Method Article

Geavanceerde beeldvorming met hoge resolutie van virusassemblages in vloeistof en ijs

DOI:

10.3791/63856

⸱

July 20th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Materials Science and Engineering, McMaster University, 3Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 4Molecular, Cellular, and Integrative Biosciences Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 5Materials Research Institute, Pennsylvania State University, 6Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 7Applications team, Direct Electron, 8Application Scientist, Protochips, Inc., 9Department of Biology, Wake Forest University

In This Article

Retraction Notice

This article, Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice, has been retracted at the request of the Editors-in-Chief due to concerns about the integrity of the data presented. These concerns included: (a) Figure 3 was found to contain noise without structural features expected for a protein capsid; (b) critical half-map data necessary to verify resolution claims were not deposited; (c) there was a lack of system logs or controls to rule out stage drift regarding observed movements in Figure 3; and (d) the absence of protocols to address Brownian motion and beam-induced drift significantly weakened the reliability of the findings.<br/><br/>The corresponding author's indication she principally relied on RMEASURE program did not sufficiently address the publisher's concerns. After consulting external experts, the Editors-in-Chief concluded that the issues remain unresolved, and the data do not meet JoVE's standards for scientific reliability and reproducibility, requiring retraction. The corresponding author disagrees with the grounds for retraction. Co-authors DiCecco, Grandfield and Bator agree with the retraction. Other co-authors were unavailable for comment.

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier worden protocollen beschreven om virusassemblages voor te bereiden die geschikt zijn voor vloeistof-EM- en cryo-EM-analyse op nanoschaal met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De interesse in vloeistof-elektronenmicroscopie (liquid-EM) is de afgelopen jaren omhooggeschoten omdat wetenschappers nu real-time processen op nanoschaal kunnen observeren. Het is uiterst wenselijk om cryo-EM-informatie met hoge resolutie te koppelen aan dynamische waarnemingen, omdat veel gebeurtenissen zich op snelle tijdschalen voordoen - in het millisecondebereik of sneller. Verbeterde kennis van flexibele structuren kan ook helpen bij het ontwerpen van nieuwe reagentia om opkomende pathogenen, zoals SARS-CoV-2, te bestrijden. Wat nog belangrijker is, het bekijken van biologische materialen in een vloeibare omgeving biedt een unieke glimp van hun prestaties in het menselijk lichaam. Hier worden nieuw ontwikkelde methoden gepresenteerd om de nanoschaaleigenschappen van virusassemblages in vloeibaar en glasachtig ijs te onderzoeken. Om dit doel te bereiken, werden goed gedefinieerde monsters gebruikt als modelsystemen. Vergelijkingen van monstervoorbereidingsmethoden en representatieve structurele informatie worden naast elkaar gepresenteerd. Sub-nanometerkenmerken worden weergegeven voor structuren die zijn opgelost in het bereik van ~ 3,5-Å-10 Å. Andere recente resultaten die dit complementaire kader ondersteunen, omvatten dynamische inzichten van vaccinkandidaten en op antilichamen gebaseerde therapieën afgebeeld in vloeistof. Over het algemeen bevorderen deze correlatieve toepassingen ons vermogen om moleculaire dynamica te visualiseren en bieden ze een unieke context voor hun gebruik in de menselijke gezondheid en ziekte.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomedisch onderzoek verbetert ons begrip van de menselijke gezondheid en ziekte door de ontwikkeling van nieuwe technologieën. Beeldvorming met hoge resolutie transformeert ons beeld van de nanowereld - waardoor we cellen en moleculen in prachtig detailkunnen bestuderen 1,2,3,4,5. Statische informatie van dynamische componenten zoals zachte polymeren, eiwitassemblages of menselijke virussen onthult slechts een beperkte momentopname van hun complexe verhaal. Om beter te begrijpen hoe moleculaire entiteiten ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Laden van de monsterhouder voor liquid-EM

  1. Reinig de siliciumnitride (SiN) microchips door elke chip gedurende 2 minuten in 150 ml aceton te incuberen, gevolgd door incubatie in 150 ml methanol gedurende 2 minuten. Laat chips drogen in laminaire luchtstroom.
  2. Plasma reinigt de gedroogde chips met behulp van een gloeid-ontladingsinstrument dat werkt onder standaardomstandigheden van 30 W, 15 mA gedurende 45 s met behulp van Argon-gas.
  3. Laad een droge basismicrochip in de punt van de monsterhouder. Voeg ~0,2 μL monster (0,2-1 mg/ml virusassemblages in 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een vloeistof-TEM die op 200 kV werkte, werd gebruikt voor alle vloeistof-EM-beeldvormingsexperimenten en een cryo-TEM die op 300 kV werkte, werd gebruikt voor alle cryo-EM-gegevensverzameling. Representatieve afbeeldingen en structuren van meerdere virussen worden gepresenteerd om het nut van de methoden bij verschillende proefpersonen aan te tonen. Deze omvatten recombinante adeno-geassocieerde virussubtype 3 (AAV), SARS-CoV-2 subvirale assemblages afgeleid van het serum van de patiënt en simian rotavirus dubbellaagse .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er worden nieuwe mogelijkheden geboden om de huidige liquid-EM-workflows te stroomlijnen door gebruik te maken van nieuwe geautomatiseerde tools en technologieën die zijn aangepast aan het cryo-EM-veld. Toepassingen met betrekking tot de nieuwe microchip sandwichtechniek zijn belangrijk met betrekking tot andere methoden omdat ze beeldvormingsanalyse met hoge resolutie in vloeibaar of glasachtig ijs mogelijk maken. Een van de meest kritieke stappen in het protocol is het produceren van monsters met de ideale vloeistofdik.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben. De auteur, Madeline J. Dressel-Dukes, is een werknemer van Protochips, Inc. en Michael Spilman is een werknemer van DirectElectron.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Department of Ophthalmology) voor het verstrekken van gezuiverde AAV-3. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health en het National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 tot D.F.K.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcetoneFisher Scientific A11-11 Liter
Autoloader clipping toolThermoFisher ScientificN/AAlso SubAngstrom supplier
Autoloader grid clipsThermoFisher ScientificN/Atop and bottom clips
Carbon-coated gold EM gridsElectron Microcopy SciencesCF400-AU-50400-mesh, 5-nm thickness
COVID-19 patient serumRayBiotechCoV-Pos-S-500500 microliters of PCR+ serum
MethanolFisher Scientific A412-11 Liter
Microwell-integrad microchipsProtochips, Inc.EPB-42A1-1010x10-mm window arrays
TEMWindows microchipsSimpore Inc.SN100-A10Q33B9 large windows, 10-nn thick
TEMWindows microchipsSimpore, Inc. SN100-A05Q33A9 small windows, 5-nm thick
Top microchipsProtochips, Inc.EPT-50W500 mm x 100 mm window
Whatman #1 filter paperWhatman1001 090100 pieces, 90 mm
Equipment 
DirectView direct electron detectorDirect Electron6-micron pixel spacing
Falcon 3 EC direct electron detectorThermoFisher Scientific14-micron pixel spacing
Gatan 655 Dry pump stationGatan, Inc. Pump holder tip to 10-6 range
Mark IV VitrobotThermoFisher Scientificstate-of-the-art specimen preparation unit 
PELCO easiGlow, glow discharge unitTed Pella, Inc. Negative polarity mode
Poseidon Select specimen holderProtochips, Inc. FEI compatible;specimen holder
Talos F200C TEMThermoFisher Scientific200 kV; Liquid-TEM
Titan Krios G3ThermoFisher Scientific300 kV; Cryo-TEM
Freely available softwareWebsite linkComments (optional)
cryoSPARChttps://cryosparc.com/other image processing software
CTFFIND4https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4CTF finding program
MotionCorr2https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
RELIONhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEMhttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimerahttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/molecular structure analysis software package

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Oikonomou, C. M., Chang, Y. -W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biolo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Liquid Electron MicroscopyCryo Electron MicroscopyVirus AssembliesHigh Resolution ImagingMolecular DynamicsMicrochip Sandwich MethodSARS CoV 2 ImagingSample PreparationStructural AnalysisDynamic Processes