Methodenartikel

Chemische trifosforylering van oligonucleotiden

5.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63877

⸱

2 juni 2022

 , 
1The Salk Institute

In dit artikel

Samenvatting

Oligonucleotide 5′-trifosfaten zijn alomtegenwoordige componenten in essentiële biologische routes en worden steeds vaker gebruikt in biotechnologische toepassingen. Hier beschrijven we technieken voor de routinematige synthese en zuivering van oligonucleotide-5′-trifosfaten, uitgaande van oligonucleotiden bereid door standaard geautomatiseerde synthesetechnieken.

Samenvatting

Het 5′-trifosfaat is een essentiële nucleïnezuurmodificatie die gedurende het hele leven wordt aangetroffen en in toenemende mate wordt gebruikt als een functionele modificatie van oligonucleotiden in de biotechnologie en synthetische biologie. Oligonucleotide-5′-trifosfaten zijn van oudsher in vitro bereid met enzymatische methoden. Deze methoden zijn echter beperkt tot natuurlijke RNA-oligonucleotiden, hebben sterke sequentievoorkeuren en hebben de neiging heterogene producten te produceren. Nieuwe methoden voor chemische trifosforylering vormen een aanvulling op zowel de lagere kosten van geautomatiseerde oligonucleotidesynthese door fosforamidietchemie als het gevarieerde scala aan nucleotidemodificaties dat nu beschikbaar is. Zo is de synthese van oligonucleotidetrifosfaten van willekeurige volgorde en lengte, en optioneel met verschillende niet-natuurlijke modificaties, nu toegankelijk.

Dit artikel presenteert de geschikte methoden en technieken voor chemische trifosforylering van oligonucleotiden met behulp van salicylfosforchloorthiat en pyrofosfaat. Deze methode maakt gebruik van in de handel verkrijgbare reagentia, is compatibel met de meeste oligonucleotiden bereid met standaard vaste-fasesynthesemethoden en kan binnen 2 uur na oligonucleotidesynthese worden voltooid, vóór deprotectie en zuivering. Twee toepassingen van chemisch trifosforyleerde oligonucleotiden als substraten voor katalytische RNA-enzymen worden aangetoond, waaronder de synthese van een spiegelbeeldversie van het hamerkop ribozym uit niet-biologische L-RNA-trifosfaten.

Inleiding

De 5′-trifosforyleerde vorm van RNA is alomtegenwoordig in de biologie omdat het wordt gegenereerd door RNA-transcriptie in alle domeinen van het leven en door RNA-replicatie tijdens de levenscyclus van veel RNA-virussen. Deze trifosfaten dienen als substraat voor de vorming van 7-methylguanylaat-capped mRNA in eukaryoten en spelen daarom een essentiële rol bij eiwitexpressie1. Het trifosfaat daarentegen wordt vastgehouden in bacteriën en virussen; RNA-5′-trifosfaten worden dus herkend door aangeboren immuniteitsresponsregulatoren in eukaryoten 2,3,4,5,6,7. Buiten de biologie is een groot aantal RNA-ligase ribozymen geëvolueerd om het 5′-trifosfaat in vitro8 te gebruiken en aangepast voor gebruik in diagnostische testen 9,10,11,12,13,14,15. Een dergelijk ribozym kan worden gebruikt voor sjabloonafhankelijke synthese van L-RNA, het niet-biologische "spiegelbeeld" enantiomeer van natuurlijk D-RNA, uit kleine L-RNA oligonucleotide 5′-trifosfaten 16,17,18. De routinematige bereiding van trifosforyleerde oligonucleotiden met een variërende sequentie en ruggengraatsamenstelling is essentieel voor het onderzoeken van deze systemen.

De meest gebruikelijke en toegankelijke methode voor het bereiden van RNA-5′-trifosfaten in het laboratorium is door in vitro transcriptie. RNA dat door deze methode wordt geproduceerd, wordt echter beperkt in sequentie en grootte door promotor- en substraatvereisten van het RNA-polymerase-enzym. T7 RNA-polymerase en gespecialiseerde derivaten zijn de meest voorkomende polymerasen die voor dit doel worden gebruikt 19,20,21,22. In vitro getranscribeerd RNA bereid met deze enzymen moet worden geïnitieerd met een 5′-terminale purine en is sterk bevooroordeeld ten opzichte van purines in de eerste 10 nucleotiden23,24. Bovendien is enzymatische integratie van base- of backbone-gemodificeerde nucleotiden op zijn best inefficiënt en vaker onmogelijk met natuurlijke polymerasen, waardoor de mogelijkheid om oligonucleotide 5′-trifosfaten te produceren die zijn samengesteld uit alles behalve natuurlijk D-RNA, wordt beperkt. Een andere beperkende factor is dat RNA gegenereerd door in vitro transcriptie aanzienlijke 5′- en 3′-heterogeniteit kan bevatten en wordt geproduceerd als extreem heterogene producten wanneer het korter is dan 20 nt 23,24,25,26,27.

Daarentegen kan chemische trifosforylering van oligonucleotiden bereid door vaste-fase fosforamidietsynthese 28,29,30,31,32,33,34,35 worden gebruikt om oligonucleotide 5′-trifosfaten van 3-50 nt lang te bereiden, van elke sequentie. Bovendien kan een breed scala aan nucleïnezuurmodificaties die toegankelijk zijn voor fosforamidietsynthese worden toegevoegd aan oligonucleotiden voorafgaand aan 5′-trifosforylering 14,15,16,17,18,29,36. Veel van deze methoden maken gebruik van het fosfaateringsreagens salicylfosforchloorniet, dat door Ludwig en Eckstein is ontwikkeld voor de oplossingsfasetrifosforylering van mononucleosiden37. Trifosforylering van oligonucleotiden met dit reagens wordt bereikt in de vaste fase door fosfaatering van het oligonucleotide 5′-hydroxyl, omzetting in het trifosfaat door reactie met pyrofosfaat en oxidatie, gevolgd door standaardprocedures voor splitsing van het oligonucleotide van de vaste ondersteuning, deprotectie en zuivering (figuur 1)28.

figure-introduction-1
Figuur 1: Schema voor trifosforylering van synthetische oligonucleotiden. In de eerste stap wordt het oligonucleotide 5ʹ-hydroxyl gefosforiseerd met SalPCl. In de volgende stap wordt het 5ʹ-salicylfosfiet gereageerd met TBAP om het cyclische metafosfiet te vormen en vervolgens in de derde stap geoxideerd om het cyclische 5ʹ-trimetafosfaat te genereren in DNA / RNA synthesizer oxidatieoplossing (0,1 M jodium / pyridine / H2O / THF), die snel wordt gehydrolyseerd om het lineaire 5ʹ-trifosfaat in dezelfde oplossing28,33 te verkrijgen, 37. Daaropvolgende alkalische splitsing van de vaste CPG-ondersteuning en deprotectie van het oligonucleotide in waterige MeNH2/ammoniak zal elk resterend cyclisch trimetafosfaat hydrolyseren naar de lineaire vorm. Afkortingen: SalPCl = salicylfosforchloorthiniet; TBAP = tributylammoniumpyrofosfaat; THF = tetrahydrofuraan; CPG = gecontroleerd poriënglas; MeNH2 = methylamine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Hoewel vroege gepubliceerde rapporten met deze methode vaak leden aan slechte opbrengsten en ongewenste nevenproducten 28,37,38, is zorgvuldig onderhoud van watervrije omstandigheden alles wat nodig is voor het routinematig verkrijgen van hoge opbrengsten. Dit kan worden bereikt door een zorgvuldige voorbereiding van reagentia en het gebruik van een eenvoudig reactieapparaat dat is samengesteld uit standaard plastic componenten. Hier demonstreren we de juiste stappen voor chemische trifosforylering van oligonucleotiden, waaronder de bereiding van reagentia, assemblage van de reactiekamer, de trifosforyleringsreactie en daaropvolgende deprotectie en zuivering van de trifosforyleerde oligonucleotiden. Ook inbegrepen is het representatieve gebruik van 5′-trifosforyleerde oligonucleotiden als substraten voor ligase ribozymen voor de synthese van grotere nucleïnezuurproducten met natuurlijke D-RNA en abiotische L-RNA-backbones.

Protocol

1. Geautomatiseerde vaste-fase synthese van 5′-hydroxyl oligonucleotiden op een vaste drager

  1. Bereid de geautomatiseerde DNA/RNA-synthesizer voor met reagentia en fosforamidieten volgens de samenstelling van het doel-oligonucleotide en de instrumentinstructies.
  2. Laad een synthesekolom met solid-support op de synthesizer en synthetiseer oligonucleotiden volgens de synthesizerinstrumentprotocollen.
    OPMERKING: De trifosforyleringsprocedure is geoptimaliseerd voor oligonucleotiden bereid op de schaal van 1 μmol.
  3. Verwijder de 5′-dimethoxytrityl beschermende groep om de solid-supported oligonucleotide 5′-hydroxyl te verkrijgen als onderdeel van de oligonucleotidesynthese in de vorige stap, of door een terminale detritylation stap uit te voeren volgens de synthesizer instrument protocollen.
  4. Verwijder de kolom met het 5′-hydroxyl oligonucleotide op vaste ondersteuning van de synthesizer, droog gedurende 10 minuten onder een huisvacuüm om het resterende oplosmiddel te verwijderen en ga over tot trifosforylering (secties 3 en 4) zodra materialen voor trifosforylering zijn bereid (sectie 2).
    OPMERKING: Indien niet onmiddellijk gebruikt, kan de gedroogde kolom onder een normale atmosfeer worden bewaard in een verzegelde plastic container met droogmiddel bij -20 °C. Verder drogen is in dit stadium niet nodig omdat de kolom grondig wordt gedroogd voorafgaand aan trifosforylering in rubriek 3.

2. Materialen voorbereiden voor trifosforylering

  1. Bevestig een droge argonbron met instelbare druk aan een gasspruitstuk met ten minste twee lijnen en sluit deze aan op een bubbler. Zorg ervoor dat de leidingen eindigen in 1 ml plastic spuiten om de verbinding met het reactieapparaat te vergemakkelijken.
  2. Verzamel apparatuur voor gebruik tijdens trifosforylering, waaronder 1 ml plastic spuiten, een drieweg polypropyleen stopkraan, niet-coring naalden, polypropyleenbuizen van 1,5 ml en een kleine metalen spatel. Bewaar ze in een afgesloten container of exsiccator met droogmiddel bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 dag voor gebruik.
  3. Bereid 30 ml elk van watervrij 1,4-dioxaan, 3:1 dioxaan:pyridine per volume, N,N-dimethylformamide (DMF) en acetonitril (ACN) in gedroogde glazen flessen van 30 ml met droogvallen (4 Å moleculaire zeven in verzegelde membraanverpakkingen) ten minste 1 dag voor gebruik. Afdichten met rubber septa, en bewaren in een desiccator met droogmiddel.
  4. Bewaar vaste 2-chloor-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one (salicylfosforchloorciet, SalPCl) in de oorspronkelijke verpakking in een afgesloten pot met droogmiddel bij 4 °C. Spoel de container altijd tussen gebruik door met argon.
  5. Bereid een tributylammoniumpyrofosfaat (TBAP) oplossing ten minste 5 dagen vóór de trifosforyleringsreactie:
    1. Weeg 1-5 g vaste TBAP in een gedroogde glazen fles van 30 ml en los op in 1 ml DMF en 0,5 ml tributylamine per g TBAP.
    2. Voeg drie droogvallen toe, sluit de fles af met een rubberen septum onder argon en bel met argon gedurende 30 minuten om te ontgassen.
    3. Bewaar in een afgesloten pot met droogmiddel bij 4 °C gedurende 5 dagen om de moleculaire zeven al het sporenwater te laten absorberen. Bewaar de pot bij -20 °C en bereid na 6 maanden vers.

3. Montage en gebruik van het trifosforyleringsapparaat

  1. Laat de synthesekolom opwarmen tot kamertemperatuur als u deze uit de opslag bij -20 °C haalt.
  2. Monteer de reactiekamer in figuur 2:
    1. Bereid de antichambre voor: verwijder de zuiger uit een droge spuit van 1 ml, knip de bovenkant van de spuit af met een schaar of een scheermesje en bevestig de spuit aan de synthesekolom. Bevestig de driewegstopkraan aan de bovenkant van de spuit en bevestig de zijinlaat van de stopkraan met de bubbler aan de droge argonbron, zodat de bovenste inlaat van de stopkraan de reagensinjectiepoort is.
    2. Bevestig dit apparaat aan een standaard met klemmen en sluit alle upstream-verbindingen af met wasafdichtingsfolie. Stel de stopkraan zo in dat de injectiepoort gesloten is en het apparaat open is voor de argonbron. Sluit de bubbler en laat argon onder lage druk (<10 psi) gedurende 5 minuten door de reactiekamer stromen.
      OPMERKING: Meerdere reactiekamers kunnen parallel aan trifosforyllaat 2-4 oligonucleotiden worden ingesteld. Er moet echter één regel van het spruitstuk worden gereserveerd voor het leveren van argon aan de reagensflessen.
    3. Open de bubbler en bevestig een spuit aan de onderkant van de synthesekolom, die de afvalspuit zal zijn. Trek argon herhaaldelijk door de kolom met behulp van de afvalspuit; bevestig vervolgens de spuit opnieuw met de zuiger volledig naar binnen geduwd.
      OPMERKING: Tenzij reagentia worden geladen, moet de stopkraan zo worden ingesteld dat de injectiepoort gesloten is en het apparaat openstaat voor de argonbron, zoals aangegeven in figuur 2A. Evenzo moet de afvalspuit worden bevestigd en de verbinding met de synthesekolom worden afgesloten met wasafdichtingsfolie, tenzij reagentia actief worden verwijderd.
  3. Een reagens of oplosmiddel toevoegen:
    1. Bevestig een naald aan de droge argonbron en steek deze in het reagens- of oplosmiddelflestussenschot, waarbij u ervoor zorgt dat de naald niet in de inhoud van de fles wordt ondergedompeld.
    2. Monteer een droge spuit met een naald en steek deze in het reagens- of oplosmiddelflestussenschot, zonder het onder te dompelen in de inhoud van de fles. Vul de spuit met argon, trek de naald uit het septum en verwijder het argon. Vul de spuit met argon en verdrijf opnieuw; vul vervolgens de spuit met het vereiste volume oplosmiddel of reagens onder argondruk.
    3. Stel de stopkraan op het apparaat zo in dat de argonbron gesloten is en de injectiepoort open is (figuur 2B). Verwijder snel de gevulde spuit en naald uit de bronfles, veeg het oplosmiddel dat aan de zijkant of punt van de naald is geplakt weg en steek de naald in de injectiepoort. Verwijder het reagens in de antichambre van het apparaat, verwijder de naald en sluit de injectiepoort, waardoor het apparaat opnieuw wordt geopend naar de argonbron.
    4. Zuig de vloeistof voorzichtig uit de antichambre helemaal door de synthesekolom met behulp van de afvalspuit, zodat alle vloeistof nu in de afvalspuit wordt bewaard. Duw de oplossing nu langzaam terug in de synthesekolom en zorg ervoor dat er geen gasbellen in de kolom zitten. Om te mengen of te roeren, trekt u de oplossing voorzichtig op en neer over de kolom met de afvalspuit.
      OPMERKING: Beweeg de vloeistof altijd langzaam en voorzichtig door de reactiekamer om ervoor te zorgen dat er geen afdichtingen worden verbroken, waardoor lucht het apparaat kan binnendringen.
  4. Een reagens of oplosmiddel uit de kolom verwijderen:
    1. Trek de oplossing langzaam in de afvalspuit. Nadat het grootste deel van de oplossing in de afvalspuit is gegaan, trekt u argon door om het resterende oplosmiddel uit de kolom te spoelen.
    2. Verwijder de wasafdichtingsfolie rond de voeg van de afvalspuit, verwijder vervolgens de spuit en gooi de afvaloplossing weg. Vervang de afvalspuit door een nieuwe, droge spuit en sluit de verbinding opnieuw met wasafdichtingsfolie.

figure-protocol-1
Figuur 2: Trifosforyleringsapparatuur. Tijdens het mengen of reacties is het apparaat (A) open voor de argonbron (i) en gesloten voor de lucht door de driewegstop (ii) aan te passen. Reagentia worden uit de antichambre (iii) in de synthesekolom (iv) getrokken door middel van de afvalspuit (v). Reagentia worden verwijderd door alle vloeistof in de afvalspuit (v) te trekken en weg te gooien. Bij het laden van reagentia (B) is de driewegstopkraan (ii) open voor de atmosfeer en wordt het reagens in de antichambre (iii) geladen door middel van een spuit en naald (vi). C) Een foto van de onder A) bedoelde gemonteerde apparatuur voor het mengen en reageren van reagentia. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Trifosforylering op de kolom van synthetische 5′-hydroxyl oligonucleotide

  1. Verwijder de SalPCl- en TBAP-oplossing uit de opslag bij -20 °C en laat ze voor gebruik opwarmen tot kamertemperatuur.
  2. Voeg 200 μL pyridine/dioxaan toe aan de antichambre, overeenkomstig de stappen 3.3.1-3.3.3. Laad het oplosmiddel echter pas in stap 4.4 op de synthesekolom.
  3. Gebruik een spatel van droog metaal om 6-12 mg SalPCl te wegen in een droge microcentrifugebuis van 1,5 ml en los op in 100 μL dioxaan door het oplosmiddel voorzichtig op en neer te slingeren in de microcentrifugebuis.
  4. Voeg de opgeloste SalPCl toe aan de antichambre en laad deze op de synthesekolom, volgens stap 3.3. Laat het 15 minuten reageren en roer de oplossing om de 5 minuten. Verwijder en gooi de SalPCl-oplossing weg volgens stap 3.4.
    OPMERKING: SalPCl wordt in grote overmaat toegevoegd en zal al het water dat tijdens de bereiding en het laden in de reactiekamer wordt geabsorbeerd, opruimen. De introductie van vocht tijdens stap 4.5 en 4.6 zal echter de uiteindelijke oligonucleotide 5′-trifosfaatopbrengst in gevaar brengen.
  5. Voeg 250 μL TBAP-oplossing toe aan de antichambre en laad deze op de synthesekolom, volgens stap 3.3. Laat het 20 minuten reageren en roer om de 5 minuten. Verwijder en gooi de TBAP-oplossing weg volgens stap 3.4.
  6. Was de kolom met 0,5 ml DMF en vervolgens 0,5 ml ACN en verwijder het oplosmiddel na elke toevoeging volgens stap 3.3 en 3.4.
  7. Voeg 250 μL oxidatoroplossing (0,1 M jodium in tetrahydrofuraan (THF)/pyridine/water, 88:10:2) toe aan de antichambre en laad deze op de synthesekolom, volgens stap 3.3. Laat het 30 minuten reageren en roer om de 10 minuten. Verwijder en gooi de oxidatoroplossing weg volgens stap 3.4.
  8. Was de kolom met 0,5 ml ACN en verwijder deze volgens stap 3.3 en 3.4.
  9. Demonteer het reactieapparaat. Was de synthesekolom met 5 ml ACN en droog de kolom.

5. Decolleté van vaste ondersteuning, bescherming en zuivering

  1. Verwijder de gedroogde vaste steunhars uit de synthesekolom en breng deze over in een 1,5 ml polypropyleen schroefdop afsluitbare buis met een siliconen o-ring.
  2. Suspensie de hars in 1 ml van een 1:1 mengsel van 28% -30% waterige ammoniak en 40% waterige methylamine (AMA) en sluit de buis goed af. Incubeer bij 65 °C gedurende 10 minuten met intermitterende menging door zachte inversie39. Gebruik een mildere behandeling bij kamertemperatuur gedurende 2 uur voor oligonucleotiden langer dan 40 nt.
    LET OP: Verhitting van de AMA-oplossing zal de buis onder hoge druk zetten. Als de buis niet goed is afgesloten of geen ammoniakcompatibele (siliconen) o-ring gebruikt, kan de buis gas ontluchten of oplosmiddel lekken, wat mogelijk de veiligheid of de opbrengst van het eindproduct in gevaar brengt. Open de buis nooit terwijl deze boven de omgevingstemperatuur is, omdat de hete AMA-oplossing gas met geweld kan ontwikkelen.
  3. Koel de buis op ijs en centrifugeer deze kort (6.000-12.000 × g gedurende 10 s). Verwijder het supernatant uit de hars, filter door een spuit met een filter van 0,2 μm en breng over op een nieuwe, steriele polypropyleenbuis. Verdamp de oplossing tot droogheid met behulp van een vacuümcentrifuge uitgerust met een ammoniakneutraliserende chemische val.
    OPMERKING: Als het synthetische oligonucleotide geen RNA-nucleotiden met 2′-silylbeschermende groepen bevat, gaat u verder met stap 5.8.
  4. Verwijder silylbeschermende groepen door het gedroogde materiaal op te lossen in 1 ml tetrabutylammoniumfluoride (TBAF) in THF, te verwarmen tot 55 °C, indien nodig te schudden om het oligonucleotide volledig op te lossen en te broeden bij kamertemperatuur gedurende 16-24 uur40,41.
  5. Doof de TBAF-oplossing met 1 ml Tris-buffer van 1 M, pH 7,5 en verwijder THF met behulp van een vacuümcentrifuge.
  6. Verwijder TBAF-zouten met behulp van een kolom met uitsluiting van wegwerpgrootte, volgens de instructies van de fabrikant. Voor oligonucleotiden korter dan 15 nt, bevestig de elutie van het product door het eluaat in fracties te verzamelen en de belangrijkste productfracties te identificeren door absorptie bij 260 nm op een UV-Vis-spectrofotometer.
  7. Concentraat het beschermde RNA-oligonucleotide door lyofilisatie of vacuümcentrifuge als het minder dan 15 nt is, of door ethanolprecipitatie als het groter is dan 15 nt.
  8. Bereid een preparatieve schaal 10% -20% polyacrylamide / 8 M ureum / 1x TBE-gel met behulp van 19: 1 mono: bis acrylamide-bouillon, volgens de juiste protocollen voor oligonucleotidegrootte, gelplaat en standaard. Monteer de gelplaat in de gelstandaard met 1x TBE in reservoirs en pre-run op 35 W (of, indien van toepassing voor gelplaatformaat) gedurende ten minste 30 minuten.
  9. Los het vaste oligonucleotide op in de laadbuffer van ureumgel (8 M ureum, 10% sucrose, 50 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA met broomfenol en xyleencyaanhoudende kleurstoffen) en verwarm tot 80 °C. Laad de polyacrylamidegel op en laat 1-2 uur lopen bij 25-35 W (of, indien van toepassing voor het gelplaatformaat en de oligonucleotidegrootte).
    OPMERKING: Broomfenolblauw of xyleencyyanol moet worden uitgesloten van de gelbelastingsbuffer voor oligonucleotiden korter dan 15 nt als een van beide samen met het product migreert, omdat het moeilijk is om deze kleurstoffen uit het geëlueerde oligonucleotide te verwijderen zonder ethanolprecipitatie.
  10. Wanneer de elektroforese van de gel is voltooid, verwijdert u de gelplaat van de gelstandaard, demonteert u de gelplaat en wikkelt u de gel in polyvinylchloridefilm. Identificeer de productbanden door back-shadowing met 254 nm UV-licht en snijd de belangrijkste productband weg met behulp van een scheermesje.
  11. Extraheer het oligonucleotide uit de uitgesneden gel volgens de crush and soak methode42.
    1. Plet de weggesneden gel door deze door een plastic spuit of mechanisch te extruderen.
    2. Voor oligonucleotiden langer dan 15 nt:
      1. Eluteer in 3x volumes crush and soak buffer (300 mM NaCl; 10 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA) gedurende ten minste 12 uur met agitatie of schudden.
      2. Verwijder vaste gelstukken door de oplossing door een spuit met een filter van 0,2 μm te laten lopen en concentreer het oligonucleotide door precipitatie van ethanol.
    3. Voor oligonucleotide korter dan 15 nt:
      1. Eluteer in 3x volumes nucleasevrij water gedurende ten minste 12 uur met agitatie of schudden.
      2. Verwijder vaste gelstukken door de oplossing door een spuit met een filter van 0,2 μm te laten gaan en concentreer door lyofilisatie.
      3. Verwijder resterende zouten en opgeloste stoffen met behulp van een wegwerpmaatuitsluitingskolom zoals in stap 5.6. Concentreer je door lyofilisatie.
  12. Gezuiverde trifosforyleerde oligonucleotiden bewaren bij -20 °C in TE-buffer (10 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA) of in een vergelijkbare oligonucleotideopslagbuffer.
    1. Bepaal de concentratie van het oligonucleotide door de absorptie bij 260 nm te meten met behulp van een UV-Vis-spectrofotometer.
      OPMERKING: De geschatte extinctiecoëfficiënt van het oligonucleotide mag niet worden beïnvloed door de 5′-fosforyleringstoestand en kan worden berekend op basis van de sequentie met behulp van een oligonucleotide-extinctiecoëfficiëntcalculator.
    2. Controleer trifosforylering door massaspectrometrie. Zoek naar een verwachte massa van +239,94 Da ten opzichte van die van het 5′-hydroxyl oligonucleotide.
      OPMERKING: Matrix-assisted laser desorption/ionization of electrospray ionization mass spectrometry (respectievelijk MALDI-MS of ESI-MS) zijn geschikt voor het identificeren van de trifosforyleringstoestand van het oligonucleotide bij het gebruik van protocollen die zijn geoptimaliseerd voor nucleïnezuren. ESI-MS levert echter consistentere resultaten op vanwege lagere percentages van ionfragmentatie; een representatieve commerciële dienst wordt aangeboden in de tabel met materialen.

6. Trifosforyleerde oligonucleotiden als substraten voor ribozym-zelfreplicatie

LET OP: 32P is een radioactieve isotoop en de volgende stappen moeten worden uitgevoerd met behulp van standaard veiligheidsprotocollen voor het werken met radioactieve materialen in een laboratorium en door een onderzoeker die is gecertificeerd voor het gebruik van radioactieve materialen door de relevante afdelingen voor milieugezondheid en -veiligheid. Als alternatief kan zelfreplicerend ribozymsubstraat A synthetisch worden bereid met een 5′-fluoresceïnelabel14 en fluorescerend worden afgebeeld, zoals in stap 7.9.

  1. Bereid oplossing A als een mengsel van zelfreplicator ribozym E en 5′-32P-gelabeld RNA-substraat A14 tot concentraties van respectievelijk 0,30 μM en 30 μM. Bereid oplossingen B-getranscribeerd en B-synthetisch met 15 μM trifosforyleerd RNA-substraat B, bereid door in vitro transcriptie14 of chemische trifosforylering zoals hierboven, respectievelijk in 75 mM EPPS-buffer, pH 8,5 en 37,5 MgCl2. Breng beide oplossingen op 42 °C.
    OPMERKING: Alle RNA-componenten worden vermeld in de tabel met materialen.
  2. Om zelfreplicatie te initiëren, mengt u snel 5 μL oplossing A met 10 μL oplossing B-getranscribeerd of B-synthetisch tot een eindconcentratie van 0,1 μM E, 10 μM A, 10 μM B, 25 mM MgCl2 en 50 mM EPPS-buffer, pH 8,5. Incubeer het reactiemengsel bij 42 °C.
  3. Neem met regelmatige tussenpozen 0,5 μL aliquots en doof in 9,5 μL formamide gel loading buffer (95% formamide; 10 mM EDTA, pH 8).
  4. Bereid een analytische polyacrylamide/8 M ureum/1x TBE-gel, volgens de juiste protocollen voor de gelplaat en standaard. Monteer de gietgel en plaat in een gelstandaard, vul de reservoirs met 1x TBE en prerun op 40 W (of, indien van toepassing voor verschillende gelplaten en standaards) gedurende 30 minuten.
  5. Verwarm de gebluste reactiemonsters tot 80 °C, laad 5 μL van het monster in elke put en laat de gel gedurende ongeveer 40 minuten op 40 W draaien (of, naar gelang van het geval voor verschillende gelplaten en standaards).
  6. Verwijder de gelplaat van de gelstandaard, demonteer en wikkel de gel in polyvinylchloridefilm. Bedek de gel met een fosforzeef en bedek gedurende 1 uur (of, indien van toepassing, voor 32P cpm); scan het scherm met behulp van een fluorescerende/fosforescerende gelscanner.
  7. Kwantificeer de reactieopbrengst met behulp van gelbeeldkwantificeringssoftware.
    1. Open de gelafbeelding met de Analysis Toolbox, kies Analysis | Vormdefinitie, selecteer Gebieden | de rechthoekige vorm en teken rechthoeken van dezelfde grootte rond banden die overeenkomen met niet-gereageerde A en product E voor elke keer en beide reacties.
    2. Kies analyse | Achtergrondaftrek, selecteer Gebieden | de vorm van de rechthoek en teken een rechthoek van dezelfde grootte in een leeg gedeelte van de gelafbeelding. Wijzig de methode voor achtergrondaftrek voor alle rechthoeken in Afbeeldingsrechthoek.
    3. Kies Venster | 2-gebiedsvenster en vervolgens | bewerken Exporteren naar Excel om de gekwantificeerde bandpixelvolumes te exporteren naar een spreadsheetbestand.
  8. Plot de concentratie van product E versus tijd en pas de gegevens aan op de logistieke groei Eq (1) met behulp van statistische data-fitting software:
    [E] = figure-protocol-2 (1)
    Waar a de maximale omvang van de reactie is, is b de mate van sigmoidicity en c de exponentiële groeisnelheid.
    1. Deel in de geëxporteerde spreadsheet het product E-volume door de som van substraat A- en product E-volumes om de fractionele opbrengst van het product voor elke keer en beide reacties te bepalen. Vermenigvuldig met de beginconcentratie van substraat A (10 μM) om de opbrengst van product E te bepalen als functie van de tijd.
    2. Kies in software voor het aanpassen van statistische gegevens de optie Bestand | Nieuwe | Nieuw projectbestand, selecteer XY onder Nieuwe tabel en grafiek en klik op Maken. Voer de reactietijden en product E-opbrengsten voor beide reacties in aangrenzende kolommen in en label kolommen dienovereenkomstig (bijv. "tijd", "getranscribeerd B", "synthetisch B").
    3. Kies | invoegen Nieuwe analyse, selecteer XY-analyses | Niet-lineaire regressie (curve fit) en klik vervolgens op OK. Kies groeicurves | Logistieke groei en klik op OK; pas geen andere parameters aan. Observeer de fitparameters en betrouwbaarheidsintervallen onder Resultaten en de plot van gegevenspunten en aangepaste curven onder Grafieken.

7. Cross-chirale kopiëren van L-RNA

  1. Bereid 10 μL RNA-oplossing met 20 μM D-RNA 27,3t cross-chiral polymerase, 2 μM 5′-fluoresceïne-gelabelde L-RNA primer, 4 μM gebiotinyleerd L-RNA hamerkopsjabloon en 20 μM elk van L-RNA pppCUG, pppAUG, pppAGG en pppCGC, in 10 μL van 50 mM Tris, pH 8,3. Gloei het RNA door het gedurende 1 minuut te verwarmen tot 90 °C en af te koelen tot 23 °C bij 0,2 °C/s in een PCR-thermocycler. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over het polymerase, de primer en de sjabloon.
  2. Incubeer de RNA-oplossing bij 17 °C en start de reactie door toevoeging van 10 μL 2x startbuffer (400 mM MgCl2, 500 mM NaCl en 50 mM Tris, pH 8,3). Zorg ervoor dat de eindconcentraties van alle componenten van de reactie 10 μM polymerase, 1 μM primer, 2 μM template, 10 μM elk trinucleotide 5′-trifosfaat, 200 mM MgCl2, 250 mM NaCl en 50 mM Tris, pH 8,3 zijn.
  3. Naarmate de reactie vordert, neemt u 10 μL aliquots en blust u met 5 μL van 0,5 M EDTA, pH 8.
  4. Voeg aan elk geblust reactiemonster 0,1 mg streptavidin-gecoate magnetische kralen (20 pmol biotine-oligonucleotide bindingscapaciteit) toe, gesuspendeerd in 10 μL van 1 M NaCl in TE-buffer met 0,05% neutraal reinigingsmiddel om trimer-extended primers via de gebiotinyleerde sjabloon op te vangen en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met schudden te incuberen.
  5. Vang de kralen op een kraalvangermagneet, verwijder en gooi vloeistof weg en voeg 50 μL wasoplossing toe (250 mM NaCl in TE met 0,05% neutraal reinigingsmiddel). Meng de kralen, vang ze opnieuw op en verwijder de wasoplossing. Herhaal dit nogmaals.
  6. Om verlengde primers uit kralen te elueren, voegt u 50 μL elutie-oplossing toe (25 mM NaOH met 0,05% neutraal reinigingsmiddel) en mengt u de kralen. Herwin de kralen, verwijder de elutie-oplossing, blus met 100 mM Tris (pH 7,5) en stort neer met ethanol.
  7. Bereid een analytische polyacrylamide/8 M ureum/1x TBE-gel, volgens de juiste protocollen voor de gelplaat en standaard. Monteer de gietgel en plaat in een gelstandaard, vul de reservoirs met 1x TBE en prerun op 40 W (of, indien van toepassing voor verschillende gelplaten en standaards) gedurende 30 minuten.
  8. Los het neergeslagen RNA op in 10 μL formamide gel laadbuffer en bereid niet-gereageerde eindgelabelde primer op 0,5 μM in formamide gel laadbuffer. Verwarm monsters tot 80 °C, laad 5 μL van het monster in elke put en laat de gel gedurende ongeveer 40 minuten op 40 W draaien (of, indien van toepassing voor verschillende gelplaten en standaards).
  9. Verwijder de gelplaat van de standaard en scan met een fluorescerende/fosforescerende gelscanner om cross-chirale L-RNA-uitbreidingsproducten te visualiseren.

Resultaten

Oligonucleotiden moeten worden gesynthetiseerd met behulp van standaardprotocollen die geschikt zijn voor de fosforamidieten en geautomatiseerde DNA/RNA-synthesizer, waarbij het product oligonucleotide wordt afgeroomd van de vaste drager in de oorspronkelijke plastic synthesekolom, waarbij de 5ʹ-terminale dimethoxytritylgroep wordt verwijderd om de vrije 5ʹ-hydroxyl te verkrijgen (sectie 1). Alle oligonucleotiden die in deze demonstratie werden gebruikt, werden bereid met behulp van 1.000 Å-gecontroleerde porieglas (CPG) hars als de vaste ondersteuning en uitgevoerd op de schaal van 0,2 of 1 μmol. Representatieve voorbeelden van synthesizerkolommen, harsen, reagentia en fosforamidieten zijn te vinden in de Tabel van Materialen. Voor reacties op grotere schaal moeten mogelijk volumes en tijden die in volgende stappen worden gebruikt, worden aangepast.

De trifosforyleringsreactie wordt op de kolom uitgevoerd in een op maat gemaakte reactiekamer (figuur 2, punt 3) met behulp van standaard, in de handel verkrijgbare componenten die zijn opgenomen in de materiaaltabel en volgt het schema dat wordt geïllustreerd in figuur 1 (sectie 4) 28. Het is van essentieel belang dat de omstandigheden tijdens trifosforylering strikt watervrij worden gehouden en dat alle oplosmiddelen en reagentia van tevoren over moleculaire zeven worden bereid en vóór gebruik volledig worden gedroogd (punt 2). Trifosforylering duurt meestal 2 uur en daarna kan de gewassen en gedroogde kolom worden behandeld volgens standaard oligonucleotide-deprotectie- en zuiveringsprocedures (sectie 5).

Na deprotectie worden oligonucleotidetrifosfaten gezuiverd door polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) te denatureren, waarbij een enkele belangrijke productband wordt getoond door UV-back-shadowing die uit de gel kan worden weggesneden en geëlueerd. Het 5′-trifosfaatproduct wordt gemakkelijk gescheiden van reactiezijdeproducten voor korte oligonucleotiden, zoals aangetoond voor DNA-trinucleotide 5ʹ-trifosfaten, pppAAA en pppCCC, en L-RNA-trinucleotide 5ʹ-trifosfaat pppGAA in figuur 3A,B. Zowel de 5′-hydroxyl- als de 5′-trifosfaatproducten voor AAA- en CCC-DNA-trimers werden weggesneden en geïdentificeerd door massaspectrometrie en dienovereenkomstig geëtiketteerd in figuur 3A. Extra banden, zoals zichtbaar voor de AAA DNA-trimer, bevatten over het algemeen niet genoeg materiaal om te herstellen en te identificeren. De aanwezigheid van deze banden correleert echter met extra productmassa's in de niet-gezuiverde reactieproducten (figuur 3C), die doorgaans 5′-difosfaat, monofosfaat en H-fosfonaatzijdeproducten vertegenwoordigen, zoals hieronder besproken.

Na PAGE-zuivering kunnen grotere oligonucleotiden worden geëlueerd met behulp van de crush and soak-methode42 en de daaropvolgende ethanolprecipitatie. Oligonucleotiden van minder dan 15 nt kunnen echter niet efficiënt worden neergeslagen en vereisen dus een gewijzigde procedure voor gel-elutie (stap 5.11.3). De kolom met uitsluiting van wegwerpgroottes in de tabel met materialen is alleen geclassificeerd voor gebruik met oligonucleotiden langer dan 10 nt. We hebben echter ontdekt dat oligonucleotiden zo kort als trimers effectief kunnen worden ontzout met behulp van het door de fabrikant aanbevolen protocol. Niettemin wordt aanbevolen bij het ontzouten van korte oligonucleotiden (zoals in stappen 5.6 en 5.11.3) dat het kolomaccum in fracties wordt verzameld en dat productfracties worden geïdentificeerd door absorptie bij 260 nm met behulp van een UV-Vis-spectrofotometer. Een kolom voor het uitsluiten van grootte die is geoptimaliseerd voor kortere oligonucleotiden is als alternatieve keuze beschikbaar in de tabel met materialen . De uiteindelijke opbrengst van oligonucleotidesynthese op schaal 1 μmol na zuivering is 50-300 nmol.

Trifosforylering kan worden bevestigd door massaspectrometrie, waarbij het trifosforyleerde product een massa heeft van +239,94 Da groter dan het 5′-hydroxyl-oligonucleotide, hoewel de aanwezigheid van materialen die overeenkomen met het 5′-di- en monofosfaat (respectievelijk +159,96 en +79,98 Da) vaak wordt waargenomen. Een 5′-H-fosfonaat bijproduct met een massa +63,98 Da uit de 5′-OH-massa kan ook worden waargenomen, en hoge niveaus van dit product wijzen erop dat de omstandigheden tijdens trifosforylering niet voldoende watervrij waren. Voorafgaand aan de zuivering zullen beschermde oligonucleotiden doorgaans al deze producten tonen (figuur 3C), terwijl gezuiverd materiaal een piek zal vertonen die overeenkomt met het 5′-trifosfaatproduct samen met 5′-di- en monofosfaten (figuur 3D,E).

Massaspectrometrie alleen zal meestal geen rigoureuze meting van 5′-trifosfaatzuiverheid geven als gevolg van differentiële ionisatiesnelheden en fragmentatie van het trifosfaat tijdens ionisatie. Om de zuiverheid van het eindproduct te meten, worden omgekeerde fase vloeistofchromatografie en tandem ESI-MS (RP-LC/ESI-MS) aanbevolen, met name voor langere oligonucleotiden. Analyse van D-RNA 5ʹ-trifosfaten pppACGAGG en pppGACCGCAACUUA door RP-LC/ESI-MS (respectievelijk figuur 4A,B) toont een typische zuiverheid van het eindproduct, met 20% 5ʹ-difosfaat, aangezien deze twee soorten moeilijk te scheiden zijn wanneer ze aanwezig zijn op langere oligonucleotiden.

Synthetische 5′-trifosfaat oligonucleotiden functioneren doorgaans even goed of beter dan materialen die enzymatisch worden bereid in biochemische studies. In rubriek 6 werden bijvoorbeeld 5′-trifosfaat 14 nt RNA-substraten die synthetisch of door in vitro transcriptie waren bereid, vergeleken in een RNA-gekatalyseerde zelfreplicatiereactie 14,15,43,44,45. Ribozym E katalyseert het samenvoegen van substraten A en B om een nieuwe kopie van E te verkrijgen in een autokatalytische reactie die exponentiële groei mogelijk maakt (figuur 5A). E- en 32P-gelabelde A-componenten werden bereid door in vitro transcriptie en trifosforyleerd substraat B werd synthetisch bereid, zoals hierboven beschreven, of door in vitro transcriptie14. De voortgang van de zelfreplicatiereactie werd gemonitord door periodieke monsters te nemen die werden geanalyseerd door PAGE te denatureren en gekwantificeerd via een fluorescerende / fosforescerende gelscanner. De resulterende gegevens, passend bij een logistieke groeifunctie, onthulden dat getranscribeerd of synthetisch B-substraat exponentiële groei ondersteunt, maar synthetische B geeft een iets grotere hoeveelheid product (figuur 5B). Dit resultaat kan heterogeniteit weerspiegelen aan het 5′-einde van RNA bereid door in vitro transcriptie23,24.

Chemische trifosforylering maakt ook de synthese mogelijk van oligonucleotidetrifosfaten die niet biologisch kunnen worden bereid, noch in vitro , noch in cellen. In rubriek 7 werden niet-biologische oligonucleotidetrifosfaten bestaande uit L-RNA, het enantiomeer van natuurlijk D-RNA, bereid zoals in rubriek 1-5, gebruikt als substraten voor het D-RNA "cross-chirale" polymerase ribozyme 27.3t (figuur 6A), dat de sjabloongerichte polymerisatie van een langer L-RNA-product van kort L-RNA-oligonucleotide 5′-trifosfaten op een sequentie-algemene manier katalyseert. Als voorbeeld kan het ribozym een L-RNA-versie van het hamerkopzelfsplitsingsmotief synthetiseren (figuur 6B)18. Gezuiverde L-RNA trinucleotide trifosfaten werden gecombineerd met een fluoresceïne-gelabelde L-RNA primer en L-RNA template (Figuur 6C) en reageerden met de cross-chiral ligase. Monsters in de loop van de reactie werden geanalyseerd door PAGE en in beeld gebracht met behulp van een fluorescerende / fosforescerende gelscanner om de synthese van een L-RNA-versie van het hamerkop ribozym gecodeerd door de sjabloon aan te tonen (figuur 6D).

figure-results-1
Figuur 3: Zuivering van trinucleotide 5ʹ-trifosfaten. (A) PAGE-analyse (gevisualiseerd door UV-back-shadowing) van trifosforylering van DNA-trinucleotiden tri-deoxyadenosine (AAA, blauw) en tri-deoxycytidine (CCC, rood), opzettelijk overbelast om kleine bijproducten te visualiseren. Zowel het 5ʹ-trifosfaatproduct (ppp) als het 5ʹ-hydroxyl (OH) uitgangsmateriaal werden door MALDI-MS weggesneden en geïdentificeerd. (B) Preparatieve PAGINA van trifosforylering van L-RNA-trinucleotide GAA, waarbij de belangrijkste productband is weggesneden en door ESI-MS is geïdentificeerd als het 5ʹ-trifosfaat (ppp). C) MALDI-MS van producten met ruwe reactie na deprotectie en D) gezuiverde producten van (A). 5ʹ-trifosfaat (ppp; pppAAA verwachtte 1.119 Da, waargenomen 1.118 Da; pppCCC verwachtte 1.047 Da, waargenomen 1.046); 5ʹ-difosfaat (pp), 5ʹ-monofosfaat (p), 5ʹ-hydroxyl (OH) en 5ʹ-H-fosfonaat (Hp) zijn gelabeld. (E) Gedeconvolueerd massaspectrum van directe injectie ESI-MS van geïsoleerd 5ʹ-trifosfaatproduct uit (B), met geïdentificeerde pieken gelabeld (verwacht 1.181,6 Da, waargenomen 1.181,0 Da). 5ʹ-difosfaat (pp) producten worden ook waargenomen, evenals natriumion pieken voor zowel de tri- als di-fosfaat producten (+22 Da). Veelvoorkomende verontreinigingspieken zijn gelabeld met een sterretje. Voor het gemak van vergelijking werden massaspectra genormaliseerd tot de hoogste intensiteit gemeten in elk spectrum en worden gerapporteerd als een percentage ten opzichte van die waarde. Afkortingen: PAGE = polyacrylamide gel elektroforese; MALDI-MS = matrixondersteunde laserdesorptie/ionisatie; ESI-MS = elektrospray ionisatie massaspectrometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 4: Analytische RP-LC van 6 nt en 14 nt D-RNA oligonucleotide trifosfaten. (A) 5ʹ-pppACGAGG-3ʹ en (B) 5ʹ-pppGAGACCGCAACUUA-3ʹ. Tandem ESI-MS identificeerde de belangrijkste piek van beide (~ 70%) als het 5ʹ-trifosfaat (ppp), met kleinere hoeveelheden van het 5ʹ-difosfaat (pp). Afkortingen: RP-LC = reverse-phase liquid chromatography; nt = nucleotiden; ESI-MS = elektrospray ionisatie massaspectrometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 5: Vergelijking van oligonucleotide 5ʹ-trifosfaatsubstraten bereid door chemische synthese of in vitro transcriptie. (A) Het zelfreplicerende ribozym E ligeert RNA A en 5′-trifosforyleerd RNA B. (B) Vergelijking van zelfreplicatiereacties met behulp van 10 μM A en 10 μM B, hetzij synthetisch (open cirkels) of in vitro getranscribeerd (gevulde cirkels). (B) Gegevens waren geschikt voor de logistieke groeivergelijking: [E] = a / (1 + b e-ct), waarbij a de uiteindelijke opbrengst is, b de mate van sigmoidicity en c de exponentiële groeisnelheid. De groeipercentages voor de twee reacties waren identiek, bij 1,14 h-1, terwijl de uiteindelijke omvang 10% hoger was voor reacties met synthetische B. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-4
Figuur 6: Cross-chirale L-RNA polymerisatie met een ribozym. (A) Het D-RNA 27.3t polymerase ribozyme, dat sjabloonafhankelijke ligatie van L-RNA katalyseert. (B) Het door 27,3 ton gesynthetiseerde L-RNA-product maakt deel uit van een hamerkop-endonucleasemotief. (C) L-RNA-polymerisatie gekatalyseerd door 27,3 ton met behulp van een gebiotinyleerd L-RNA-sjabloon (bruin), een end-label L-RNA-primer (magenta) en vier L-RNA-trinucleotidetrifosfaten (cyaan), synthetisch bereid. (D) PAGE-analyse van uitbreidingsproducten van (B) na 4 uur en 24 uur, waarbij elke trinucleotide-incorporatie tot een volledig product (zwarte stip) wordt getoond. Niet-gereageerde L-RNA-primer is opgenomen als referentiemarker. Afkortingen: PAGE = polyacrylamide gel elektroforese; M = referentiemarkering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

De hier beschreven trifosforyleringsprocedure is in grote lijnen compatibel met oligonucleotidesynthese met behulp van standaard fosforamidietchemie. Nucleosidefosforamidieten moeten baselabiele beschermende groepen hebben die compatibel zijn met snelle deprotectie in AMA39, waaronder de standaard β-cyanoethyl op het fosfiet, en isobutyryl, dimethylformamidyl, acetyl, fenoxyacetyl of 4-isopropylfenoxyacetylgroepen op de exocyclische amines van de nucleobasen. Ribose 2'-hydroxylgroepen moeten worden beschermd door silylbeschermende groepen, hetzij t-butyldimethylsilyl (TBDMS) of tri-iso-propylsilyloxymethyl (TOM)40,41. Van de base-labile pivaloyloxymethyl (PivOM) groep is ook gemeld dat het compatibel is met chemische trifosforylering30.

Er zijn meerdere methoden beschreven voor de chemische trifosforylering van synthetische oligonucleotiden 28,29,30,31,32,33,34,35. We hebben ontdekt dat trifosforylering met behulp van het Ludwig-Eckstein-reagens37 een van de meest toegankelijke is, waarvoor geen gespecialiseerde synthese van reagentia en geen gespecialiseerde apparatuur nodig is. Oligonucleotide-5′-trifosfaten bereid volgens deze methode zijn routinematig gebruikt als substraten voor RNA-ligase ribozymen, inclusief het gebruik van enzymatisch ontoegankelijke L-RNA oligonucleotide trifosfaten om sjabloonafhankelijke synthese en replicatie van dit "spiegelbeeld" nucleïnezuur te bereiken 14,16,17,18 . De methode is ook geschikt voor de bereiding van kleine 5′-trifosforyleerde stamlus-RNA's die krachtige activatoren zijn van de aangeboren immuunrespons bij gewervelde dieren 6,7.

Het Ludwig-Eckstein-reagens, salicylfosforchloorthiaat37, is zeer reactief op water en ruimt effectief al het water op dat wordt ingebracht bij het oplossen van het reagens voordat het op de oligonucleotidekolom wordt geladen. Na dit punt zal het 5′-fosfaat-oligonucleotide echter bij voorkeur reageren met water dat in het systeem wordt ingebracht boven pyrofosfaat, waardoor een 5′-H-fosfonaatbijproduct wordt gevormd na work-up 28,37,38. Zorgvuldige bereiding van trifosforyleringsreagentia en de trifosforyleringsreactiekamer zorgen ervoor dat dit bijproduct niet wordt gevormd. Voor het drogen van oplosmiddelen worden moleculaire zeven van type 4 Å voorverpakt verkocht in teflonzakken die compatibel zijn met de meeste organische oplosmiddelen onder verschillende merknamen door de meeste oligonucleotidesynthesereagens. Aanvullende voorzorgsmaatregelen, zoals het uitvoeren van trifosforylering in een handschoenenkastje onder een watervrije atmosfeer, zijn over het algemeen niet nodig.

Reactie van het 5′-phosphitylated oligonucleotide met TBAP vormt een cyclisch 5′-trimetafosfiet intermediair, dat vervolgens wordt geoxideerd tot het cyclische 5′-trimetafosfaat met behulp van oligonucleotidesynthese-oxidatoroplossing (jodium in water/pyridine/THF). Opgemerkt moet worden dat commerciële oxidatieoplossingen verschillende hoeveelheden jodium gebruiken en het is essentieel om de hoge jodiumconcentratie van 0,1 M te gebruiken om volledige oxidatie naar het trifosfaat te garanderen. Het cyclische product wordt gehydrolyseerd tot het uiteindelijke lineaire 5′-trifosfaat in dezelfde oplossing37, en alternatieve, watervrije oxidatieoplossingen moeten worden gebruikt als linearisatie met andere nucleofielen dan water gewenst is (zie hieronder voor toepassingen)33. Eventuele resterende cyclische trimetafosfaat zal echter worden gelineariseerd tijdens de daaropvolgende alkalische deprotectie van het oligonucleotide. Hydrolyse van het cyclische 5′-trimetafosfaat levert alleen het lineaire, in plaats van vertakte trifosfaat37,46 op.

Oligonucleotide-deprotectie hoeft meestal niet te worden gewijzigd om 5′-trifosforylering mogelijk te maken, maar er moeten een paar voorzorgsmaatregelen worden genomen. Het trifosfaat is relatief stabiel tot korte blootstelling aan alkalische omstandigheden, maar er moet voor worden gezorgd dat het trifosfaat niet langer dan nodig aan AMA wordt blootgesteld. Beschermingsgroepen die een langere behandeling in ammoniak of AMA gedurende meer dan 10 minuten bij 65 °C vereisen, moeten worden vermeden. Zachtere behandelingen, zoals 2 uur ammoniak bij kamertemperatuur, zijn acceptabel wanneer ze compatibel zijn met andere fosforamidietbeschermende groepen. Een veel voorkomende, snelle deprotectiemethode voor silyl-beschermde synthetische RNA-oligonucleotiden maakt gebruik van triethylaminetrihydrofluoride en hoge temperatuur47; dit moet echter worden vermeden bij de bereiding van RNA-5′-trifosfaten, aangezien de langdurige zure omstandigheden de trifosfaathydrolyse blijken te versnellen31,32.

Preparatieve PAGE is de eenvoudigste en meest betrouwbare methode gebleken voor postdeprotectiezuivering van 5′-trifosforyleerde oligonucleotiden (figuur 3 en figuur 4). Preparatieve reverse-phase HPLC kan echter ook worden gebruikt om trifosforyleerde producten te zuiveren. De aanwezigheid van 5′-difosfaat en, in mindere mate, 5′-monofosfaatproducten wordt routinematig waargenomen bij het verifiëren van trifosforylering door massaspectrometrie. We hebben 5′-trifosfaatfragmentatie waargenomen tijdens massaspectrometrie van zeer zuiver materiaal bereid door chemische synthese of transcriptie, vooral als het instrument niet is geoptimaliseerd voor analyse van oligonucleotiden. Niettemin toont RP-LC-analyse vaak aan dat 10% -20% van het 5′-difosfaatbijproduct aanwezig is in langere 5′-trifosforyleerde oligonucleotiden (figuur 4). Commerciële preparaten van tributylammoniumpyrofosfaat kunnen worden verontreinigd met maar liefst 20% monofosfaat, dat 5′-difosfaat als bijproduct oplevert tijdens trifosforylering30,31. Een zorgvuldige voorbereiding van dit reagens in eigen huis kan veel meer zuivere TBAP-voorraden opleveren31. We hebben echter aangetoond dat oligonucleotiden trifosforyllated met behulp van commerciële bronnen van TBAP nog steeds een vergelijkbare of grotere reactiviteit vertonen wanneer ze worden gebruikt als substraten in enzymatische reacties (figuur 5B), vergeleken met materiaal bereid door in vitro transcriptie.

Een opmerkelijk verder gebruik van oligonucleotide trifosforylering met het Ludwig-Eckstein-reagens maakt gebruik van het cyclische trimetafosfiet-intermediair33. Als de daaropvolgende oxidatiestap wordt uitgevoerd met 1 M t-butylperoxide in hexanen, dat vaak wordt gebruikt voor oligonucleotide-oxidatie onder watervrije omstandigheden, treedt oxidatie van het fosfiet op zonder ringopeningshydrolyse, waardoor het cyclische trimetafosfaat ontstaat. Dit tussenproduct kan vervolgens worden gereageerd met primaire amine- of alcoholnucleofielen om 5′-trifosfaten te produceren met modificaties aan de γ-fosfaat. Deze modificaties omvatten de toevoeging van een lipofiele tag gekoppeld door een fosforamidaatbinding, die snelle trifosfaatspecifieke zuivering door RP-LC mogelijk maakt, gevolgd door zure hydrolyse van de tag uit het trifosfaat33. Fluorescerende modificaties op de γ-fosfaatpositie kunnen ook worden geïntroduceerd voor gebruik als real-time fluorescerende melders voor ribozym-gekatalyseerde ligatiereacties15,33.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs zijn Greg Springsteen, Natasha Paul, Charles Olea, Jr., Jonathan Sczepanski en Katrina Tjhung dankbaar voor nuttige discussies over best practices voor chemische trifosforyleringsreacties en Gerald Joyce voor nuttige opmerkingen. Dit werk werd ondersteund door subsidie MCB 2114588 van de National Science Foundation.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 µm polyethersulfone syringe filterMilliporeSigmaSLMP025SSSyringe filter voor het verwijderen van vermalen polyacrylamidegeldeeltjes (Sectie 5)
0.22 µm PTFE syringe filterMilliporeSigmaSLLG013SLSyringe filter voor het verwijderen van CPG-hars (Sectie 5)
1 mL plastic syringesThermoFisher Scientific14-823-434 (BD 309659)Componenten van trifosforyleringsapparaat (secties 2–4)
1,4-Dioxaan, watervrijMilliporeSigma296309Trifosforyleringsoplosmiddel (secties 2–4)
2-Chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on, Salicylfosforochloridite (SalPCl)MilliporeSigma324124Trifosforyleringsreagens (secties 2–4)
30 mL glazen flessenMilliporeSigma23232Flessen voor het bereiden van trifosforyleringsoplosmiddelen en TBAP-oplossing (sectie 2)
3-weg stopcock, polycarbonaat/polypropyleenBio-Rad Laboratories7328103Component van trifosforyleringsapparaat (secties 2–4)
40% acrylamide/bis-acrylamide-oplossing, 19:1Bio-Rad Laboratories1610144Voor PAGE (secties 5–7)
Acetonitril, watervrij, 100 mLGlen Research40-4050-50Trifosforyleringsoplosmiddel (secties 2–4)
Ammoniak-neutraliserende valThermoFisher ScientificANT100 en ANS121Voor gebruik met Speedvac DNA130 (sectie 5)
Ammoniumpersulfaat (APS)Bio-Rad Laboratories1610700Voor PAGE, katalysator voor acrylamidepolymerisatie (secties 5–7)
Aqueuze ammoniak, 28%MilliporeSigma338818Voor het bereiden van AMA deprotectiereagens (sectie 5)
Aqueuze methylamine, 40%TCI AmericaTCI-M0137Voor het bereiden van AMA deprotectiereagens (sectie 5)
Geautomatiseerde DNA/RNA-oligonucleôtidesynthesizerPerSeptive BiosystemsExpedite 8909 DNA/RNA Synthesizerelke op kolom gebaseerde synthesizer is acceptabel (sectie 1)
Magneet voor parelkettingThermoFisher Scientific12320DVoor streptavidin parelketting (sectie 7)
BromofenolblauwBio-Rad Laboratories1610404Voor PAGE ureumlaadbuffer (sectie 5)
Diepe vacuümoliepompThermoFisher ScientificVLP200-115Voor gebruik met lyofilisator (sectie 5)
Drierite droogmiddel, 10-20 meshMilliporeSigma737828Droogmiddel voor het opslaan van trifosforyleringschemie en apparatuur (secties 1–2)
D-RNA 27.3t cross-chirale polymerasebereid in huis185′-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3′Voor cross-chirale ribozymereacties (sectie 7)
D-RNA CPG vaste dragers, 1.000Å, voorverpakt 1 µmol synthesekolomGlen Research20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41Erepresentatief, voor D-RNA oligonuc-leotidesynthese (sectie 1)
D-RNA TOM-beschermde fosforamidenChemGenesANP-3201, 3202, 3203, 3205representatief, voor D-RNA oligonuc-leotidesynthese (sectie 1)
Lege Expedite-synthesekolommen, 1µmGlen Research20-0021-01Synthesekolommen voor gebruik met Expedite DNA/RNA synthesizer (sectie 1)
EPPS, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(3-propaansulfonzuur), vastMilliporeSigmaE1894Ribozymreactiebuffercomponent (sectie 6)
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), vastMilliporeSigmaEDSChelator voor tweewaardige metaalionen voor gebruik in verschillende buffers (secties 5–7)
Filters voor Expedite-synthesekolommenGlen Research20-0021-0FExpedite-stijl synthesekolomfilters, voor gebruik met lege synthesekolom (sectie 1)
Fluorescente/fosforescente gelscannerCytivaAmersham Typhoon RGB, 29187193Voor het visualiseren van analytische PAGE (secties 6–7)
Formamide, gedeïoniseerdVWR Life Science97062Voor PAGE formamide gel laadbuffer (secties 6–7)
GelbeeldkwantificeringssoftwareCytivaImageQuant TLVoor het kwantificeren van gescande gelbeelden (sectie 6)
Glazen droogkastMilliporeSigmaCLS3121150Opslag van trifosforyleringsoplosmiddelen (sectie 2)
L-RNA CPG vaste dragers, 1.000Å, bulkChemGenesN-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10L-RNA oligonuc-leotidesynthese (sectie 1)
L-RNA hammerhead-templatebereid in huis185′-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3′Voor cross-chirale ribozymereacties (sectie 7)
L-RNA primerbereid in huis185′-fluoresceine-GGCUCGA-3′Voor cross-chirale ribozymereacties (sectie 7)
L-RNA TOM-beschermde fosforamidenChemGenesOP ANP-5201, 5202, 5203, 5205L-

Referenties

  1. Shuman, S. What messenger RNA capping tells us about eukaryotic evolution. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (8), 619-625 (2002).
  2. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  3. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  4. Myong, S., et al. Cytosolic viral sensor RIG-I is a 5'-triphosphate-dependent translocase on double-stranded RNA. Science. 323 (5917), 1070-1074 (2009).
  5. Takeuchi, O., Akira, S. Pattern recognition receptors and inflammation. Cell. 140, 805-820 (2010).
  6. Wang, Y., et al. Structural and functional insights into 5'-ppp RNA pattern recognition by the innate immune receptor RIG-I. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 781-787 (2010).
  7. Goubau, D., et al. Antiviral immunity via RIG-I-mediated recognition of RNA bearing 5'-diphosphates. Nature. 514 (7522), 372-375 (2014).
  8. Joyce, G. F. Forty years of in vitro evolution. Angewandte Chemie. 46 (34), 6420-6436 (2007).
  9. Robertson, M. P., Ellington, A. D. In vitro selection of an allosteric ribozyme that transduces analytes to amplicons. Nature Biotechnology. 17 (1), 62-66 (1999).
  10. Robertson, M. P., Hesselberth, J. R., Ellington, A. D. Optimization and optimality of a short ribozyme ligase that joins non-Watson-Crick base pairings. RNA. 7 (4), 513-523 (2001).
  11. Hesselberth, J. R., Robertson, M. P., Knudsen, S. M., Ellington, A. D. Simultaneous detection of diverse analytes with an aptazyme ligase array. Analytical Biochemistry. 312 (2), 106-112 (2003).
  12. Lam, B. J., Joyce, G. F. Autocatalytic aptazymes enable ligand-dependent exponential amplification of RNA. Nature Biotechnology. 27 (3), 288-292 (2009).
  13. Lam, B. J., Joyce, G. F. An isothermal system that couples ligand-dependent catalysis to ligand-independent exponential amplification. Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 3191-3197 (2011).
  14. Olea, C., Horning, D. P., Joyce, G. F. Ligand-dependent exponential amplification of a self-replicating L-RNA enzyme. Journal of the American Chemical Society. 134 (19), 8050-8053 (2012).
  15. Olea, C., Joyce, G. F. Real-Time Detection of a Self-Replicating RNA Enzyme. Molecules. 21 (10), (2016).
  16. Sczepanski, J. T., Joyce, G. F. A cross-chiral RNA polymerase ribozyme. Nature. 515 (7527), 440-442 (2014).
  17. Tjhung, K. F., Sczepanski, J. T., Murtfeldt, E. R., Joyce, G. F. RNA-catalyzed cross-chiral polymerization of RNA. Journal of the American Chemical Society. 142 (36), 15331-15339 (2020).
  18. Bare, G. A. L., Joyce, G. F. Cross-chiral, RNA-catalyzed exponential amplification of RNA. Journal of the American Chemical Society. 143 (45), 19160-19166 (2021).
  19. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15 (21), 8783-8798 (1987).
  20. Chelliserrykattil, J., Ellington, A. D. Evolution of a T7 RNA polymerase variant that transcribes 2'-O-methyl RNA. Nature Biotechnology. 22 (9), 1155-1160 (2004).
  21. Ibach, J., et al. Identification of a T7 RNA polymerase variant that permits the enzymatic synthesis of fully 2′-O-methyl-modified RNA. Journal of Biotechnology. 167 (3), 287-295 (2013).
  22. Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).
  23. Pleiss, J. A., Derrick, M. L., Uhlenbeck, O. C. T7 RNA polymerase produces 5' end heterogeneity during in vitro transcription from certain templates. RNA. 4 (10), 1313-1317 (1998).
  24. Schenborn, E. T., Mierendorf, R. C. A novel transcription property of SP6 and T7 RNA polymerases: dependence on template structure. Nucleic Acids Research. 13 (17), 6223-6236 (1985).
  25. Martin, C. T., Muller, D. K., Coleman, J. E. Processivity in early stages of transcription by T7 RNA polymerase. Biochemistry. 27 (11), 3966-3974 (1988).
  26. Gholamalipour, Y., Karunanayake Mudiyanselage, A., Martin, C. T. 3' end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive and diverse in character-RNA-Seq analyses. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9253-9263 (2018).
  27. Vasilyev, N., Serganov, A. Preparation of short 5′-triphosphorylated oligoribonucleotides for crystallographic and biochemical studies. Nucleic Acid Crystallography: Methods and Protocols. , 11-20 (2016).
  28. Lebedev, A. V., Koukhareva, I. I., Beck, T., Vaghefi, M. M. Preparation of oligodeoxynucleotide 5'-triphosphates using solid support approach. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 20 (4-7), 1403-1409 (2001).
  29. Paul, N., Springsteen, G., Joyce, G. F. Conversion of a ribozyme to a deoxyribozyme through in vitro evolution. Chemistry & Biology. 13 (3), 329-338 (2006).
  30. Zlatev, I., et al. Efficient solid-phase chemical synthesis of 5'-triphosphates of DNA, RNA, and their analogues. Organic Letters. 12 (10), 2190-2193 (2010).
  31. Zlatev, I., Manoharan, M., Vasseur, J. -J., Morvan, F. Solid-phase chemical synthesis of 5'-triphosphate DNA, RNA, and chemically modified oligonucleotides. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , Chapter 1, Unit1.28 (2012).
  32. Zlatev, I., et al. Automated parallel synthesis of 5'-triphosphate oligonucleotides and preparation of chemically modified 5'-triphosphate small interfering RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (3), 722-732 (2013).
  33. Goldeck, M., Tuschl, T., Hartmann, G., Ludwig, J. Efficient solid-phase synthesis of pppRNA by using product-specific labeling. Angewandte Chemie. 53 (18), 4694-4698 (2014).
  34. Sarac, I., Meier, C. Efficient automated solid-phase synthesis of DNA and RNA 5′-triphosphates. Chemistry-A European Journal. 21 (46), 16421-16426 (2015).
  35. Sarac, I., Meier, C. Solid-phase synthesis of DNA and RNA 5'-O-triphosphates using cycloSal chemistry. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 64 (1), 4-67 (2016).
  36. Perez, J. T., et al. Influenza A virus-generated small RNAs regulate the switch from transcription to replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11525-11530 (2010).
  37. Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5'-0-(1-thiotriphosphates), 5'-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. The Journal of Organic Chemistry. 54 (3), 631-635 (1989).
  38. Gaur, R. K., Sproat, B. S., Krupp, G. Novel solid phase synthesis of 2'-o-methylribonucleoside 5'-triphosphates and their α-thio analogues. Tetrahedron Letters. 33 (23), 3301-3304 (1992).
  39. Reddy, M. P., Hanna, N. B., Farooqui, F. Fast cleavage and deprotection of oligonucleotides. Tetrahedron Letters. 35 (25), 4311-4314 (1994).
  40. Hogrefe, R. I., McCaffrey, A. P., Borozdina, L. U., McCampbell, E. S., Vaghefi, M. M. Effect of excess water on the desilylation of oligoribonucleotides using tetrabutylammonium fluoride. Nucleic Acids Research. 21 (20), 4739-4741 (1993).
  41. Pitsch, S., Weiss, P. A., Jenny, L., Stutz, A., Wu, X. Reliable chemical synthesis of oligoribonucleotides (RNA) with 2′-O-[(Triisopropylsilyl)oxy]methyl(2′-O-tom)-protected phosphoramidites. Helvetica Chimica Acta. 84 (12), 3773-3795 (2001).
  42. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), (2019).
  43. Paul, N., Joyce, G. F. A self-replicating ligase ribozyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12733-12740 (2002).
  44. Lincoln, T. A., Joyce, G. F. Self-sustained replication of an RNA enzyme. Science. 323 (5918), 1229-1232 (2009).
  45. Robertson, M. P., Joyce, G. F. Highly efficient self-replicating RNA enzymes. Chemistry & Biology. 21 (2), 238-245 (2014).
  46. Singh, J., et al. Synthesis of modified nucleoside oligophosphates simplified: fast, pure, and protecting group free. Journal of the American Chemical Society. 141 (38), 15013-15017 (2019).
  47. Bellon, L. Oligoribonucleotides with 2'-O-(tert-butyldimethylsilyl) groups. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , Chapter 3., Unit 3.6 (2001).

Herprints en machtigingen

Tags

Oligonucleotide trifosfaten5 trifosfaatvaste fase synthesesalicylfosforchloridietpyrofosfaatreactieL RNA synthesegelzuiveringpolyacrylamidegelelektroforeseRNA polymerisatie
Chemische trifosforylering van oligonucleotiden
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.