde therapieën afgebeeld in vloeistof. Over het algemeen bevorderen deze correlatieve toepassingen ons vermogen om moleculaire dynamica te visualiseren en bieden ze een unieke context voor hun gebruik in de menselijke gezondheid en ziekte.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomedisch onderzoek verbetert ons begrip van de menselijke gezondheid en ziekte door de ontwikkeling van nieuwe technologieën. Beeldvorming met hoge resolutie transformeert ons beeld van de nanowereld - waardoor we cellen en moleculen in prachtig detailkunnen bestuderen 1,2,3,4,5. Statische informatie van dynamische componenten zoals zachte polymeren, eiwitassemblages of menselijke virussen onthult slechts een beperkte momentopname van hun complexe verhaal. Om beter te begrijpen hoe moleculaire entiteiten werken, moeten hun structuur en functie gezamenlijk worden onderzocht.

Recente ontwikkelingen in de productie van materialen zoals atomair dun grafeen of op silicium gebaseerde microchips bieden nieuwe mogelijkheden voor real-time structuurfunctieanalyse met behulp van transmissie-elektronenmicroscopen (TEMs). Deze materialen kunnen hermetisch afgesloten kamers creëren voor live EM-beeldvorming 6,7,8,9,10,11. Het nieuwe veld van liquid-EM, de kamertemperatuurcorrelecorrel met cryo-EM, biedt ongekende weergaven van harde of zachte materialen in oplossing, waardoor wetenschappers tegelijkertijd de structuur en dynamiek van hun monster kunnen bestuderen. Liquid-EM-toepassingen omvatten real-time opnames van therapeutische nanodeeltjes die interageren met kankerstamcellen en veranderingen in de moleculaire fijne kneepjes van virale pathogenen 12,13,14.

Net zoals methodologische vooruitgang de resolutierevolutie op het gebied van cryo-EM heeft gestimuleerd, zijn nieuwe technieken en methoden nodig om het gebruik van liquid-EM als een high-throughput tool voor de wetenschappelijke gemeenschap uit te breiden. Het algemene doel van de hier gepresenteerde methoden is om de protocollen voor de voorbereiding van vloeibare EM-monsters te stroomlijnen. De reden achter de ontwikkelde technieken is om nieuwe microchipontwerpen en autoloader-apparaten te gebruiken, geschikt voor zowel vloeistof- als cryo-EM-gegevensverzameling (figuur 1) 7,14,15,16,17. De assemblages worden mechanisch afgedicht met behulp van standaard rasterclips voor geautomatiseerde instrumenten, zoals de Krios, die plaats biedt aan meerdere monsters per sessie of een F200C TEM (figuur 2). Deze methodologie breidt het gebruik van beeldvorming met hoge resolutie verder uit dan standaard cryo-EM-toepassingen die bredere doeleinden voor real-time materiaalanalyse demonstreren.

In het huidige videoartikel worden protocollen gepresenteerd voor het bereiden van virusassemblages in vloeistof met en zonder in de handel verkrijgbare monsterhouders. Met behulp van de gespecialiseerde monsterhouder voor liquid-EM kunnen dunne vloeibare monsters structurele informatie bieden die vergelijkbaar is met cryo-EM-monsters, evenals dynamische inzichten van de monsters. Ook worden methoden gedemonstreerd voor het voorbereiden van vloeibare monsters met behulp van autoloader-gereedschappen voor routines met hoge doorvoer. Het grote voordeel ten opzichte van andere technieken is dat geautomatiseerde monsterproductie de gebruiker in staat stelt om zijn monsters snel te beoordelen op optimale dikte en elektronendosering voorafgaand aan het verzamelen van gegevens. Deze screeningstechniek identificeert snel ideale gebieden voor real-time opnames in vloeistof of ijs 12,14,18,19. Met het oog op de bepaling van de 3D-structuur kan liquid-EM een aanvulling vormen op de reeds lang bestaande cryo-EM-methoden die in cryo-EM zijn geïmplementeerd. Lezers die conventionele TEM- of cryo-EM-technologieën gebruiken, kunnen overwegen om liquid-EM-workflows te gebruiken om nieuwe, dynamische observaties van hun monsters te bieden op een manier die hun huidige strategieën aanvult.

Virusmonsters die in dit protocol worden gebruikt, omvatten gezuiverde adeno-geassocieerde virussubtype 3 (AAV) verkregen als een geschenk en gekweekt onder standaardomstandigheden12. Ook werden niet-infectieuze SARS CoV-2 subvirale assemblages gebruikt die zijn afgeleid van het serum van COVID-19-patiënten12 en verkregen uit een commerciële bron. Ten slotte werden gezuiverde simian rotavirus (SA11-stam) dubbellaagse deeltjes (DLPs) verkregen uit het laboratorium van Dr. Sarah M. McDonald Esstman aan de Wake Forest University en gekweekt met behulp van standaardomstandigheden 6,17. Softwarepakketten die hier worden beschreven, zijn vrij beschikbaar en de koppelingen zijn beschikbaar in de sectie Materiaaltabel.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Laden van de monsterhouder voor liquid-EM

  1. Reinig de siliciumnitride (SiN) microchips door elke chip gedurende 2 minuten in 150 ml aceton te incuberen, gevolgd door incubatie in 150 ml methanol gedurende 2 minuten. Laat chips drogen in laminaire luchtstroom.
  2. Plasma reinigt de gedroogde chips met behulp van een gloeid-ontladingsinstrument dat werkt onder standaardomstandigheden van 30 W, 15 mA gedurende 45 s met behulp van Argon-gas.
  3. Laad een droge basismicrochip in de punt van de monsterhouder. Voeg ~0,2 μL monster (0,2-1 mg/ml virusassemblages in 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2) toe aan de basischip. Na een incubatiestap van 1-2 minuten plaatst u de bovenste chip op de natte basischip met het monster.
  4. Klem de assemblage samen tot een hermetisch afgesloten behuizing, mechanisch op zijn plaats gehouden door drie messing schroeven. Na het afdichten van de assemblage pompt u de punt naar 10-6 Torr met behulp van een droog pompstation met turbocompressor. De houder is nu klaar om in de TEM te worden gestoken.
    OPMERKING: De selecte houder heeft geen koelmogelijkheden en wordt niet gebruikt voor cryo-EM.

2. Productie van microchip sandwichassemblages

OPMERKING: Verschillende SiN- of siliciumdioxide (SiO) microchips kunnen rechtstreeks uit de verzonden gelverpakkingen worden gebruikt. Koolstofgecoate gouden roosters kunnen ook direct worden gebruikt zoals geleverd.

  1. Plasma reinigt de microchips en koolstofroosters met behulp van een gloeiontladingsinstrument dat werkt onder standaardomstandigheden van 30 W, 15 mA gedurende 45 s met behulp van Argon-gas.
  2. Voeg ~2 μL monster toe in 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2 op een gloeiende microchip geplaatst op een gelverpakking. Verwijder overtollige oplossing (~50%) met een filtreerpapier of een pipet. Voeg na een incubatiestap van 1-2 minuten het gloeiende koolstofrooster toe aan de natte microchip die het monster bevat.
  3. Klem de assemblage samen met behulp van een enkele kantelbare monsterhouder of autoloader-rasterclips bij kamertemperatuur om een hermetisch afgesloten behuizing te vormen. Plaats voor de autoladerklemmen de sandwichassemblage op de onderste C-clip, plaats de bovenste clip bovenop de assemblage en gebruik het standaard klemgereedschap om de assemblage samen te dichten.
    OPMERKING: De klemprocedure die hier wordt uitgevoerd, gebruikt dezelfde stappen als voor cryo-EM-rasterklemmen, maar dan bij kamertemperatuur. Geklemde monsters kunnen 2 maanden of langer worden bewaard voordat ze worden afbeeldd, terwijl de vloeistof in de behuizing behouden blijft. Er wordt geen lekcontrole gebruikt met een monsterhouder op kamertemperatuur of de autoloader.
  4. Het exemplaar is nu klaar om in de TEM te worden geplaatst. Onderzoek monsters die in autoloaders zijn geplaatst onder cryo-omstandigheden of bij kamertemperatuur.

3. Beeldvorming van monsters met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop

  1. Liquid-EM beeldvorming
    1. Laad de monsterhouder in de TEM die is uitgerust met een veldemissiepistool (FEG) en werkt bij 200 kV.
    2. Schakel het pistool in en pas de eucentrische hoogte van het microscoopstadium aan ten opzichte van het monster met behulp van de wobbler-functie, waarbij het monster in de kolom van -15° naar +15° wordt gekanteld. Met deze procedure wordt het stadium in de Z-richting aangepast aan de dikte van het monster. En zorgt voor een nauwkeurige vergroting tijdens het opnemen van beelden.
    3. Neem beelden op als langbeeldfilms met behulp van het in situ-pakket dat is geïntegreerd met een directe detector met een pixelafstand van 6 μm (video 1 en video 2). Individuele beelden kunnen ook worden opgenomen met behulp van het seriële softwarepakket20 voor gegevensverzameling, waarbij geautomatiseerde beeldvormingsroutines worden geïmplementeerd. Verkrijg beelden onder omstandigheden met een lage dosis bij vergrotingen variërend van 28.000x-92.000x en 40 frames per seconde.
    4. Pas de belichtingstijden (0,25-1 s) aan om stralingsschade aan het monster te minimaliseren. Gebruik een onscherptebereik van -1-4 μm bij de opgegeven vergroting. Als er een dikke oplossing wordt aangetroffen, gebruikt u hogere onscherptewaarden of selecteert u een ander interessegebied.
    5. Zorg ervoor dat de oplossing aanwezig is in de monsters tijdens de beeldvormingssessie door de elektronenbundel te richten op een opofferingsgebied dat niet wordt gebruikt voor gegevensverzameling, totdat bellen worden gevormd (aanvullende figuur 1).
  2. Cryo-EM beeldvorming
    1. Laad de geknipte EM-roosters of microchipsandwiches in de TEM die is uitgerust met een FEG en werkt op 300 kV. Schakel het pistool in en pas de eucentrische hoogte van de microscooptrap aan, volgens een vergelijkbare procedure die hierboven is beschreven voor de vloeistof-TEM (stap 3.1.2).
    2. Neem individuele beelden op met behulp van het analysesysteem voor één deeltjes dat in het microscoopsysteem is geïntegreerd, terwijl geautomatiseerde beeldvormingsroutines worden geïmplementeerd. Neem beelden op onder omstandigheden met lage doses met behulp van de directe elektronendetector voor analyse van één deeltjes met een pixelafstand van 14 μm bij een vergroting van 59.000x en 40 frames per seconde.
    3. Gebruik een onscherptebereik van 1-4 μm bij de opgegeven vergroting. Als dikke lagen glasachtig ijs worden aangetroffen, gebruikt u hogere onscherptewaarden of selecteert u een ander gebied voor gegevensverzameling.

4. Data-analyse en 3D-structuurvergelijkingen

  1. Analyse van adeno-geassocieerd virus (AAV) in vloeibaar en glasachtig ijs
    1. Verwerk films voor AAV-deeltjes in vloeistof en ijs met behulp van RELION-3.08 programma21 of andere beeldverwerkingssoftware22. Voer bewegingscorrectie uit met MotionCor2 v1.2.3.
    2. Eenmaal gecorrigeerd, extraheer deeltjes met behulp van de auto-picking tool in het programma softwarepakket. Typische doosformaten zijn 330 pixels voor vloeibare exemplaren en 350 pixels voor ijsmonsters.
    3. Bereken de eerste reconstructies met behulp van C1-symmetrie met behulp van de 3D-initiële modelroutine van het programma en / of de ab-initio-modelopties in het gegevensverwerkingssoftwarepakket. Gebruik in het programma een regularisatieparameter van T = 4 en een pixelgrootte van 1,01 Å voor vloeibare monsters en 1,13 Å voor ijsmonsters.
    4. Gebruik een maskerwaarde van 300 Å tijdens de verfijningsprocedures. Voer verfijningsprotocollen uit in de gegevensverwerkingssoftware met behulp van I1-symmetrie om meerdere EM-kaarten te verkrijgen. De verwachte structurele resolutie kan in het bereik van 4 Å of beter liggen. Gebruik deeltjesequivalentie en implementeer icosaëstrale symmetrie bij 16.800 voor vloeistof en 15.240 voor ijs12,14.
      OPMERKING: Schattingen zijn gebaseerd op de gold-standard Fourier shell correlation (FSC) criteria.
    5. Maskeer EM-kaarten op ~250 Å en onderzoek de resultaten met behulp van een moleculair structuuranalysesoftwarepakket23,24. In figuur 3 worden segmenten weergegeven in stappen van ~5 nm.
    6. Extract capsid protein (VP1) subeenheden uit de EM-kaarten ter vergelijking. Kwantificeer dynamische veranderingen tussen EM-structuren op basis van de deeltjesdiametermetingen (aanvullende figuur 2) en visualiseer vervolgens met behulp van de Morph-kaartfunctie in de software.
  2. Analyse van SARS-CoV-2 subvirale assemblages in vloeistof
    1. Verwerk films met behulp van het RELION-3.08 programma. Corrigeer voor beelddrift en door straal geïnduceerde beweging met MotionCor2 v1.2.3. Correct voor de contrastoverdrachtsfunctie (CTF) van de microscoop.
    2. Gebruik de auto-picking tool in het programma om virale assemblages met een doosgrootte van 800 pixels te selecteren. Voor computationele efficiëntie kunnen geëxtraheerde deeltjes worden aangepast tot 256 pixels. Verkrijg een eerste model met behulp van C1-symmetrie in het programma met een regularisatieparameter van T = 2 en 1,66 Å pixelgrootte.
    3. Voer 3D-verfijning uit in het programma om een EM-kaart te verkrijgen, een voorbeeld wordt weergegeven bij ~ 8,25 Å volgens standaard FSC-criteria (figuur 4). Visualiseer EM-kaarten met behulp van de moleculaire structuuranalysesoftware met plakjes verhoogd bij 25 nm, zoals weergegeven in figuur 4.
  3. Analyse van rotavirus dubbellaagse deeltjes (DLP's) in glasachtig ijs
    1. Verwerk films voor rotavirus-DLP's met behulp van andere beeldverwerkingssoftware. Gebruik MotionCor2 v1.2.3 om te corrigeren voor drift in de afbeeldingen. Gebruik Patch CTF-schatting om te corrigeren voor lenseffecten op de afbeeldingen.
    2. Extraheer deeltjes met behulp van de auto-picking tool in de software met een doosgrootte van 950 pixels. Bekijk een steekproef van de grootte van de doos als dat nodig is voor computerdoeleinden.
    3. Bereken de eerste modellen met ab-initio-opties en C1-symmetrie . Gebruik verfijningsparameters, waaronder een pixelgrootte van 1,47 Å en een maskerwaarde van 800 Å.
    4. Voer extra verfijningsroutines uit terwijl u I1-symmetrie oplegt. Voorbeelden van resultaten zijn een 10,15 Å EM-kaart, volgens de gouden standaard FSC-criteria. De totale gebruikte deeltjes waren 2050, wat overeenkomt met 123.000 protomeereenheden als gevolg van de icosaëstrale symmetrie-operator (figuur 5).
    5. Maskeer de eindkaarten op ~750 Å en visualiseer de resultaten in het softwarepakket voor moleculaire structuuranalyse. Voorbeeldsegmenten door de EM-kaart worden weergegeven in figuur 5 in stappen van ~ 10 nm.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een vloeistof-TEM die op 200 kV werkte, werd gebruikt voor alle vloeistof-EM-beeldvormingsexperimenten en een cryo-TEM die op 300 kV werkte, werd gebruikt voor alle cryo-EM-gegevensverzameling. Representatieve afbeeldingen en structuren van meerdere virussen worden gepresenteerd om het nut van de methoden bij verschillende proefpersonen aan te tonen. Deze omvatten recombinante adeno-geassocieerde virussubtype 3 (AAV), SARS-CoV-2 subvirale assemblages afgeleid van het serum van de patiënt en simian rotavirus dubbellaagse ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er worden nieuwe mogelijkheden geboden om de huidige liquid-EM-workflows te stroomlijnen door gebruik te maken van nieuwe geautomatiseerde tools en technologieën die zijn aangepast aan het cryo-EM-veld. Toepassingen met betrekking tot de nieuwe microchip sandwichtechniek zijn belangrijk met betrekking tot andere methoden omdat ze beeldvormingsanalyse met hoge resolutie in vloeibaar of glasachtig ijs mogelijk maken. Een van de meest kritieke stappen in het protocol is het produceren van monsters met de ideale vloeistofdik...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben. De auteur, Madeline J. Dressel-Dukes, is een werknemer van Protochips, Inc. en Michael Spilman is een werknemer van DirectElectron.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Department of Ophthalmology) voor het verstrekken van gezuiverde AAV-3. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health en het National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 tot D.F.K.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonFisher Scientific A11-11 Liter
Autoloader klemgereedschapThermoFisher ScientificN/AOok SubAngstrom leverancier
Autoloader rasterklemmenThermoFisher ScientificN/Aboven- en onderklemmen
Koolstof-gecoat gouden EM rastersElectron Microcopy SciencesCF400-AU-50400-mesh, 5-nm dikte
COVID-19 patiëntenserumRayBiotechCoV-Pos-S-500500 microliter PCR+ serum
MethanolFisher Scientific A412-11 Liter
Microwell-geïntegreerde microchipsProtochips, Inc.EPB-42A1-1010x10-mm raamarrays
TEMWindows microchipsSimpore Inc.SN100-A10Q33B9 grote ramen, 10-nn dik
TEMWindows microchipsSimpore, Inc. SN100-A05Q33A9 kleine ramen, 5-nm dik
Top microchipsProtochips, Inc.EPT-50W500 mm x 100 mm raam
Whatman #1 filterpapierWhatman1001 090100 stuks, 90 mm
Apparatuur 
DirectView directe elektronendetectorDirect Electron6-micron pixelafstand
Falcon 3 EC directe elektronendetectorThermoFisher Scientific14-micron pixelafstand
Gatan 655 Dry pompstationGatan, Inc. Pomphouder tip tot 10-6 bereik
Mark IV VitrobotThermoFisher Scientificstate-of-the-art specimenvoorbereidingseenheid 
PELCO easiGlow, gloeiontladningsunitTed Pella, Inc. Negatieve polariteitsmodus
Poseidon Select specimenhouderProtochips, Inc. FEI compatibel;specimenhouder
Talos F200C TEMThermoFisher Scientific200 kV; Liquid-TEM
Titan Krios G3ThermoFisher Scientific300 kV; Cryo-TEM
Vrij beschikbare softwareWebsite linkOpmerkingen (optioneel)
cryoSPARChttps://cryosparc.com/andere beeldverwerkingssoftware
CTFFIND4https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4CTF zoekprogramma
MotionCorr2https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
RELIONhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEMhttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimerahttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/moleculaire structuuranalyse softwarepakket

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Oikonomou, C. M., Chang, Y. -W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).
  3. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  4. DiMaio, F., et al. Atomic accuracy models from 4.5 Å cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement. Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).
  5. Frank, J., et al. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).
  6. Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936(2013).
  7. Dearnaley, W. J., et al. Liquid-cell electron tomography of biological systems. Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).
  8. Park, J., et al. Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).
  9. Chen, Q., et al. 3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).
  10. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
  11. Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy. Communications Chemistry. 1, 80(2018).
  12. Jonaid, G., et al. High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets. Advanced Materials. 33 (37), 2103221(2021).
  13. Pohlmann, E. S., et al. Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells. Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).
  14. Jonaid, G. M., et al. Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid. Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).
  15. Varano, A. C., et al. Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).
  16. Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918(2019).
  17. Tanner, J. R., et al. Cryo-SiN – An alternative substrate to visualize active viral assemblies. Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).
  18. Solares, M. J., et al. Microchip-based structure determination of disease-relevant p53. Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).
  19. Casasanta, M. A., et al. Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy. Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).
  20. Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
  21. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  22. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  23. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  24. Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).
  25. Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion. Virology. 403 (1), 26-36 (2010).
  26. Sharma, G., et al. Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome. Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).
  27. Kiss, G., et al. Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications. Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).
  28. Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices—a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).
  29. Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184 (4132), 77-78 (1974).
  30. Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).
  31. Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object. Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).
  32. Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186 (4162), 407-414 (1974).
  33. Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet proteins: Catalase. Science. 177 (4045), 268-270 (1972).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Liquid Electron MicroscopyCryo Electron MicroscopyVirus AssembliesHigh Resolution ImagingMolecular DynamicsMicrochip Sandwich MethodSARS CoV 2 ImagingSample PreparationStructural AnalysisDynamic Processes