Methodenartikel

Een wrijvingstest-bioreactorapparaat voor de studie van synoviale gewrichtsbiomechanica, mechanobiologie en fysische regulatie

DOI:

10.3791/63880

⸱

2 juni 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Mechanical Engineering, Columbia University, 3Department of Orthopedic Surgery, Columbia University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft een wrijvingstestapparaat dat gelijktijdige wederzijdse glij- en normale belasting toepast op twee contacterende biologische tegenfronten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij primaire artrose (OA) remt normale 'slijtage' geassocieerd met veroudering het vermogen van kraakbeen om zijn dragende en smerende functies te behouden, waardoor een schadelijke fysieke omgeving wordt bevorderd. De wrijvingsinteracties van gewrichtskraakbeen en synovium kunnen de cohomeostase beïnvloeden door slijtage op weefselniveau en cellulaire mechanotransductie. Om deze mechanische en mechanobiologische processen te bestuderen, wordt een apparaat beschreven dat in staat is om de beweging van het gewricht te repliceren. Het wrijvingstestapparaat regelt de levering van wederzijdse translatiebeweging en normale belasting naar twee contacterende biologische tegenvlakken. Deze studie hanteert een synovium-op-kraakbeenconfiguratie en wrijvingscoëfficiëntmetingen worden gepresenteerd voor tests die worden uitgevoerd in een fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) of synoviale vloeistof (SF) bad. De tests werden uitgevoerd voor een reeks contactspanningen, waarbij de smerende eigenschappen van SF onder hoge belastingen werden benadrukt. Dit wrijvingstestapparaat kan worden gebruikt als een biomimetische bioreactor voor het bestuderen van de fysieke regulatie van levende gewrichtsweefsels als reactie op toegepaste fysiologische belasting geassocieerd met diarthrodiale gewrichtsarticulatie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artrose (OA) is een slopende, degeneratieve gewrichtsziekte die meer dan 32 miljoen Amerikaanse volwassenen treft, met een gezondheidszorg en sociaaleconomische kosten van meer dan $ 16,5 miljard1. De ziekte is klassiek gekenmerkt door de afbraak van gewrichtskraakbeen en subchondraal bot; veranderingen in het synovium hebben echter onlangs waardering gekregen omdat synovitis is gekoppeld aan OA-symptomen en progressie 2,3,4. Bij primaire (idiopathische) artrose remt normale 'slijtage' geassocieerd met veroudering het vermogen van kraakbeen om zijn dragende en smeerfuncties te behouden. Het is aangetoond dat de spanningen die worden gegenereerd door langdurig glijdend contact van gewrichtskraakbeenlagen of glijdend contact van kraakbeen tegen implantaatmaterialen delaminatieslijtage door ondergronds vermoeiingsfalen vergemakkelijken 5,6. Aangezien er een dynamische mechanische omgeving bestaat binnen het gewricht 7,8, kunnen de wrijvingsinteracties van gewrichtskraakbeen en synovium de gewrichtshomeostase beïnvloeden door slijtage op weefselniveau en cellulaire mechanotransductie. Om deze mechanische en mechanobiologische processen te bestuderen, is een apparaat ontworpen om de beweging van het gewricht te repliceren met strakke controle over druk- en wrijvingsbelasting 5,6,9,10,11,12,13.

Het huidige protocol beschrijft een wrijvingstestapparaat dat wederzijdse, translatie- en drukbelasting levert naar contactoppervlakken van levende weefselexplantaten. Het computergestuurde apparaat maakt het mogelijk om de gebruiker de duur van elke test, de toegepaste belasting, het bewegingsbereik van de vertaalfase en de vertaalsnelheid te regelen. Het apparaat is modulair, waardoor verschillende tegenfronten kunnen worden getest, zoals weefsel-op-weefsel (kraakbeen-op-kraakbeen en synovium-op-kraakbeen) en weefsel-op-glas. Naast de functionele metingen die door de tester worden verkregen, kunnen weefsel- en smeerbadcomponenten voor en na het testen worden beoordeeld om de biologische veranderingen te evalueren die door een bepaald experimenteel regime worden aangebracht.

Studies van kraakbeentribologie worden al tientallen jaren uitgevoerd en er zijn verschillende technieken ontwikkeld om wrijvingscoëfficiënten tussen kraakbeen en glas en kraakbeen op kraakbeen te meten 14,15. De verschillende benaderingen worden gemotiveerd door het gewricht en/of het smeermechanisme van belang. Er is vaak een afweging tussen de controle van experimentele variabelen en de recapitulatie van fysiologische parameters. Slingerachtige apparaten gebruiken intacte gewrichten als het steunpunt van een eenvoudige slinger waarbij één gewrichtsoppervlak zich vrij vertaalt over het tweede oppervlak 14,16,17,18. In plaats van intacte verbindingen te gebruiken, kunnen wrijvingsmetingen worden verkregen door kraakbeenexplantaten over de gewenste oppervlakken 14,19,20,21,22,23,24,25 te schuiven. De gerapporteerde wrijvingscoëfficiënten van gewrichtskraakbeen varieerden over een breed bereik (van 0,002 tot 0,5), afhankelijk van de bedrijfsomstandigheden 14,26. Er zijn apparaten gemaakt om roterende beweging 23,27,28 te repliceren. Gleghorn et al.26 ontwikkelden een multi-well aangepaste tribometer om kraakbeensmeerprofielen te observeren met behulp van Stribeck-curveanalyse, en een lineaire oscillerende glijbeweging werd toegepast tussen kraakbeen tegen een vlak glazen tegenvlak.

Dit apparaat is bedoeld om wrijvingsreacties te isoleren en de mechanobiologie van levende weefsels onder verschillende belastingsomstandigheden te onderzoeken. Het apparaat maakt gebruik van een vereenvoudigde testopstelling die gewrichtssticulatie simuleert door middel van drukbewegingen, die zowel de rol- als de glijdende beweging kan benaderen, met dien verstande dat de weerstand bij zuivere rollende beweging verwaarloosbaar is ten opzichte van de gemeten wrijvingscoëfficiënt van gewrichtskraakbeen29. Oorspronkelijk gebouwd om de effecten van interstitiële vloeistofdruk op de wrijvingsrespons van gewrichtskraakbeen9 te bestuderen, is de tester sindsdien gebruikt om onderwerpen te onderzoeken zoals wrijvingseffecten van het verwijderen van de oppervlakkige zone van kraakbeen10, smeereffecten van synoviale vloeistof11, kraakbeenslijtagehypothesen 5,6,30 en synovium-op-weefsel wrijvingsmetingen13 . De wrijvingstestbioreactor kan wrijvingsexperimenten uitvoeren onder steriele omstandigheden en biedt een nieuw mechanisme om te onderzoeken hoe wrijvingskrachten de mechanobiologische reacties van levend kraakbeen en synovium beïnvloeden. Dit ontwerp kan worden gebruikt als een biomimetische bioreactor om de fysieke regulatie van levende gewrichtsweefsels te bestuderen als reactie op de toegepaste fysiologische belasting geassocieerd met diarthrodiale gewrichts articulatie.

Deze studie presenteert een configuratie voor synovium-op-kraakbeen wrijvingstesten over een reeks contactspanningen en in verschillende smeerbaden. Het scharnierende oppervlak van de meeste gewrichten is voor een groot deel synoviaal weefsel31. Hoewel synovium-op-kraakbeenglijden niet optreedt op primaire dragende oppervlakken, kunnen de wrijvingsinteracties tussen de twee weefsels nog steeds belangrijke implicaties hebben voor herstel op weefselniveau en celmechanotransductie. Eerder is aangetoond dat fibroblastachtige synoviocyten (FLS) die zich op de intimale laag van het synovium bevinden, mechanosensitief zijn en reageren op door vloeistof geïnduceerde schuifspanning32. Het is ook aangetoond dat stretch33,34 en vloeistof-geïnduceerde schuifspanning35 de fls-smeermiddelproductie moduleren. Als zodanig kan direct glijdend contact tussen synovium en kraakbeen een andere mechanische stimulus geven aan residente cellen in het synovium.

Slechts enkele rapporten over synoviumfrictiecoëfficiënten zijn gepubliceerd 31,36. Estell et al.13 probeerden de eerdere karakterisering uit te breiden door gebruik te maken van biologisch relevante tegenwoorden. Met het vermogen van het wrijvingstestapparaat om levende weefsels te testen, is het mogelijk om fysiologische weefselinteracties na te bootsen tijdens gewrichts articulatie om de rol van contactschuifspanning op de synoviocytenfunctie en de bijdrage ervan aan de kruisverwijzing tussen synovium en kraakbeen op te helderen. De laatste is betrokken bij het bemiddelen van synoviale gewrichtsontsteking bij artritis en post-letsel. Vanwege de fysieke nabijheid van kraakbeen tot synovium en synoviale vloeistof, die synoviocyten bevatten die multipotente capaciteit vertonen, waaronder chondrogenese, wordt gepostuleerd dat synoviocyten een rol spelen bij kraakbeenhomeostase en -reparatie door enten op het gewrichtsoppervlak. In deze context kan fysiek contact en wederkerig scheren van kraakbeen-synovium en synovium-synovium de toegankelijkheid van synoviocyten tot regio's met kraakbeenschade vergroten 37,38,39,40. Studies met behulp van synovium-op-kraakbeenconfiguraties zullen niet alleen inzicht geven in de mechanica en tribologie van gewrichtsweefsel, maar ze kunnen ook leiden tot nieuwe strategieën voor het behoud van de gezondheid van de gewrichten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor dit onderzoek werden juveniele runderkniegewrichten, verkregen uit een lokaal slachthuis, gebruikt. Studies met dergelijke monsters van rundermonsters zijn vrijgesteld van Columbia Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Het ontwerpen van het wrijvingstestapparaat

OPMERKING: Een schematische weergave van de wrijvingstestinrichting is weergegeven in figuur 1. Het apparaat is gebouwd op een stijve basisplaat (niet getoond), die dient als een platform voor structurele ondersteuning.

  1. Bevestig een stappenmotor aan de horizontale translatiefase (zie Materiaaltabel), waardoor een tweeassige wrijvingstestapparaat ontstaat dat wederzijdse translatiebeweging levert naar contactoppervlakken.
  2. Monteer een multiaxiale loadcel in de vertaalfase (zie Materiaaltabel). De gemonteerde loadcel wordt gebruikt om de normale belasting in de z-richting (Fn) en de tangentiële belasting in de x-richting (F t) temeten.
  3. Rust de vertaalfase uit met een lineaire encoder (zie Materiaaltabel) om de horizontale verplaatsing (ux) van de fase vast te leggen. Rust verder de laadfase uit met een lineaire encoder (zie Materiaaltabel) om de verticale verplaatsing (uz) van de plaat vast te leggen.
    OPMERKING: De encoder van de vertaalfase registreert de relatieve tangentiële verplaatsing van de contactoppervlakken en deze informatie wordt gebruikt om het begin van elke nieuwe cyclus van heen en weer bewegend glijden te detecteren.
  4. Configureer de laadplaat (bovenste contactoppervlak) als een glas-, kraakbeen- of synovium-tegenvlak. Verbind de plaat met de laadtrap via een steunstang met draad.
  5. Bevestig een tweedelige magnetische basis aan de bovenkant van de loadcel (zie Materiaaltabel): (1) een vaste basis die permanent aan de loadcel is bevestigd en (2) een verwijderbare basis die magnetisch verbinding maakt met de vaste basis. Zorg ervoor dat de twee delen een nauwe verbinding vormen.
    OPMERKING: De verwijderbare basis houdt het translaterende tegenblad (onderste contactoppervlak) vast.
  6. Schrijf een normale belasting voor. Gebruik dood gewicht gemonteerd op lineaire lagers boven de laadplaat en steunstang. U kunt ook een belasting opgeven met behulp van de spreekspoelactuator (zie Tabel met materialen), die het onderste contactoppervlak dynamisch kan belasten41.
  7. Plaats het apparaat in een acrylbehuizing met aluminium frame (zie Materiaaltabel) om de omgeving te beschermen tegen verontreiniging.
    OPMERKING: Een aangepast LabVIEW-programma bestuurt het apparaat (zie Aanvullende coderingsbestanden) met gebruikerscontrole over de duur van elke test, evenals het reispad van de fase, versnelling (verandering van richting) en snelheid. De normale kracht, tangentiële kracht, stadiumverplaatsing en kruipverplaatsing worden gedurende de hele test bewaakt met hardware en software voor gegevensverzameling (zie Materiaaltabel).

2. Voorbereiding en montage van het monster

  1. Bereid je voor op een steriele weefseloogst volgens de onderstaande stappen.
    OPMERKING: Als een steriele oogst niet gewenst is, gaat u verder met stap 2.2.
    1. Steriliseer metalen gereedschappen in een autoclaaf. Spuit voeghouders met 70% ethanol en plaats ze in de biologische veiligheidskast (BSC). Sluit de kast voor één ultraviolette (UV) cyclus.
    2. Haal de gereedschappen uit de autoclaaf. Plaats de gereedschappen, betadine, steriele scalpelmesjes en bekers met 70% ethanol in de BSC.
    3. Open in de BSC de gereedschappen en plaats ze in 70% ethanolbekers. Bevestig de scalpelmesjes aan scalpelhandvatten.
    4. Bereid de joint voor op de oogst. Spuit de buitenkant van de verbinding in met 70% ethanol en wikkel gedurende 30 minuten in aluminiumfolie. Zorg ervoor dat u het gewrichtskapsel niet breekt.
      OPMERKING: De juveniele runderkniegewrichten werden ontvangen met het dijbeen en het scheenbeen ongeveer 15 cm beter en inferieur aan het gewricht om een intact kapsel te garanderen.
    5. Plaats na 30 min de ingepakte verbinding in de BSC. Open de folie en bevestig de verbinding aan de houder. Bedek het gewricht met betadine door het betadine voorzichtig over het gewrichtsoppervlak af te vegen.
      OPMERKING: Raadpleeg stap 2.2 en stap 2.3 voor respectievelijk synoviumspecifieke instructies en kraakbeenspecifieke instructies.
  2. Oogst het juveniele rundersyovium volgens de onderstaande stappen.
    1. Bevestig het tibiofemorale gewrichtskapsel met behulp van een ringstandaard (zie Materiaaltabel) met de voorste zijde naar de dissector gericht. Gebruik een tang en een scalpelmes om de patellapees af te snijden met behulp van een horizontale incisie van 5-10 cm (afhankelijk van de gewrichtsgrootte) die superieur is aan het scheenbeen (figuur 2A).
    2. Houd de losgemaakte patellapees vast met een tang. Maak twee voorste tot achterste sneden in de vorm van een V (figuur 2B,C). Deze sneden moeten de patella bevrijden.
      OPMERKING: Als het gewricht begint te openen, moet u oppassen dat u de voorste kruisband (ACL), de achterste kruisband (PCL), het mediale collaterale ligament (MCL), het laterale collaterale ligament (LCL) en de meniscus niet doorsnijdt.
    3. Draai de patella achter de verbinding of verwijder deze volledig uit het gewricht. Verwijder voorzichtig het weefsel oppervlakkig naar het synoviale membraan aan de mediale en laterale zijden van het gewricht om het synovium bloot te leggen.
    4. Gebruik een scalpelmesje om de omtrek van het synoviumgebied van belang te traceren. Pak met behulp van een tang het ene uiteinde van het synovium vast en til voorzichtig op om het synovium distaal uit te rekken tot het onderliggende bot. Gebruik een scalpelmesje om het synovium uit het bot te verwijderen (figuur 2D,E).
    5. Plaats het weefsel in de juiste kweekmedia of testbadoplossing. De synovium explant kan worden gekweekt voor een gewenst experiment of worden gemonteerd en gebruikt voor testen.
      OPMERKING: Kweekmedia/testbadoplossingen kunnen variëren op basis van de voorkeur van een onderzoeksgroep. Voor de op maat gemaakte exemplaren die voor deze studie worden gebruikt, zie Materiaaltabel.
  3. Oogst het juveniele runderkraakbeen (femorale pluggen en tibiale strips).
    1. Scheid het dijbeen van het scheenbeen door de ACL, PCL, MCL en LCL af te snijden. Zorg ervoor dat u het femorale condyluskraakbeen niet snijdt of door de meniscus snijdt naar het tibiale plateau. Plaats de afgescheiden weefsels in hun respectieve houders voor dissectie (stap 2.3.2 voor dijbeen en stap 2.3.3 voor tibia).
    2. Zet het dijbeen vast met een ringstandaard. Gebruik een biopsiepons van de gewenste vorm en grootte om het instrument normaal naar het femorale condylusische gewrichtskraakbeenoppervlak te drijven totdat het bot is bereikt (figuur 3A).
      1. Maak de verbinding van de stekker met het bot los door de stoot van links naar rechts en van voren naar achteren te verplaatsen. Doe dit zonder de pons te verwijderen.
        OPMERKING: Krakende geluiden kunnen worden gehoord als het bot zich afscheidt van het kraakbeen.
      2. Verwijder de pons, en dus de plug, van het onderliggende bot (figuur 3B). Herhaal indien nodig de stappen 2.3.2, 2.3.2.1 en 2.3.2.2 voor de resterende onaangeroerde locaties op de condyaal.
        OPMERKING: Ter voorbereiding op het monteren van de femorale plug op een testbasis, moet de diepe kant van de plug mogelijk plat worden geschoren. Dit kan met een stanleymes of scalpel.
      3. Plaats het weefsel in de juiste kweekmedia of test de badoplossing. De femorale plug kan worden gekweekt voor een gewenst experiment of worden gemonteerd en gebruikt voor testen.
    3. Bevestig het scheenbeen in een verstelbare houder (zie Materiaaltabel). Verwijder de meniscus voorzichtig en vermijd contact met het kraakbeenoppervlak (figuur 4A).
      1. Gebruik aan de buitenranden van het tibiale plateau een stanleymes om loodrecht op het kraakbeen naar het bot te snijden. Snijd volledig door het kraakbeen om rechte randen/zijkanten te maken (figuur 4B). Begin met de snede op ongeveer 2 mm afstand van elke tibiale plateaurand en verwijder overtollig weefsel. Scoor de binnenranden van het kraakbeen (figuur 4C).
        OPMERKING: Op dit punt moet het bot zichtbaar zijn onder het kraakbeen aan de buitenranden van het tibiale plateau.
      2. Gebruik aan de buitenranden de stanleymes om een schone snede te maken op het grensvlak tussen het bot en kraakbeen (figuur 4D).
        OPMERKING: De snede moet evenwijdig zijn aan het kraakbeenoppervlak en ongeveer 5 mm naar binnen, diep genoeg om het kraakbeen en het bot te scheiden.
      3. Om de tibiale strip van het plateauoppervlak te verwijderen, plaatst u voorzichtig een platte schroevendraaier onder de in stap 2.3.3.2 gemaakte snede. Draai de schroevendraaier voorzichtig om het gewrichtskraakbeen los te maken van het subchondrale bot (figuur 4E).
        OPMERKING: Krakende geluiden kunnen worden gehoord als het bot zich afscheidt van het kraakbeen.
      4. Terwijl het monster loskomt, duwt u de schroevendraaier langzaam naar voren totdat de kraakbeenstrook loskomt van het bot. Duw de schroevendraaier in de richting van bot, niet in de richting van kraakbeen. Herhaal dit proces op meerdere locaties totdat het tibiale plateau articulaire kraakbeen volledig uit het onderliggende bot is verwijderd (figuur 4F).
      5. Snijd met behulp van een stanleymes het tibiale plateauoppervlak om rechthoekige monsters van de gewenste grootte en dikte te produceren.
        OPMERKING: Voor dit onderzoek zijn stroken van 10 mm x 30 mm gesneden, maar deze afmeting kan worden gevarieerd op basis van het gewenste experiment en de testopstelling.
      6. Plaats het weefsel in de juiste kweekmedia of test de badoplossing. De tibiale strip kan worden gekweekt voor een gewenst experiment of worden gemonteerd en gebruikt voor testen.
      7. Herhaal indien nodig stap 2.3.3.1-2.3.3.6 voor het tweede tibiale plateau.
  4. Monteer het synovium en het kraakbeen volgens de onderstaande stappen.
    1. Selecteer desgewenst een tibiaal stripmonster om te testen.
      OPMERKING: De strip kan worden getest als het onderste tegenblad.
      1. Verwijder de verwijderbare magnetische basis (zie Materiaaltabel) en lijm een petrischaal met een diameter van 60 mm op het bovenoppervlak van de verwijderbare basis.
      2. Terwijl de petrischaal op zijn plaats is gelijmd, bevestigt u de verwijderbare basis aan de vaste basis en markeert u de petrischaal om een glijrichting aan te geven.
      3. Breng een kleine hoeveelheid cyanoacrylaat (zie Tabel met materialen) aan op het midden van de schaal. Lijn de tibiale strip uit met de glijdende richting van het podium (zoals aangegeven door het merkteken op de petrischaal van punt 2.4.1.2). Druk de kraakbeenstrip voorzichtig op de schaal. Zorg ervoor dat u het kraakbeenoppervlak niet bekrast.
        OPMERKING: Een zuiggereedschap (zie Materiaaltabel) kan zachte druk uitoefenen op het kraakbeen zonder het te testen oppervlak te beschadigen.
      4. Herstel de verwijderbare magnetische basis (met bevestigde kraakbeenstrip) naar de gekoppelde magnetische vaste basis in de wrijvingstester. Vul de petrischaal met de gewenste testbadoplossing. De testbadoplossing moet het kraakbeen volledig bedekken.
    2. Selecteer desgewenst een femorale kraakbeenplug om te testen.
      OPMERKING: De stekker kan worden getest als het onderste of bovenste tegenblad.
      1. Als de femorale condylus wordt gebruikt als het onderste tegenblad, verwijdert u de verwijderbare magnetische basis en lijmt u een petrischaal met een diameter van 60 mm op het bovenoppervlak van de verwijderbare basis.
        1. Breng een kleine hoeveelheid cyanoacrylaat aan op het midden van de schaal. Druk de kraakbeenplug voorzichtig op de schaal.
          OPMERKING: Een zuiggereedschap kan zachte druk uitoefenen op het kraakbeen zonder het te testen oppervlak te beschadigen.
        2. Herstel de verwijderbare magnetische basis (met bevestigde kraakbeenstekker) naar de gekoppelde magnetische vaste basis in de wrijvingstester. Vul de petrischaal met de gewenste testbadoplossing. De testbadoplossing moet het kraakbeen volledig bedekken.
      2. Als het femorale kraakbeen wordt gebruikt als het bovenste tegenvlak, verwijdert u de laadplaat en steunstang uit de wrijvingstester. Verwijder indien nodig de bestaande plaat en selecteer een nieuwe plaat die geschikt is voor kraakbeenmontage.
        1. Breng een kleine hoeveelheid cyanoacrylaat aan op het plaatoppervlak. Druk de kraakbeenplug voorzichtig op de plaat.
          OPMERKING: Een zuiggereedschap kan zachte druk uitoefenen op het kraakbeen zonder het te testen oppervlak te beschadigen.
        2. Herstel de laadplaat (met bijgevoegde kraakbeenplug) en steunstang naar de wrijvingstester. Pas de verticale hoogte van de laadplaat zodanig aan dat de kraakbeenplug over het onderste tegenvlak zweeft en wordt ondergedompeld in het testbad. Voeg indien nodig meer testbadoplossing toe.
    3. Selecteer desgewenst het synoviummonster dat u wilt testen.
      OPMERKING: Het synovium kan worden getest als het onderste of bovenste tegenblad.
      1. Als het synovium als onderste tegenblad wordt gebruikt, verwijdert u de verwijderbare magnetische basis en lijmt u een petrischaal met een diameter van 60 mm op het bovenoppervlak van de verwijderbare basis.
        1. Lijm een op maat gemaakte ronde acryl-siliconenpaal van de gewenste diameter op het midden van de schaal.
        2. Plaats het synovium met behulp van een tang bovenop de paal. Om het synovium vast te zetten, spreidt u een O-ring (zie Materiaaltabel) over de omtrek.
        3. Trek met behulp van een tang voorzichtig aan het synovium om het aangeleerde weefsel uit te rekken en plat onder de O-ring. Trim overtollig weefsel met een chirurgische schaar.
        4. Herstel de verwijderbare magnetische basis (met synovium bevestigd) naar de gepaarde magnetische vaste basis in de wrijvingstester. Vul de petrischaal met de gewenste testbadoplossing. De testoplossing van het bad moet het synovium volledig bedekken.
      2. Als het synovium als bovenste tegenblad wordt gebruikt, verwijdert u de laadplaat en steunstaaf uit de wrijvingstester. Verwijder indien nodig de bestaande plaat en selecteer een nieuwe ronde plaat die geschikt is voor synoviummontage.
        1. Plaats het synovium met behulp van een tang op de ronde plaat. Om het synovium vast te zetten, spreidt u een O-ring over de omtrek.
        2. Trek met behulp van een tang voorzichtig aan het synovium om het aangeleerde weefsel uit te rekken en plat onder de O-ring. Trim overtollig weefsel met een chirurgische schaar.
        3. Herstel de laadplaat (met bijgevoegd synovium) en steunstaaf naar de wrijvingstester. Pas de verticale hoogte van de laadplaat zodanig aan dat het synovium over het onderste tegenvlak zweeft en wordt ondergedompeld in het testbad. Voeg indien nodig meer testbadoplossing toe.

3. Wrijvingstesten

OPMERKING: Voor deze tests worden een aangepast LabVIEW-programma en bijbehorende hardware (zie Aanvullende coderingsbestanden) gebruikt. Houd er rekening mee dat de aangepaste code is gebouwd op LabVIEW 2010 en is onderhouden op dezelfde oudere versie. Als gevolg hiervan is de code mogelijk niet voorwaarts compatibel met de meest recente versie van de software. De volgende knopaanvaringen en verwijzingen naar de gebruikersinterface zijn alleen relevant voor de aangepaste code. Als u met een andere softwareversie werkt, kan een vergelijkbaar aangepast programma worden geschreven door de code te wijzigen.

  1. Plaats de gemonteerde monsters (stap 2.4) in de wrijvingstester.
    OPMERKING: De monsters moeten worden ondergedompeld in de testbadoplossing, maar mogen niet met elkaar in contact komen.
  2. Open het softwareprogramma en schrijf testparameters voor: podiumsnelheid, podiumversnelling, reispad (afstand) en testduur (figuur 5).
    1. Open de drie vensters in het programma: Analog Data Build MFDAQ, Initialize Load PID en Trigger Dynamic Caller.
    2. Voer het venster Analog Data Build MFDAQ uit door op de knop Uitvoeren (witte pijl) te drukken.
    3. Voer het venster Pid laden initialiseren uit door op de knop Uitvoeren (witte pijl) te drukken.
    4. Navigeer naar het tabblad Stappen in het venster Dynamische beller activeren. Geef de versnelling, snelheid en afstand van de vertaalfase op in de invoervakken van de gebruiker.
      OPMERKING: De afstandswaarde stelt de slijtage-track halve lengte in. Met andere woorden, het werkgebied gaat van de opgegeven nullocatie (stap 3.5) naar de ingestelde afstandswaarde in zowel de positieve als de negatieve x-richting.
    5. Geef op het tabblad Stappen de duur van de test op door het bestandspad Stepper Time Index te selecteren. Klik op de knop Map openen rechtsonder in de tabel Tijdstatus en selecteer het bestand.
    6. Geef de duur van de test ook op het tabblad Spreekspoel op. Navigeer naar het tabblad Spreekspoel in het venster Dynamische beller activeren. Net als bij stap 3.2.5, selecteert u het Voice Coil Index-bestandspad door op de knop Map openen rechtsonder in de tabel Tijdstatus te klikken en selecteert u het bestand. De duur moet overeenkomen met die van het tabblad Stappenteller .
  3. Schrijf de normale belasting voor. Als u dode gewichten gebruikt, plaatst u de gewenste gewichten op de lineaire lagers boven de laadplaat. Zorg ervoor dat de uitgeoefende belasting plus het gewicht van de laadplaat en de steunstang de nominale capaciteit van de loadcel niet overschrijden.
  4. Selecteer het pad en de bestandsnaam voor gegevensopslag met de knop Map openen rechts van het vak Schrijven naar bestand?. Sla het bestand op met de extensie ".txt".
  5. Centreer het onderste tegenblad onder het bovenste tegenblad. Stel dit in als de nul x-positie.
    1. Voer het venster Dynamische beller activeren uit door op de knop Uitvoeren (witte pijl) te drukken. Klik op het tabblad Stappen op de knop Start om het werkgebied naar de laatst opgeslagen nul x-positie te verplaatsen.
    2. Als tegenlagen niet zijn uitgelijnd, verplaatst u het werkgebied door op de groene pijlknoppen links en rechts te klikken. Wanneer de gewenste locatie is bereikt, klikt u op de knop Nul om de huidige podiumlocatie op te slaan als de nieuwe nul x-positie. Stop het venster Trigger Dynamic Caller door op de knop Stoppen te klikken.
      OPMERKING: De locatie van het werkgebied kan alleen worden opgeslagen terwijl het venster Dynamische beller activeren wordt uitgevoerd, maar het werkgebied nog niet beweegt zoals opgegeven door het programma. Als u in stap 3.5.1 op de knop Uitvoeren (witte pijl) drukt, wordt een tijdsbestek van 15 s gestart voordat de fase begint te bewegen. Gebruik dit tijdsbestek van 15 s om het werkgebied te verplaatsen en de gewenste nullocatie op te slaan.
    3. Als de gewenste nul x-positie niet wordt verkregen bij de eerste poging, herhaalt u stap 3.5.1.
      OPMERKING: Het kan helpen om met tussenpozen op de Zero-knop te drukken om de podiumpositie op te slaan terwijl de gebruiker het onderste tegenblad onder het bovenste tegenblad beweegt. Houd er rekening mee dat als u op de thuisknop klikt, het werkgebied wordt verplaatst naar de laatste positie die is opgeslagen door de knop Nul .
  6. Zodra de bovenste en onderste tegenfronten zijn gecentreerd, start u wrijvingstests van de monsters door de cyclische beweging van het podium te starten. Hiertoe voert u het venster Dynamische beller activeren uit door op de knop Uitvoeren (witte pijl) te drukken.
  7. Zodra het podium beweegt, brengt u het bovenste tegenblad langzaam in contact met de onderkant.
    OPMERKING: De toegepaste belastingswaarde kan worden bevestigd door de Fz real-time plot in het softwarevenster te bekijken (figuur 5A).
  8. Laat de test lopen en verzamel de wrijvingstestgegevens.
    OPMERKING: Alle gegevens die tijdens stap 3.5 worden geregistreerd, worden overschreven. De real-time hysterese kan worden bekeken in het venster Trigger Dynamic Caller (Figuur 5C).
  9. Na de gewenste testduur stopt u de test door op de knop Stoppen te drukken en de monsters te lossen door het bovenste tegenblad op te tillen en uit contact met het onderste tegenvlak te halen.

4. Gegevensverwerking

OPMERKING: Een aangepast MATLAB-programma wordt gebruikt voor gegevensverwerking (zie Aanvullende coderingsbestanden). De code roept de uitvoerbestanden aan die zijn opgegeven door de aangepaste LabVIEW-code.

  1. Gebruik de aangepaste code om de wrijvingscoëfficiënt en de kruipverplaatsing (tijdsafhankelijke weefselvervorming) per cyclus te berekenen.
    1. Zorg ervoor dat alle relevante codes in dezelfde map worden opgeslagen: "frictioncycle_fun.m", "frictioncycle_Hysteresis_plot.m", "frictioncycle_MU_plot.m" en "frictioncycle_run.m".
      OPMERKING: Deze MATLAB-codes zijn geschreven om te worden gebruikt met de specifieke uitgangen van de bovengenoemde LabVIEW-code. Als de gebruiker zijn eigen code heeft gemaakt of wijzigingen heeft aangebracht in de code die hier wordt beschreven, moeten de MATLAB-scripts mogelijk worden bewerkt om aan die wijzigingen tegemoet te komen.
    2. Open het bestand frictioncycle_run.m. Klik op de knop Uitvoeren (groene pijl) in het script. Selecteer het onbewerkte gegevensbestand dat moet worden geanalyseerd en de gewenste MATLAB-uitvoeropslaglocatie.
      OPMERKING: De software kan enkele minuten nodig hebben om gegevens te verwerken, afhankelijk van de duur van de test.
  2. Voer desgewenst standaard weefselbeoordelingen en mediaanalyses uit op de geteste explantaten en aliquots van de testbadoplossing.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een synovium-op-kraakbeenconfiguratie werd gebruikt om juveniele runderexplantaten te wrijvingstesten. Het synovium werd gemonteerd op een acryllaadplaat met een diameter van 10 mm, zodat de intimale laag in contact zou komen met het onderliggende kraakbeen. Een tibiale strip werd gebruikt als kraakbeen tegengezicht (figuur 6A). Tibiale stroken werden gesneden met een diepte van ongeveer 1,4 mm en een afmeting van 10 mm x 30 mm. De monsters werden gedurende 1 uur bij 37 °C getest in een fosf...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er bestaat een dynamische mechanische omgeving in het gewricht, aangezien kraakbeen wordt blootgesteld aan druk-, trek- en schuifkrachten en hydrostatische en osmotische drukken44,45. Hoewel kraakbeen het belangrijkste dragende weefsel van het gewricht is, ondergaat het synovium ook wrijvingsinteracties met het kraakbeenoppervlak en met zichzelf in regio's waar het weefsel vouwt. De fysieke interacties tussen kraakbeen en synovium zijn waarschijnlijk verantwoorde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Orthopaedic Scientific Research Foundation, NIH 5R01 AR068133, NIH TERC 5P41EB027062 en NIGMS R01 692 GM083925 (Funder ID: 10.13039/100000057).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Aluminum foilReynolds Group HoldingsReynolds WrapSteriele weefseloogst
Aluminum-framed acrylic enclosureOp maat gemaaktFrictietester component
Autoclavable instant sealing sterilization pouchesFisherbrand01-812-54Sterilisatie van gereedschap
AutoclaveBuxtonSterilisatie van gereedschap
Beaker (250 mL)Pyrex Vista70000Weefseloogst
Betadine (Povidone Iodine Prep Solution)Medline Industries, LPMDS093906Steriele weefseloogst
Biological safety cabinetLabconcoPurifier Logic+ Class II, Type A2 BSCSteriele weefseloogst
Biospy punchSteritool Inc.50162Weefseloogst
Box cutterAmerican Safety Razor Company94-120-71Weefseloogst
Circular acrylic-sillicone post (synovium)Op maat gemaaktWeefselmontage
Culture mediaOp maat gemaaktDMEM (Cat No. 11-965-118; Gibco) aangevuld met 50 μg/mL L-proline (Cat. No. P5607; Sigma), 100 μg/mL natriumpyruvaat (Cat. No. S8636; Sigma), 1% ITS (Cat. No. 354350; Corning), en 1% antibiotic–antimycotic (Cat. No. 15-240-062, Gibco)
Cyanoacrylate (Loctite 420 Clear)Henkel135455Weefselmontage
Dead weightsOHAUSNormale belasting
Ethanol 200 proofDecon Labs, Inc.2701Verdunnen tot 70 %
Fixed baseThorLabs, Inc.SB1TFrictietester component
Forceps (synovium harvest)Fine Science Tools11019-12Weefseloogst
Forceps (synovium mounting)Excelta3C-S-PIWeefselmontage
Horizontal linear encoder (for translating stage)RSF Electronics, Inc.MSA 670.63Frictietester component; systeemresolutie van 1 µm
Hot glue gun and glueFPC CorporationSurebonder Pro 4000AWeefselmontage
LabVIEWNational Instruments CorporationLabVIEW  2010Frictietestprogramma
Load cellJR3 Inc.20E12A-M25BFrictietester component; 0,0019 lbs resolutie in x&y, 0,0038 lbs resolutie in z
Loading platenOp maat gemaaktWeefselmontage
O-ringParkerS1138AS568-009Weefselmontage
Petri dish (60 mm)Falcon351007Weefselmontage
PivotLok Work Positioner (tibia holder)Industry Depot, Pivot LokPL325Weefseloogst
Removable baseThorLabs, Inc.SB1BFrictietester component
Ring standWeefseloogst
Scalpel bladesHavel's Inc.FSC22Weefseloogst
Scalpel handleFEATHER Safety Razor Co., Ltd.No. 4Weefseloogst
ScrewdriverWera3334Weefseloogst
StageJMARFrictietester component
Stepper motorOriental Motor Co., Ltd.PK266-03BFrictietester component
Suction toolVirtual Industries, Inc.PEN-VAC Vacuum PenWeefselmontage
Support rodOp maat gemaaktWeefselmontage
Surgical scissorsFine Science Tools14061-09Weefselmontage
Synovial fluid (bovine)Animal Technologies, Inc.Frictietestbad
Testing bathOp maat gemaaktFosfaat-gebufferd zoutwater (PBS) met proteaseremmers: 0,04% isothiazolon-gebaseerde biocide (Proclin 950 Cat. No. 46878-U; Sigma) en 0,1% proteaseremmer - 0,05 M ethyleendiaminetetraazijnzuur, EDTA (Cat. No. 0369; Sigma)
Tissue culture incubatorFisher ScientificIsotempSteriele kweek
Vertical linear encoder (for loading stage)RenishawT1031-30AFrictietester component; 20 nm resolutie
Voice coil actuatorH2W TechnologiesNCC20-15-027-1RCFrictietester component

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. US Department of Health and Human Services. The Cost of Arthritis in US Adults. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/arthritis/data_statistics/cost.htm (2020).
  2. Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. Instructional course lectures, the American academy of orthopaedic surgeons - articular cartilage. Part II: degeneration and osteoarthrosis, repair, regeneration, and transplantation. JBJS. 79 (4), 612-632 (1997).
  3. Berenbaum, F. Osteoarthritis as an inflammatory disease (osteoarthritis is not osteoarthrosis). Osteoarthritis and Cartilage. 21 (1), 16-21 (2013).
  4. Sellam, J., Berenbaum, F. The role of synovitis in pathophysiology and clinical symptoms of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 6 (11), 625-635 (2010).
  5. Durney, K. M., et al. Immature bovine cartilage wear by fatigue failure and delamination. Journal of Biomechanics. 107, 109852(2020).
  6. Oungoulian, S. R., et al. Wear and damage of articular cartilage with friction against orthopedic implant materials. Journal of Biomechanics. 48 (10), 1957-1964 (2015).
  7. Ateshian, G. A. The role of interstitial fluid pressurization in articular cartilage lubrication. Journal of Biomechanics. 42 (9), 1163-1176 (2009).
  8. Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
  9. Krishnan, R., Kopacz, M., Ateshian, G. A. Experimental verification of the role of interstitial fluid pressurization in cartilage lubrication. Journal of Orthopaedic Research. 22 (3), 565-570 (2004).
  10. Krishnan, R., et al. Removal of the superficial zone of bovine articular cartilage does not increase its frictional coefficient. Osteoarthritis and Cartilage. 12 (12), 947-955 (2004).
  11. Caligaris, M., Ateshian, G. A. Effects of sustained interstitial fluid pressurization under migrating contact area, and boundary lubrication by synovial fluid, on cartilage friction. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (10), 1220-1227 (2008).
  12. Caligaris, M., Canal, C. E., Ahmad, C. S., Gardner, T. R., Ateshian, G. A. Investigation of the frictional response of osteoarthritic human tibiofemoral joints and the potential beneficial tribological effect of healthy synovial fluid. Osteoarthritis and Cartilage. 17 (10), 1327-1332 (2009).
  13. Estell, E. G., et al. Attachment of cartilage wear particles to the synovium negatively impacts friction properties. Journal of Biomechanics. 127, 110668(2021).
  14. Ateshian, G. A., Mow, V. C. Friction, lubrication, and wear of articular cartilage and diarthrodial joints. Basic Orthopaedic Biomechanics and Mechano-Biology. 3, 447-494 (2005).
  15. Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J. A century of cartilage tribology research is informing lubrication therapies. Journal of Biomechanical Engineering. 142 (3), 031004(2020).
  16. Unsworth, A., Dowson, D., Wright, V. Some new evidence on human joint lubrication. Annals of the Rheumatic Diseases. 34 (4), 277-285 (1975).
  17. Unsworth, A., Dowson, D., Wright, V. The frictional behavior of human synovial joints-part I: natural joints. Journal of Lubrication Technology. 97 (3), 369-376 (1975).
  18. Shirley Jones, E. Joint Lubrication. The Lancet. 227 (5879), 1043-1045 (1936).
  19. Ateshian, G. A., et al. The role of osmotic pressure and tension-compression nonlinearity in the frictional response of articular cartilage. Transport in Porous Media. 50 (1), 5-33 (2003).
  20. Forster, H., Fisher, J. The influence of loading time and lubricant on the friction of articular cartilage. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 210 (2), 109-119 (1996).
  21. McCutchen, C. W. The frictional properties of animal joints. Wear. 5 (1), 1-17 (1962).
  22. Pickard, J., Ingham, E., Egan, J., Fisher, J. Investigation into the effect of proteoglycan molecules on the tribological properties of cartilage joint tissues. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 212 (3), 177-182 (1998).
  23. Wang, H., Ateshian, G. A. The normal stress effect and equilibrium friction coefficient of articular cartilage under steady frictional shear. Journal of Biomechanics. 30 (8), 771-776 (1997).
  24. Walker, P. S., Dowson, D., Longfield, M. D., Wright, V. Boosted lubrication in synovial joints by fluid entrapment and enrichment. Annals of the Rheumatic Diseases. 27 (6), 512-520 (1968).
  25. Walker, P. S., Unsworth, A., Dowson, D., Sikorski, J., Wright, V. Mode of aggregation of hyaluronic acid protein complex on the surface of articular cartilage. Annals of the Rheumatic Diseases. 29 (6), 591-602 (1970).
  26. Gleghorn, J. P., Bonassar, L. J. Lubrication mode analysis of articular cartilage using Stribeck surfaces. Journal of Biomechanics. 41 (9), 1910-1918 (2008).
  27. Malcom, L. An experimental investigation of the frictional and deformational responses of articular cartilage interfaces to static and dynamic loading. , dissertation (1976).
  28. Schmidt, T. A., Sah, R. L. Effect of synovial fluid on boundary lubrication of articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (1), 35-47 (2007).
  29. Ateshian, G. A., Wang, H. Rolling resistance of articular cartilage due to interstitial fluid flow. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 211 (5), 419-424 (1997).
  30. Oungoulian, S. R., et al. Articular cartilage wear characterization with a particle sizing and counting analyzer. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (2), 0245011-0245014 (2013).
  31. Radin, E. L., Paul, I. L., Swann, D. A., Schottstaedt, E. S. Lubrication of synovial membrane. Annals of the Rheumatic Diseases. 30 (3), 322-325 (1971).
  32. Estell, E. G., et al. Fibroblast-like synoviocyte mechanosensitivity to fluid shear is modulated by Interleukin-1α. Journal of Biomechanics. 60, 91-99 (2017).
  33. Momberger, T. S., Levick, J. R., Mason, R. M. Hyaluronan secretion by synoviocytes is mechanosensitive. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 24 (8), 510-519 (2005).
  34. Momberger, T. S., Levick, J. R., Mason, R. M. Mechanosensitive synoviocytes: A Ca2+-PKCα-MAP kinase pathway contributes to stretch-induced hyaluronan synthesis in vitro. Matrix Biology. 25 (5), 306-316 (2006).
  35. Yanagida-Suekawa, T., et al. Synthesis of hyaluronan and superficial zone protein in synovial membrane cells modulated by fluid flow. European Journal of Oral Sciences. 121 (6), 566-572 (2013).
  36. Cooke, A. F., Dowson, D., Wright, V. Lubrication of synovial membrane. Annals of the Rheumatic Diseases. 35 (1), 56-59 (1976).
  37. Goldring, M. B., Berenbaum, F. Emerging targets in osteoarthritis therapy. Current Opinion in Pharmacology. 22, 51-63 (2015).
  38. Jones, E. A., et al. Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: Detection and functional evaluation at the single-cell level. Arthritis and Rheumatism. 58 (6), 1731-1740 (2008).
  39. Sampat, S. R., et al. Growth factor priming of synovium-derived stem cells for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 17 (17-18), 2259-2265 (2011).
  40. Kurth, T. B., et al. Functional mesenchymal stem cell niches in adult mouse knee joint synovium in vivo. Arthritis and Rheumatism. 63 (5), 1289-1300 (2011).
  41. Krishnan, R., Mariner, E. N., Ateshian, G. A. Effect of dynamic loading on the frictional response of bovine articular cartilage. Journal of Biomechanics. 38 (8), 1665-1673 (2005).
  42. Bonnevie, E. D., Baro, V., Wang, L., Burris, D. L. In-situ studies of cartilage microtribology: roles of speed and contact area. Tribology Letters. 41 (1), 83-95 (2011).
  43. Bian, L., et al. Dynamic mechanical loading enhances functional properties of tissue-engineered cartilage using mature canine chondrocytes. Tissue Engineering. Part A. 16 (5), 1781-1790 (2010).
  44. Mow, V. C., Wang, C. C., Hung, C. T. The extracellular matrix, interstitial fluid and ions as a mechanical signal transducer in articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 7 (1), 41-58 (1999).
  45. Wang, C. C. -B., et al. The functional environment of chondrocytes within cartilage subjected to compressive loading: a theoretical and experimental approach. Biorheology. 39 (1-2), 11-25 (2002).
  46. Carter, M. J., Basalo, I. M., Ateshian, G. A. The temporal response of the friction coefficient of articular cartilage depends on the contact area. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3257-3260 (2007).
  47. Jones, B. K., Durney, K. M., Hung, C. T., Ateshian, G. A. The friction coefficient of shoulder joints remains remarkably low over 24 h of loading. Journal of Biomechanics. 48 (14), 3945-3949 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Wrijtingstestapparaatmechanobiologie van kraakbeeninteractie tussen synovium en kraakbeenmeting van de wrijvingsco ffici ntgewrichtssmeringgewrichtskraakbeensynoviaal vloeistofbadtesten van weefselexplanten

Gerelateerde artikelen