Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het meten van eencellig mitochondriaal DNA-kopienummer en heteroplasmie met behulp van digitale druppelpolymerasekettingreactie

5.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63870

⸱

12 juli 2022

 , 
1Department of Clinical Neurosciences, School of Clinical Medicine, University of Cambridge, Cambridge Biomedical Campus, 2Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit, University of Cambridge, Cambridge Biomedical Campus

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het meten van absolute mitochondriale (mt) DNA-kopienummer en mtDNA-deletie heteroplasmieniveaus in enkele cellen.

Samenvatting

Het mitochondriaal (mt)DNA van zoogdieren is een klein, circulair, dubbelstrengs, intra-mitochondriaal DNA-molecuul, dat codeert voor 13 subeenheden van de elektronentransportketen. In tegenstelling tot het diploïde nucleaire genoom, bevatten de meeste cellen veel meer kopieën van mtDNA, variërend van minder dan 100 tot meer dan 200.000 kopieën, afhankelijk van het celtype. MtDNA-kopienummer wordt steeds vaker gebruikt als biomarker voor een aantal leeftijdsgebonden degeneratieve aandoeningen en ziekten, en dus wordt nauwkeurige meting van het mtDNA-kopienummer een belangrijk hulpmiddel in zowel onderzoeks- als diagnostische instellingen. Mutaties in het mtDNA, vaak optredend als single nucleotide polymorfismen (SNP's) of deleties, kunnen ofwel voorkomen in alle kopieën van het mtDNA in de cel (homoplasmie genoemd) of als een mengsel van gemuteerde en WT mtDNA-kopieën (heteroplasmie genoemd). Heteroplasmatische mtDNA-mutaties zijn een belangrijke oorzaak van klinische mitochondriale pathologie, hetzij bij zeldzame ziekten of bij een groeiend aantal veel voorkomende ziekten met late aanvang, zoals de ziekte van Parkinson. Het bepalen van het niveau van heteroplasmie in cellen is een cruciale stap in de diagnose van zeldzame mitochondriale ziekten en in onderzoek gericht op het begrijpen van veel voorkomende late-onset aandoeningen waarbij mitochondriën een rol kunnen spelen. MtDNA-kopienummer en heteroplasmie worden traditioneel gemeten door kwantitatieve (q)PCR-gebaseerde assays of deep sequencing. De recente introductie van ddPCR-technologie heeft echter een alternatieve methode opgeleverd voor het meten van beide parameters. Het biedt verschillende voordelen ten opzichte van bestaande methoden, waaronder de mogelijkheid om het absolute mtDNA-kopieernummer te meten en voldoende gevoeligheid om nauwkeurige metingen uit afzonderlijke cellen uit te voeren, zelfs bij lage kopieeraantallen. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd dat de meting van het mtDNA-kopienummer in afzonderlijke cellen beschrijft met behulp van ddPCR, voortaan aangeduid als druppelgeneratie PCR, met de optie voor gelijktijdige meting van heteroplasmie in cellen met mtDNA-deleties. De mogelijkheid om deze methode uit te breiden om heteroplasmie te meten in cellen met mtDNA SNP's wordt ook besproken.

Inleiding

Zoogdier mitochondriaal (mt)DNA is een klein (ca. 16,5 Kb), circulair DNA-genoom dat zich bevindt in de mitochondriale matrix die codeert voor 37 genen, bestaande uit twee rRNA's, 22 tRNA's en 13 eiwitcoderende genen1. In tegenstelling tot het nucleaire genoom, dat één (haploïde) of twee (diploïde) kopieën van elk gen per cel bevat, is mtDNA aanwezig in meerdere kopieën in de mitochondriën van elke cel, variërend van tientallen kopieën (bijv. Volwassen spermatocyten) tot honderdduizenden kopieën (bijv. Eicellen)2,3. Een gevolg van deze multi-copy aard is dat mutaties in het mtDNA-genoom, dat kan bestaan als single-nucleotide polymorfismen (SNP's), deleties of duplicaties, op verschillende niveaus in een bepaalde cel aanwezig kunnen zijn, die ergens tussen 0% en 100% van de totale mtDNA-populatie van de cel uitmaken. Het bestaan van wild-type en mutante mtDNA-genomen in dezelfde cel wordt heteroplasmie genoemd en pathogene heteroplasmatische mtDNA-mutaties zijn een belangrijke oorzaak van mitochondriale ziekte, met verschillende veel voorkomende neurologische syndromen die verband houden met onderliggende heteroplasmatische mtDNA-mutaties4.

Twee belangrijke parameters die bijdragen aan de waarschijnlijkheid van een heteroplasmatische mtDNA-mutatie die klinische ziekte veroorzaakt, zijn heteroplasmieniveau en het mtDNA-kopienummer. Veel heteroplasmatische mutaties vertonen een drempeleffect, waarbij biochemische en klinische fenotypen pas zichtbaar worden boven een bepaald heteroplasmieniveau, meestal rond 80%5, en vervolgens verergeren naarmate de heteroplasmie verder toeneemt4. Het is echter ook belangrijk om rekening te houden met het aantal kopieën van mtDNA dat in de cel aanwezig is, omdat dit van invloed is op het aantal wild-type (d.w.z. 'gezonde') mtDNA-genomen die aanwezig zijn op een bepaald heteroplasmieniveau. Studies bij patiënten met mitochondriale ziekten hebben het belang van dit samenspel tussen heteroplasmie en kopienummer 5,6 benadrukt, en Filograna et al. meldden onlangs een toename van het mtDNA-kopienummer dat de symptomen verlichtte ondanks onveranderde heteroplasmie in een muismodel van mitochondriale ziekte7.

Hoewel er de afgelopen jaren veel is gedaan om het begrip van de pathogenese en overdracht van ziekten veroorzaakt door mtDNA-heteroplasmie te verbeteren, is het grootste deel van dit werk uitgevoerd op het niveau van weefsels in plaats van cellen, waarbij gemiddelde weefselheteroplasmieniveaus en kopienummermetingen worden vergeleken die zijn verkregen uit bulkweefselbiopten en bloedmonsters. Sommige gevestigde technieken, zoals laser capture microdissectie, maken dergelijke metingen op cellulair niveaumogelijk 8,9; de recente explosie van high-throughput single-cell analysemethoden, of zogenaamde "Single-cell Omics"10, heeft echter een behoefte gecreëerd aan methoden die deze cruciale mtDNA-parameters op het niveau van één cel nauwkeurig kunnen meten.

De PCR-methode voor druppelgeneratie maakt gebruik van recente ontwikkelingen in microfluïdische technologie om bestaande methoden voor het kwantificeren van onbekende DNA-concentraties te verbeteren via PCR-amplificatie van specifieke doelamputten in het MONSTER-DNA11. In tegenstelling tot qPCR, waarbij het monster-DNA in een enkele reactie wordt versterkt, waarbij de relatieve accumulatiesnelheid van PCR-product fungeert als de uitlezing, splitst deze methode het eerste monster in duizenden individuele druppeltjes, waardoor de MONSTER-DNA-moleculen worden gecompartimenteerd in ruimtelijk gescheiden reacties12. De daaropvolgende PCR-reactie verloopt in elke afzonderlijke druppel, waarbij het PCR-product zich alleen ophoopt in druppeltjes die het doel-DNA bevatten. Het resultaat van deze reactie is een digitale output in de vorm van een pool van druppeltjes die ofwel een kopie van het doel-DNA en het versterkte PCR-product bevatten, ofwel geen doel-DNA bevatten. Met behulp van fluorescerende DNA-sondes of een dubbelstrengs (ds)DNA-bindende kleurstof kunnen de druppels met versterkt product worden geteld en kan de verhouding tussen 'positieve' en 'negatieve' druppels worden gebruikt om het absolute aantal DNA-kopieën te berekenen dat aanwezig was in het eerste monster. Deze absolute meting, in tegenstelling tot de relatieve meting verkregen door een qPCR-reactie, is de belangrijkste factor die het mogelijk maakt deze methodologie te gebruiken voor nauwkeurige meting van mtDNA-kopienummer en heteroplasmie in enkele cellen11, en verschillende recente studies hebben al gebruik gemaakt van druppelgeneratie PCR-technologie voor dit doel13,14 . Dit artikel presenteert een methode voor het meten van mtDNA-kopienummer en deletie-heteroplasmie in afzonderlijke cellen van zowel menselijk als muisweefsel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten volgden de ARRIVE-richtlijnen en werden goedgekeurd door de University of Cambridge Animal Welfare Ethical Review Body (AWERB).

OPMERKING: Alle monstervoorbereidingsstappen voorafgaand aan het genereren van druppels moeten worden uitgevoerd in een schoon pre-PCR-werkgebied, idealiter waar mogelijk in een UV-gesteriliseerde kast. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van specifieke PCR-apparatuur voor druppelgeneratie (zie materiaaltabel), en hoewel de algemene methode van toepassing zou moeten zijn op andere systemen, wordt aanbevolen om de richtlijnen van de fabrikant te raadplegen met betrekking tot primer/ probe-concentraties, PCR-cyclusomstandigheden, enz., Omdat deze kunnen verschillen van de hier beschreven. Cellijnen/primaire cellen die in deze studie werden gebruikt, waren als volgt: Menselijke HeLa-cellen (commercieel verkregen), menselijke HEK 293T-cellen (commercieel verkregen), primaire menselijke dermale fibroblastcellen (verkregen uit de Newcastle Biobank), menselijke cybriden (WT &ΔH2.1-deletie15, verkregen van C. Moraes, University of Miami), muisembryonale fibroblasten (vereeuwigd, van C57Bl/6-muizen, verkregen van J. Stewart, Newcastle University), primordiale geslachtscellen van muizen (verkregen uit C57Bl/6 muizenembryo's) en mii-eicellen van muizen (verkregen van volwassen vrouwelijke C57Bl/6-muizen). Alle gekweekte cellen werden gehandhaafd in dmem met hoge glucose (4,5 g/l), aangevuld met 10% foetaal runderserum bij 37 °C met 5% CO2. Primaire muiscellen die in deze studie werden gebruikt, werden geïsoleerd uit dieren die werden gehouden volgens de Animal (Scientific Procedures) Act 1986 onder Home Office Project License P6C97520A.

1. Ontwerp en synthetiseer primer &probe sets gericht op DNA-sequenties van belang

OPMERKING: Druppelgeneratie PCR kan ook worden uitgevoerd met behulp van een dsDNA-bindende kleurstof in plaats van de amplicon-specifieke sondes.

  1. Ontwerp de primer- en sondesequenties volgens de richtlijnen van de systeemfabrikant. Gevalideerde primer- en probesequenties die geschikt zijn voor het meten van eencellig mtDNA-kopienummer/deletie-heteroplasmie in zowelhumane 16,17- als muis18-cellen zijn opgenomen in tabel 1. Houd bij het selecteren van alternatieve doelreeksen rekening met de volgende punten.
    1. Multiplex twee primer / probe sets in een enkele PCR-assay, maar zorg ervoor dat de twee assays gebruik maken van een FAM-gelabelde sonde en een HEX-gelabelde probe, zodat de doelamplicons kunnen worden onderscheiden door de druppellezer. Dit protocol presenteert een duplex probe assay. Met een zorgvuldig experimenteel ontwerp kan multiplexing worden verhoogd tot vier doelen en kunnen alternatieve platforms hogerdimensionale multiplexing bereiken.
    2. Wanneer u primers-/probesets multiplext die zich richten op afzonderlijke mtDNA-sequenties, moet u ervoor zorgen dat de ampliconen die door de twee primersets worden gegenereerd, elkaar niet overlappen.
    3. Zorg er bij het meten van heteroplasmie in monsters met mtDNA-deleties voor dat één doelamplicon binnen het verwachte verwijderde gebied valt en het andere buiten het verwachte verwijderde gebied.
      OPMERKING: Optimale PCR-cyclusomstandigheden voor alternatieve testen kunnen verschillen van die in stap 5.1; zie de discussie voor meer informatie over testoptimalisatie.

2. Isolatie van DNA uit afzonderlijke cellen

OPMERKING: Deze methode kan ook worden gebruikt voor kleine bulkmonsters van maximaal 100 cellen.

  1. Verzamel afzonderlijke cellen met behulp van een geschikte methode, zoals Fluorescentie-Geactiveerde Celsortering (FACS)19 of laservangst microdissectie20, in een zo klein mogelijk volume in een geschikte recipiënt (bijv. 96-well plaat). Het gebruik van een kleurstof voor de levensvatbaarheid van cellen voorafgaand aan of tijdens eencellige isolatie minimaliseert de kans op het isoleren van dode cellen. Sorteer de afzonderlijke cellen indien gewenst direct in de lysisbuffer en bewaar ze bij -80 °C (tot 6 maanden) voorafgaand aan de analyse.
  2. Lyse de cellen in een klein volume (<10 μL) van een geschikte lysisbuffer (de buffer die in dit onderzoek wordt gebruikt, wordt beschreven in stap 2.2.1.).
    OPMERKING: Alle gegevens verkregen uit cellen in deze studie zijn afkomstig van eencellige lysaten of pools van 20 cellen (steekproefgroottes zijn vastgelegd in de figuurlegendes). Efficiënte vorming van een olie/druppelemulsie tijdens de druppelgeneratiestap van het PCR-protocol voor druppelgeneratie kan aanzienlijk worden beïnvloed door de aanwezigheid van detergentia in het monster; daarom wordt aanbevolen de compatibiliteit van alle cellysebuffers met druppelgeneratie bij de beoogde inputconcentratie te valideren alvorens verder te gaan met experimentele monsters en het kleinste praktische volume lysisbuffer te gebruiken. Het volgende lysisprotocol resulteert in een minimale impact op de efficiëntie van druppelgeneratie.
    1. Bereid de lysisbuffer met 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 1% TWEEN-20 en 200 μg/ml proteïnase K.
    2. Voeg 2,5 μL van de lysisbuffer toe aan elk monster, sluit de plaat af met een zelfklevende plaatafdichting en centrifugeer de monsters vervolgens bij 1.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C.
    3. Incubeer de monsters bij 37 °C gedurende 30 minuten op de thermocycler met het verwarmde deksel ingesteld op 105 °C om condensatie van vloeistof op het plaatdeksel te voorkomen.
    4. Voeg 7,5 μL nucleasevrij water toe aan elk monster om een eindmonstervolume van 10 μL te krijgen, verzegel de plaat opnieuw en centrifugeer de monsters vervolgens bij 1.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C.
    5. Incubeer op de thermocycler bij 80 °C gedurende 15 minuten (verwarmd deksel ingesteld op 105 °C) om proteïnase K te inactiveren.
    6. Centrifugeer de monsters bij 1.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C en houd ze vervolgens op ijs.
  3. Ga verder met stap 3 hieronder.
    OPMERKING: Cellysaten kunnen worden bewaard bij -20 °C voordat u doorgaat met stap 3; gebruik echter waar mogelijk vers geëlueerd DNA om het risico van vries-dooicycli die resulteren in DNA-afbraak te elimineren.

3. Bereiding van monsters

OPMERKING: Zorg ervoor dat technische replica's van monsters en niet-sjablooncontroles (NTC's) op elke testplaat zijn opgenomen om de nauwkeurigheid van de resultaten te garanderen. Het dynamisch bereik van de PCR-test van de druppelgeneratie is maximaal 120.000 kopieën van het doelamlicon per reactie. Voor eencellige of kleine bulkcelmonsterlysaten is verdunning waarschijnlijk niet nodig en kan het lysaatmengsel rechtstreeks in de reactie worden ingevoerd voor de meting van het mtDNA-kopienummer (een lysaatmonster van 10 μL kan bijvoorbeeld worden gesplitst en in drievoud worden uitgevoerd met 3 μL-invoer rechtstreeks in elke test). Het gebruik van onverdund lysaat van cellen met zeer hoge kopie mtDNA-getallen (bijv. Eicellen) of met grotere aantallen cellen (bijv. 50-100) kan dit dynamische bereik echter overschrijden. In dergelijke gevallen is een initiële seriële verdunning vereist om een geschikte verdunningsfactor te identificeren die verzadiging van de test voor dat specifieke celtype/celnummer voorkomt (zie Representatieve resultaten voor meer informatie).

  1. Ontdooi alle reagentia op ijs, vortex en spin kort voor gebruik.
  2. Bereid de mastermix (minus monster-DNA) op ijs zoals beschreven in (tabel 2).
    OPMERKING: Als slechts één doelamplicon wordt gemeten, voeg dan nog eens 2,55 μL nucleasevrij water per monster toe om het uiteindelijke volume van 22 μL te bereiken. Bereid voldoende hoofdmix voor voor het aantal monsters en NTC's dat moet worden geanalyseerd, plus voldoende om rekening te houden met eventuele 'lege' putten die nodig zijn op de PCR-plaat voor druppelgeneratie (zie volgende stap).
  3. Vortex de bereide mastermix kort om het vereiste volume (22 μL minus input DNA-volume) in elke put van een druppelgeneratie PCR 96-well plaat te mengen en te aliquoteren. Rangschik de monsters in volledige kolommen op de 96-well plaat; vul lege putten in onvolledige kolommen met mastermix en gebruik ze als NTC's.
  4. Voeg het input-DNA toe aan elke monsterput en nucleasevrije water/elutiebuffer aan NTC-putten om het totale volume van elk op 22 μL te brengen.
  5. Sluit de plaat af met een zelfklevende plaatafdichting en plaats deze gedurende 1 minuut op een schudder bij 2.000 tpm en centrifugeer vervolgens gedurende één minuut bij 4 °C bij 1.000 x g .
  6. Leg de plaat op ijs en ga verder met stap 4.
    OPMERKING: Voorbereide platen kunnen op ijs worden bewaard en gedurende korte tijd (bijv. 1-2 uur) tegen licht worden beschermd voordat ze doorgaan met het genereren van druppels.

4. Generatie van druppels

OPMERKING: Raadpleeg figuur 1A voor het schema van het instrumentdek van de druppelgenerator waarnaar in deze sectie wordt verwezen.

  1. Schakel de druppelgenerator in.
  2. Controleer of een fles druppel die olie genereert, is geladen om E van het instrumentendek te plaatsen. Volg desgevraagd de instructies op het scherm om de fles te vervangen.
  3. Klik op Voorbeeldplaat configureren op het aanraakscherm. Selecteer alle kolommen op de monsterplaat die monsters/lege velden bevatten.
    OPMERKING: Het invoeren van de naam van het bord en de details van het experiment in deze stap is optioneel en niet vereist om door te gaan met het instellen van het experiment.
  4. Klik op OK om de plaatconfiguratie te bevestigen. oranje lampjes gaan branden op het instrumentendek om posities aan te geven waar verbruiksartikelen moeten worden geladen.
  5. Laad de druppelgeneratorpatronen op positie B op het instrumentendek, zodat alle lichten groen worden.
  6. Plaats een lege afvalbak in positie C op het instrumentendek.
  7. Verwijder deksels uit filtertipboxen en laad op positie D op het instrumentenpaneel, zodat alle lichten groen worden.
  8. Verwijder de zelfklevende plaatafdichting van de monsterplaat en laad op positie F van het instrumentendek zodat het licht groen wordt.
  9. Plaats een lege druppelopvangplaat met 96 putten in een koel blok (voorgekoeld bij -20 °C) en laad op positie G van het instrumentendek zodat het licht groen wordt.
  10. Klik op Droplet Generation starten op het aanraakscherm van het instrument.
  11. Klik op Start Run op het aanraakscherm van het instrument. Het instrumentdeksel sluit automatisch. Na het initialiseren wordt de resterende tijd totdat het genereren van druppels is voltooid, weergegeven op het aanraakscherm van het instrument.
  12. Zodra de druppelgeneratie is voltooid, controleert u de monsterverzamelingsplaat visueel om te bevestigen dat er boven de oliefase in elke put een druppelemulsielaag aanwezig is (figuur 1B).
    OPMERKING: Als een druppelemulsielaag niet zichtbaar is, ga dan niet verder met het experiment en controleer op eventuele fouten die zich tijdens eerdere stappen van het protocol hebben voorgedaan.
  13. Verwijder de gebruikte verbruiksartikelen van het instrumentendek en leeg de stortbak.
  14. Schakel de platensealer in, stel de temperatuur in op 180 °C en de afdichtingstijd op 5 s en laat de machine de bedrijfstemperatuur bereiken.
  15. Plaats de monsterverzamelplaat in de plaatsealerplaathouder en plaats een verse folieafdichting bovenop de plaat met de rode lijn naar boven gericht. Zorg ervoor dat u de onderkant van de folieafdichting niet aanraakt.
    OPMERKING: De plaathouder moet bij kamertemperatuur (RT) worden bewaard en alleen in de lade van de platensealer worden geplaatst wanneer een folieafdichting wordt aangebracht om warmteoverdracht naar de monsterverzamelingsplaat te voorkomen.
  16. Wanneer de platensealer bedrijfstemperatuur heeft bereikt, drukt u op Eject op het touchscreen van het instrument; de lade wordt automatisch geopend.
  17. Plaats de plaathouder in de lade van de platensealer en druk op Seal. De lade sluit automatisch en opent vervolgens weer zodra de afdichting is voltooid.
  18. Vervang de verzegelde plaat op het koude blok, schakel de platensealer uit en ga onmiddellijk verder met stap 5.
    OPMERKING: In dit stadium zijn de druppels onstabiel, dus zorg ervoor dat de PCR-stap binnen 1 uur na het beëindigen van de druppelgeneratie wordt gestart.

5. PCR

  1. Plaats de verzegelde druppelopvangplaat op een PCR-cycler uitgerust met een blok van 96 diepe putten en voer het in tabel 3 beschreven thermische cyclusprotocol uit.
    OPMERKING: Stel de temperatuur van het verwarmde deksel in op 105 °C en het monstervolume op 40 μL. Denaturatie- en gloei-/verlengstappen moeten een temperatuurverhoging van 2 °C/s omvatten om ervoor te zorgen dat de olie de tijd heeft om op de juiste temperatuur te balanceren.
  2. Ga verder met stap 6.
    OPMERKING: Zodra het thermische cyclusprotocol is voltooid, zijn de druppels stabieler en kan de plaat tot 4 dagen bij 4 °C worden bewaard voordat u doorgaat met de volgende stap.

6. Druppel lezen

  1. Schakel de druppellezer en aangesloten computer in.
  2. Controleer de vloeistofniveaus in de druppellezerolie en druppellezerafvalflessen en vul / leeg deze, indien nodig.
  3. Plaats de plaat met de post-PCR-monsters in de druppellezerplaathouder, plaats de klep bovenop de houder en bevestig deze op zijn plaats met de zwarte vergrendelingsclips. Verwijder het foliedeksel niet van de monsterplaat.
  4. Druk op de knop Openen/Sluiten op het deksel van de druppellezer om deze te openen.
  5. Laad de druppellezerplaathouder met de monsterplaat in de leeskamer en plaats deze stevig op de magnetische basis.
  6. Druk op de knop Openen/Sluiten op het deksel van de druppellezer om deze te sluiten.
  7. Open de interface van de analysesoftware, selecteer het tabblad Plaat toevoegen en bereid als volgt een nieuwe monsterplaat voor:
    1. Klik op Plaat toevoegen en vervolgens op Plaat configureren.
    2. Voer op het tabblad Plaatinformatie een plaatnaam in, selecteer Supermix voor probes (geen dUTP) in het vervolgkeuzemenu Supermix en voer een bestandsnaam in onder Gegevensbestand opslaan als.
    3. Markeer op het tabblad Bronselectie de putten die moeten worden geanalyseerd en klik op Geselecteerde putten opnemen.
      OPMERKING: Stappen 6.7.4 – 6.7.7 zijn optioneel.
    4. Selecteer op het tabblad Broninformatie de putjes die moeten worden geannoteerd.
      OPMERKING: Raadpleeg Figuur 1D voor een voorbeeld van de interface van het tabblad Broninformatie .
    5. Selecteer Directe kwantificering (DQ) in het vervolgkeuzemenu Experimenttype , vul de vakken Voorbeeldbeschrijving, Voorbeeldtype en Doelnaam in en voeg indien nodig Bronnotities en/of Plaatnotities toe.
    6. Klik op Toepassen. De informatie in de velden wordt toegepast op de geselecteerde putten.
    7. Herhaal stap 6.7.4 tot en met 6.7.6 totdat alle monsterputten zijn geannoteerd.
  8. Zodra de plaatconfiguratie is voltooid, klikt u op Start Uitvoeren.
  9. Wanneer de run is voltooid, gooit u de lege monsterplaat weg en leegt u indien nodig de afvalfles van de druppellezer.
  10. Ga verder met stap 7.

7. Analyse van de resultaten

OPMERKING: De druppellezer meet de fluorescentie-intensiteit in het FAM- en HEX-kanaal voor elke druppel in een monster. In een succesvolle test vallen druppels in een van de twee categorieën voor elke sonde: negatief (wat betekent dat het doelwit niet aanwezig was in de druppel) of positief (wat betekent dat het doelwit aanwezig was in de druppel). Voordat u monsters analyseert, moet u ervoor zorgen dat elke put > 10.000 druppels bevat en twee duidelijk afzonderlijke populaties van lage fluorescentie (negatief) en hoge fluorescentie (positief) druppels in elk kanaal heeft (figuur 2A).

  1. Selecteer het tabblad Gegevensanalyse en open het bestand dat moet worden geanalyseerd in het menu Mijn gegevensbestanden .
  2. Klik op het tabblad 1D-amplitude voor experimenten met één kleur of op het tabblad 2D-amplitude voor experimenten met twee kleuren.
  3. Pas een fluorescentiedrempel toe op elk kanaal om de positieve en negatieve druppels te onderscheiden. De analysesoftware probeert een automatische drempel toe te passen op sample-by-sample en kanaal-by-channel basis, maar als dit lijkt te zijn mislukt of er onnauwkeurig uitziet, pas dan handmatig de drempel als volgt toe:
    1. Selecteer de putten die drempels vereisen.
    2. Pas de drempel handmatig toe in de vrije ruimte tussen de positieve en negatieve populaties op de amplitudeplot met behulp van het gereedschap Drempellijnmodus . Wanneer u handmatige drempels instelt in de 2D-weergave, moet u ervoor zorgen dat het vizier zo wordt geplaatst dat de vier druppelpopulaties (dubbel negatief, enkel positief FAM, enkel positief HEX en dubbel positief) duidelijk gescheiden zijn.
      OPMERKING: Drempels kunnen goed per put worden gedaan of op meerdere putten tegelijk worden toegepast.
  4. Zodra op alle voorbeelden een drempelwaarde is toegepast, exporteert u de resultaten als een .csv bestand voor verdere analyse door op het tabblad Gegevenstabel te klikken, op Importeren/exporteren te klikken en Zichtbare gegevens exporteren naar CSV te selecteren. Voer een geschikte bestandsnaam in en klik op Opslaan.
  5. Bereken het mtDNA-kopienummer in het eerste monster als volgt:
    Kopienummer = mtDNA-doelconcentratie × 22 × 1/fractie van de totale lysaatinvoer
    OPMERKING: Als twee mitochondriale sondes worden gebruikt, wordt de concentratie van de twee doelen gemiddeld voordat de berekening wordt gemaakt. Voor monsters die meer dan één cel bevatten, wordt het kopienummer per cel berekend door te delen door het aantal cellen in het monster. Het is belangrijk om de waarde "Concentratie" (d.w.z. het aantal kopieën per microliter) vermenigvuldigd met het oorspronkelijke monstervolume van 22 μL te gebruiken, in plaats van de waarde "Kopieën per 20 μL" berekend in het .csv bestand, aangezien de mtDNA-kopieën die zijn achtergelaten in de overschrijding van 2 μL die de druppelgenerator nodig heeft, in aanmerking moeten worden genomen bij de berekening van het absolute aantal kopieën van het oorspronkelijke monster.
  6. Voor cellen met heteroplasmatische mtDNA-deleties berekent u het kopienummer met behulp van de resultaten van het mtDNA-doel buiten het verwijderde gebied (d.w.z. het doelwit dat aanwezig is in zowel verwijderde als WT mtDNA-moleculen). De deletie heteroplasmie wordt als volgt berekend aan de hand van de concentraties van het doelwit binnen het verwijderde gebied en het doel buiten het verwijderde gebied:
    figure-protocol-1

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na het genereren van druppels is een duidelijke laag ondoorzichtige druppels zichtbaar die bovenop de oliefase in elke put drijven (figuur 1B). Druppelvorming kan nadelig worden beïnvloed door de aanwezigheid van detergentia in het inputlysaat bij het uitvoeren van experimenten op afzonderlijke cellen. Met behulp van het in 2.1.2 beschreven lysisprotocol worden routinematig druppelopbrengsten boven het aanbevolen niveau van 10.000 bereikt, ondanks de aanwezigheid van een kleine resterende ho...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hier beschreven protocol is van toepassing op een breed scala aan celtypen en soorten naast de hierboven besproken, hoewel zorgvuldige optimalisatie van nieuwe testontwerpen de sleutel zal zijn om ervoor te zorgen dat de nauwkeurigheid en herhaalbaarheid van de methode behouden blijven wanneer u weggaat van eerder gevalideerde primer / probe-combinaties. Bij het werken met afzonderlijke cellen is het van vitaal belang om ervoor te zorgen dat de monsterverzameling zo nauwkeurig mogelijk wordt uitgevoerd (bijvoorbeeld ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

Dank aan Dr. L Bozhilova voor advies over de statistische analyse van PCR-gegevens voor druppelgeneratie. Dank aan Dr. H Zhang voor het verstrekken van de eicellen die worden gebruikt om gegevens te genereren in figuur 3C en figuur 4B. Dit werk werd uitgevoerd door SPB van de Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit (MC_UU_00015/9), Universiteit van Cambridge, en gefinancierd door een Wellcome Trust Principal Research Fellowship gehouden door PFC (212219 / Z / 18 / Z).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
50% Tween-20 solutionNovex3005
Automated droplet-generating oil Bio Rad1864110Commerciële olieformulering die wordt gebruikt om de olie/druppel-emulsie te genereren (gebruikt in Protocol Stap 4.1)
C1000 PCR-machine met deep-well blockBio Rad1851197PCR thermocycler uitgerust met een deep-well verwarmingsblok, gebruikt voor cellysis (Protocol Stap 2.1.2) en PCR-cyclus (Protocol Stap 5)
Koelblok voor collectieplaatBio Rad12002819Koelblok dat monsters gekoeld houdt tijdens druppelgeneratie (gebruikt in Protocol stap 4.3)
ddPCR 96-well platen Bio Rad1200192596-well platen pipet tips ontworpen voor gebruik in de QX200 AutoDG druppelgenerator, gebruikt voor monstervoorbereiding (Protocol stap 3.4) en druppelverzameling (Protocol stap 4.3)
ddPCR druppellezer olie Bio Rad1863004Commerciële olieformulering gebruikt door de druppellezer (gebruikt in Protocol stap 6.1)
ddPCR Supermix voor Probes (geen dUTP)Bio Rad1863023Commerciële supermix voor gebruik in ddPCR experimenten met behulp van probes (gebruikt in Protocol Stap 3.3)
DG32 geautomatiseerde druppelgenerator cartridges Bio Rad1864108Microfluidische cartridges gebruikt in de QX200 AutoDG druppelgenerator om de olie/druppel-emulsie te genereren (gebruikt in Protocol Stap 4.3)
Fetaal bovien serumGibco10270-106Gekwalificeerd fetaal bovien serum
Folie platen deksels Bio Rad1814040Folie platen deksels gebruikt om druppelcollectie platen te verzegelen na druppelgeneratie (gebruikt in Protocol stap 4.6)
HEK 293T cellenTakara632180Commerciële subclone van de getransformeerde menselijke embryonale niercel lijn, HEK 293, die het SV40 Large-T antigeen tot expressie brengt
HeLa cellenECACC93021013Menselijke cervix epitheelcarcinoom cellen
High glucose DMEMGibco133453644,5 g/L D-Glucose, met L-glutamine en natriumpyruvaat
Menselijke cybridenUniversity of Miami
Muis embryonale fibroblasten Newcastle UniversityGedeeltelijk geïmmortaliseerd van C57Bl/6 muizen
Nuclease-vrij waterAmbionAM9937
PCR plaat verzegeldPierceSP-0027Doorzichtige kleefplaten, alleen gebruikt vóór druppelgeneratie (folieverzegeling moet worden gebruikt in stap 4.6)
Pipet Tip AfvalbakkenBio Rad1864125Weggeef collectiebak gebruikt om weg te gooien tips in de QX200 AutoDG druppelgenerator (gebruikt in Protocol stap 4.3)
Pipet tips voor AutoDG systeem Bio Rad1864120Gefilterde pipet tips ontworpen voor gebruik in de QX200 AutoDG druppelgenerator (gebruikt in Protocol stap 4.3)
Primaire menselijke dermale fibroblastcellenNewcastle Biobank
Primers/ProbesIDTN/AExacte primer/probe sequenties zijn afhankelijk van het assay. Primers en probes gebruikt in deze studie worden gegeven in Tabel 1
Proteinase K 20 mg/mL oplossingAmbionAM2546
PX1 PCR plaat verzegelaarBio Rad1814000Brengt folieverzegelingen aan op ddPCR monsters platen na druppelgeneratie (gebruikt in Protocol Stap 4.6)
QX Manager softwareBio Rad12012172Druppellezer installatie & analyse software (gebruikt in Protocol Stappen 6 & 7)
QX200 AutoDG druppelgeneratorBio Rad1864101Geautomatiseerde microfluïdische druppelgenerator (gebruikt in Protocol Stap 4)
QX200 druppel lezerBio Rad1864003Druppellezer (gebruikt in Protocol Stap 6)
Trizma voorgeprogrammeerde kristallen pH 8.3SigmaT8943-100G

Referenties

  1. Taanman, J. W. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
  2. Wai, T., et al. The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility. Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).
  3. D'Erchia, A. M., et al. Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity. Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).
  4. Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
  5. Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. F. Normal levels of wild-type mitochondrial DNA maintain cytochrome c oxidase activity for two pathogenic mitochondrial DNA mutations but not for m.3243A-->G. American Journal of Human Genetics. 81 (1), 189-195 (2007).
  6. Liu, H., et al. Wild-type mitochondrial DNA copy number in urinary cells as a useful marker for diagnosing severity of the mitochondrial diseases. PloS One. 8 (6), 67146(2013).
  7. Filograna, R., et al. Modulation of mtDNA copy number ameliorates the pathological consequences of a heteroplasmic mtDNA mutation in the mouse. Science Advances. 5 (4), (2019).
  8. Wang, Y., et al. The increase of mitochondrial DNA content in endometrial adenocarcinoma cells: a quantitative study using laser-captured microdissected tissues. Gynecologic Oncology. 98 (1), 104-110 (2005).
  9. Boulet, L., Karpati, G., Shoubridge, E. A. Distribution and threshold expression of the tRNA(Lys) mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF). American Journal of Human Genetics. 51 (6), 1187-1200 (1992).
  10. Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods. Experimental and Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).
  11. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409(2017).
  12. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
  13. Herbst, A., et al. Digital PCR quantitation of muscle mitochondrial DNA: age, fiber type, and mutation-induced changes. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).
  14. O'Hara, R., et al. Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution. Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).
  15. Diaz, F., et al. Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).
  16. Krishnan, K. J., Bender, A., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A multiplex real-time PCR method to detect and quantify mitochondrial DNA deletions in individual cells. Analytical Biochemistry. 370 (1), 127-129 (2007).
  17. Lowes, H., Pyle, A., Duddy, M., Hudson, G. Cell-free mitochondrial DNA in progressive multiple sclerosis. Mitochondrion. 46, 307-312 (2019).
  18. Perier, C., et al. Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms. Brain. 136, Pt 8 2369-2378 (2013).
  19. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457(2019).
  20. Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).
  21. Cree, L. M., et al. A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes. Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).
  22. Belmonte, F. R., et al. Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions. Scientific Reports. 6, 25186(2016).
  23. Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. F. Two direct repeats cause most human mtDNA deletions. Trends in Genetics. 20 (9), 393-398 (2004).
  24. Nissanka, N., Minczuk, M., Moraes, C. T. Mechanisms of mitochondrial DNA deletion formation. Trends in Genetics. 35 (3), 235-244 (2019).
  25. Macaulay, I. C., et al. Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&T-seq. Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).
  26. Ludwig, L. S., et al. Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics. Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).
  27. Rooney, J. P., et al. PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species. Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).
  28. Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression. Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).
  29. Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 10821(2020).
  30. Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: A Technology Review. Sensors (Basel). 18 (4), (2018).
  31. Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane. ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).
  32. Li, Z., et al. Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care. Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Analyse van enkelcellendigitale druppel PCRmitochondri le heteroplasmiedruppelgeneratieafdichten van PCR plaatdrempelwaardeanalysecellysedeletieheteroplasmie
Het meten van eencellig mitochondriaal DNA-kopienummer en heteroplasmie met behulp van digitale druppelpolymerasekettingreactie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.