Kweken en genetisch manipuleren van entomopathogene nematoden

Samenvatting

Entomopathogene nematoden leven in symbiose met bacteriën en samen infecteren ze met succes insecten door hun aangeboren immuunsysteem te ondermijnen. Om onderzoek naar de genetische basis van nematodeninfectie te bevorderen, worden methoden beschreven voor het handhaven en genetisch manipuleren van entomopathogene nematoden.

Samenvatting

Entomopathogene nematoden in de geslachten Heterorhabditis en Steinernema zijn obligate parasieten van insecten die in de bodem leven. Het belangrijkste kenmerk van hun levenscyclus is de mutualistische associatie met respectievelijk de bacteriën Photorhabdus en Xenorhabdus. De nematodenparasieten zijn in staat om geschikte insectengastheren te lokaliseren en binnen te dringen, de immuunrespons van insecten te ondermijnen en zich efficiënt te vermenigvuldigen om de volgende generatie te produceren die actief op nieuwe insectenjassen zal jagen om te infecteren. Vanwege de eigenschappen van hun levenscyclus zijn entomopathogene nematoden populaire biologische bestrijders, die in combinatie met insecticiden worden gebruikt om destructieve landbouwinsectenplagen te bestrijden. Tegelijkertijd vertegenwoordigen deze parasitaire nematoden een onderzoeksinstrument om de pathogeniteit van nematoden te analyseren en anti-nematoderesponsen te hosten. Dit onderzoek wordt geholpen door de recente ontwikkeling van genetische technieken en transcriptomische benaderingen voor het begrijpen van de rol van nematoden uitgescheiden moleculen tijdens infectie. Hier wordt een gedetailleerd protocol gegeven over het handhaven van entomopathogene nematoden en het gebruik van een gen knockdown-procedure. Deze methodologieën bevorderen verder de functionele karakterisering van entomopathogene nematodeninfectiefactoren.

Inleiding

Het onderzoek naar entomopathogene nematoden (EPN) is de afgelopen jaren geïntensiveerd, voornamelijk vanwege het nut van deze parasieten in geïntegreerde plaagbestrijdingsstrategieën en hun betrokkenheid bij fundamenteel biomedisch onderzoek ^1,2. Recente studies hebben EPN vastgesteld als modelorganismen om de genetische componenten van nematoden te onderzoeken die worden geactiveerd tijdens de verschillende stadia van het infectieproces. Deze informatie geeft kritische aanwijzingen over de aard en het aantal moleculen dat door de parasieten wordt uitgescheiden om de fysiologie van de gastheer te veranderen en de aangeboren immuunrespons van het insect te destabiliseren ^3,4. Tegelijkertijd wordt deze kennis vaak aangevuld met nieuwe details over het type immuunsignaleringsroutes van insectengasten en de functies die ze reguleren om de binnenkomst en verspreiding van de pathogenen te beperken ^5,6. Het begrijpen van deze processen is cruciaal voor het bedenken van beide zijden van het dynamische samenspel tussen EPN en hun insectengastheren. Een betere waardering van de gastheerrelatie tussen EPN en insecten zal ongetwijfeld vergelijkbare studies met parasitaire nematoden van zoogdieren vergemakkelijken, wat kan leiden tot de identificatie en karakterisering van infectiefactoren die interfereren met het menselijk immuunsysteem.

De EPN-nematoden Heterorhabditis sp. en Steinernema sp. kunnen een breed scala aan insecten infecteren en hun biologie is eerder intensief bestudeerd. De twee nematodenparasieten verschillen in hun voortplantingswijze, waarbij heterorhabditis zelfbevrucht is en Steinernema amphimictische reproductie ondergaat, hoewel onlangs S. hermafroditum zich heeft voortgeplant door zelfbevruchting van hermafrodieten of door parthenogenese ^7,8,9. Een ander verschil tussen Heterorhabditis en Steinernema-nematoden is hun symbiotische mutualisme met twee verschillende geslachten van Gram-negatieve bacteriën, respectievelijk Photorhabdus en Xenorhabdus, die beide krachtige pathogenen van insecten zijn. Deze bacteriën worden aangetroffen in het vrijlevende en niet-voedende infectieuze juveniele (IJ) stadium van het EPN, die gevoelige gastheren detecteren, toegang krijgen tot de insectenhemocoel waar ze hun geassocieerde bacteriën vrijgeven die zich snel repliceren en insectenweefsels koloniseren. Zowel het EPN als hun bacteriën produceren virulentiefactoren die de afweer van insecten ontwapenen en de homeostase aantasten. Na de dood van insecten ontwikkelen de nematode-IJs zich tot volwassen EPN en voltooien ze hun levenscyclus. Een nieuw cohort van IJs gevormd als reactie op voedselgebrek en overbevolking in het insectenkadaver duikt uiteindelijk op in de grond om te jagen op geschikte gastheren 9,10,11,12.

Hier wordt een efficiënt protocol beschreven voor het onderhouden, versterken en genetisch manipuleren van EPN-nematoden. In het bijzonder schetst het protocol de replicatie van symbiotische H. bacteriophora en S. carpocapsae IJs, de generatie van axeenaaltjes-IJs, de productie van H. bacteriophora hermafrodieten voor micro-injectie, de bereiding van het dsRNA en de micro-injectietechniek. Deze methoden zijn essentieel voor het begrijpen van de moleculaire basis van pathpathogeniteit van nematoden en gastheer-anti-nematodenimmuniteit.

Protocol

1. Productie van symbiotische nematoden infectieuze juvenielen

1. Bedek een petrischaaltje (10 cm) met een stuk filtreerpapier en voeg ongeveer 10-15 Galleria mellonella-larven toe (figuur 1A).
2. Doseer met een pipet 2 ml water met ongeveer 25-50 JS per 10 μL suspensie op de waswormen. Bewaar de petrischaal in een kast op kamertemperatuur.
3. Afhankelijk van het vochtgehalte van het filterpapier, voeg elke 2 dagen 1-2 ml water toe. Waswormen die besmet zijn met IJs sterven normaal gesproken binnen 48 uur.
4. Bereid de watervallen van White ongeveer 10 dagen nadat de waswormen zijn geïnfecteerd met de IJs⁸ (figuur 1B,C). Breng de dode insecten voorzichtig over op het ongesopukte deel van het filterpapier. Gebruik kraanwater om de onderste petrischaal te vullen en plaats een dop van een buis van 15 ml als afstandhouder voor ventilatie.
5. Breng de zachte en fragiele waswormen voorzichtig over door ze langzaam van het filterpapier te tillen met een plastic tang. Gebruik kraanwater in plaats van gedemineraliseerd of gedeïoniseerd water. Deze laatste veroorzaken nematodenaggregatie.
   1. Zorg ervoor dat het waterniveau in de watervanger ongeveer de helft van de hoogte van de petrischaal bereikt. Verwacht dat het waterniveau in de loop van de tijd zal veranderen, afhankelijk van de temperatuur en vochtigheid in de kamer.
6. Wanneer het water in de kleine petrischaal troebel wordt door de aanwezigheid van nematoden, gebruik dan een pipet om de nieuwe generatie IJs in een T25- of T75-celkweekkolf te verplaatsen.
7. Voeg kraanwater toe tot ongeveer 40% van het volume totdat de juiste dichtheid is bereikt (figuur 1C). Vermijd congestie van nematoden en bewaar de celkweekkolven horizontaal.
8. Voeg meer water toe aan de onderste petrischaal en herhaal stap 1.6 en 1.7 totdat IJs in ongeveer 3-5 dagen niet meer uit de kadavers van insecten komen.

2. Productie van axeennematode infectieuze juvenielen

OPMERKING: Axeenzuurnematoden worden gebruikt omdat nadat het nematode-bacteriecomplex in het insect dissocieert, elke mutualistische partner een duidelijke immuunrespons van de gastheer oproept⁵. De gemuteerde stam Ret16 van Photorhabdus temperata wordt gebruikt omdat deze bacteriën de groei van H. bacteriophora ondersteunen, maar er niet in slagen de nematoden darm te koloniseren^13,14.

1. Heterorhabditis bacteriophora besmettelijke juvenielen
   1. Schraap met behulp van een steriele pipetpunt of spatel verschillende vlokken van een bevroren cultuur van P. temperata Ret16 op een MacConkey-plaat en streep voor enkele kolonies. Incubeer de plaat gedurende 2-3 dagen bij 28 °C.
   2. Ent 10 ml LB-bouillon met een kolonie in een buis van 50 ml en incubeer de cultuur 's nachts bij 28 °C in een schuddende incubator. Gebruik alleen de primaire fasekolonies die rood zijn op MacConkey agar. De kolonies in de secundaire fase zullen gebroken wit zijn op MacConkey-agar.
   3. Was 100 μL nachtkweek met 900 μL 1x PBS door centrifugebuis van 1,5 ml te centrifugeren bij 17.900 x g. Decanteer het supernatant. Verdun de kweek 10x in 1x PBS. Laat de buis op ijs staan.
   4. Dompel de waswormen onder in een 70% ethanoloplossing, droog de insecten met een papieren handdoek en plaats ze in een buis van 50 ml.
   5. Plaats de buis gedurende 20 minuten op ijs om de waswormen te immobiliseren.
   6. Gebruik een filtreerpapier om de bovenste en onderste helften van een petrischaaltje (10 cm) te bedekken. Gebruik het petrischaaldeksel bedekt met filtreerpapier als basisondersteuning voor injectie. Bevochtig het filterpapier van de onderste petrischaal en breng het over op ijs om de geïnjecteerde waswormen te helpen herstellen.
   7. Pipetteer 50 μL ijskoude bacteriën op een stukje parafilm en bereid de naaldspuit van 22 G voor. Druk zachtjes op de zuiger om de lucht aan de punt van de naald te verwijderen.
   8. Houd een wasworm dicht bij het achterste uiteinde onder de stereoscoop (figuur 2).
   9. Injecteer 50 μL van de bacteriecultuur in de dorsale zijde van de thorax, bij voorkeur op de kruising tussen twee segmenten. Om interne schade te minimaliseren, injecteert u net onder de nagelriem, zo parallel mogelijk aan de wasworm. Het is normaal dat een druppel hemolymfe uitbloedt wanneer de wasworm wordt doorboord
   10. Breng de geïnjecteerde insecten over naar de petrischaal voor herstel.
   11. Herhaal stap 2.1.7-2.1.9 totdat alle insecten met de bacterie zijn geïnjecteerd. Om de insecten te verdoven, plaats je ze gedurende 5 minuten op ijs.
   12. Plaats de petrischaal in het donker (bijv. lade of kast) en voeg kraanwater toe aan het filterpapier als het droog lijkt. Waswormen zullen 2 dagen na injectie bezwijken en na ongeveer 3-4 dagen baksteenrood lijken. Als de insecten bruin lijken, is de bacteriële infectie niet succesvol geweest.
   13. Breng 7 dagen na infectie de insecten met de karakteristieke baksteenrode kleur over op een met vers filterpapier beklede petrischaal en ga verder met "Productie van symbiotische nematode infectieuze juvenielen" vanaf stap 1. Als u symbiotische nematoden gebruikt, herhaalt u de procedure uit stap 2.1. met behulp van de nieuw geproduceerde IJs uit de eerste ronde.
   14. Oppervlaktesteriliserend H. bacteriophora IJs
       1. Verzamel voldoende symbiotische H. bacteriophora en kandidaat-axeen-IJs door centrifugatie om een pellet van 100 μL te maken in een centrifugebuis van 1,5 ml.
       2. Voeg 500 μL 5% bleekmiddel toe aan de pellet in elke microcentrifugebuis en keer om. Incubeer gedurende 10 min. Centrifugeer bij 17.900 x g gedurende 1 min. Verwijder het supernatant.
       3. Was de pellet met 1 ml steriel water en herhaal de centrifugatie. Verwijder het supernatant. Herhaal deze stap nog vier keer.
   15. Axeniciteit verifiëren
       1. Pipetteer 400 μL steriel water op de gewassen symbiotische en kandidaat-axeen H. bacteriophora nematoden.
       2. Leg de aaltjes over de insecten in de petrischaal en label de behandelingen dienovereenkomstig.
       3. Plaats de petrischaaltjes met de geïnfecteerde insecten in het donker en controleer periodiek of de waswormen rood worden.
          OPMERKING: Waswormen geïnfecteerd met H. bacteriophora symbiotische nematoden worden binnen 2 dagen na infectie rood. Waswormverkleuring is te wijten aan de afscheiding van verschillende verbindingen geproduceerd door mutualistische Photorhabdus-bacteriën tijdens het infectieproces. Gebrek aan rode kleur in de geïnfecteerde waswormen 4 dagen na infectie bevestigt dat de H. bacteriophora axeen zijn. Dit komt omdat P. temperata Ret16 bacteriën niet aanwezig zijn in de nematoden darm.
   16. Alternatieve methode voor het verifiëren van axeniciteit
       1. Oppervlakte-steriliseer symbiotische H. bacteriophora IJs en kandidaat-axeen H. bacteriophora IJs zoals beschreven in stap 2.1.14.
       2. Homogeniseer ongeveer 500 IJs in 500 μL steriele 1x PBS in microfugebuizen met behulp van steriele stampers. Draai het homogenaat naar beneden, decanteer het supernatant en verdeel het over LB-agar. Incubeer de platen bij 28 °C gedurende 24 uur.
       3. Tel de kolonievormende eenheden (CFU) voor elke plaat. Monsters van axeen H. bacteriophora zullen geen kolonies vormen van de symbiotische P. luminescens-bacterie .
2. Steinernema carpocapsae Infectieuze juvenielen
   1. Bereiding van lipide agar platen (300 ml oplossing maakt ongeveer 20 gesplitste platen)
      1. Weeg 2,4 g nutrient broth, 4,5 g gistextract en 1,5 g agar en voeg ze toe aan 267 ml gedeïoniseerd water. Autoclaaf de oplossing.
      2. Voeg 3 ml 1 M MgCl₂, 1,2 ml maïsolie en 28,8 ml 7% glucosestroop toe.
      3. Bereid en voeg aan de oplossing 300 μL van 30 mg/ml kanamycine en 300 μL 50 mg/ml ampicilline toe (gesteriliseerd met 0,2 μm filter).
      4. Decanteer het mengsel op de helft van een verdeelde petrischaal/splitplaat.
   2. Bereiding van X. nematophila (stam ΔrpoS) bacterieel gazon
      1. Kweek X. nematophila (Xn) ΔrpoS rechtstreeks uit een bevroren bacteriële stockine 2 ml LB/kan/amp oplossing op een shaker bij 30 °C 's nachts.
      2. Ent 5 ml LB-medium met 30 μg/ml kanamycine en 50 μg/ml ampicilline met 250 μl van de nachtkweek en laat de bacteriën 's nachts groeien op een shaker.
         OPMERKING: Xn-bacteriën groeien niet goed wanneer ze rechtstreeks op selectie lipide-agar-media uit een bevroren voorraad worden gestreept. Indien nodig kunnen primaire en secundaire fase Xn eerst worden bevestigd op ^NBTA-media (voedingsstofagar aangevuld met 25 mg broomothymolblauw l⁻¹ en 40 mg trifenyltetrazoliumchloride l−1) voordat een verse vloeibare cultuur wordt gestart.
      3. Pipetteer 100 μL van de cultuur op de lipide agarplaten en verspreid over de gehele plaat met een steriele entlus. Incubeer de platen gedurende 24 uur bij 30 °C.
   3. Oppervlaktesteriliserende S. carpocapsae IJs
      1. Laat een fles met IJs onder een zodanige hoek staan dat de IJs naar een hoek van de kolf zakken. Giet 1 ml van de bezonken IJs in een microcentrifugebuis. Centrifugeer bij 17.900 x g gedurende 10 s. Verwijder het supernatant.
      2. Voeg 1 ml 1% vers bereide bleekoplossing toe. Keer buizen om om grondig te mengen. Incubeer gedurende 1 min (langdurige bleekincubatie zal leiden tot IJ-dood). Draai opnieuw gedurende 10 s. Verwijder supernatant.
      3. Om bleekresten te verwijderen, wast u de nematoden met 1 ml steriel gedestilleerd water en centrifugeert u gedurende 10 s. Verwijder supernatant. Herhaal de was nog vier keer.
      4. Schat het IJ-aantal per ml door 10-20 μL van de gewassen IJs onder de stereoscoop te tellen en pas de concentratie van de IJs dienovereenkomstig aan.
   4. Opfok S. carpocapsae IJs
      1. Breng met een pipet ongeveer 1000 IJs over op de lipide agar split plates (Figuur 3, linker afbeelding). Plaats de platen in een bevochtigde kast of lade. Gebruik vochtige papieren handdoeken om het vochtgehalte te verhogen. Houd de platen op kamertemperatuur (22-25 °C).
      2. Controleer de papieren handdoeken om de dag om er zeker van te zijn dat ze vochtig blijven. Voeg indien nodig om de dag water toe aan de papieren handdoeken om de luchtvochtigheid in de kast of lade te handhaven. U kunt ook een waterbad op de bodem van de kast plaatsen om de luchtvochtigheid te verhogen.
      3. Wanneer IJs alleen verschijnen, voeg je water toe aan de andere kant van de plaat en plaats je een laag filterpapier over het midden van de plaat (watervanger, figuur 3, rechterafbeelding). Verzamel dit water met de eerste ronde IJs in een T75 celkweekkolf. Dit zijn de Round I S. carpocapsae nematoden.
      4. Oppervlakte-steriliseer opnieuw met bleekmiddel (stap 2.2.3) en herhaal het proces uit stap 2.2 met behulp van de Round 1 S. carpocapsae nematoden. Het resultaat is Ronde 2 S. carpocapsae nematoden.
      5. Controleer om de paar dagen onder een stereoscoop om de ontwikkeling van de nematoden te volgen.
   5. De axeentoestand van S. carpocapsae-IJs verifiëren
      1. Steriliseer de ronde 1, ronde 2 en symbiotische S. carpocapsae-IJs met bleekmiddel zoals beschreven in stap 2.2.3.
      2. Homogeniseer ongeveer 400-700 IJs in microfuge-buizen met behulp van steriele plastic stampers. Centrifugeer het homogenaat, decanteer het supernatant en verdeel de oplossing op LB-agarplaten. Bewaar de agarplaten gedurende 24 uur in een incubator op 28 °C.
      3. Tel de vorming van CFU voor elke plaat. Monsters van axeennematoden zullen geen bacteriegroei produceren.
   6. De axenische toestand van S. carpocapsae IJs verifiëren door PCR
      1. Steriliseer de ronde 1, ronde 2 en symbiotische S. carpocapsae-IJs met bleekmiddel zoals beschreven in stap 2.2.3.
      2. Extraheer DNA uit het homogenaat. Een gedetailleerde extractieprocedure wordt beschreven in punt 4.1.2 hieronder.
      3. Voer PCR uit met behulp van de XptA2-primers met gloeitemperatuur 61 °C:
         XPTA F: 5′-GCCTGGAAAGAGTGGACGAA-3′.
         XPTA R: 5′-GTAAGACCAAGGGGCACTCC-3′.
         OPMERKING: Deze primers versterken het insecticide gen XptA2 van X. nematophila en produceren een amplicon van 231 bp. Het fietsprogramma was als volgt: 95 °C gedurende 2 min, 34 cycli van 95 °C gedurende 30 s, gloeitemperatuur van 61 °C gedurende 1 min en 73 °C gedurende 1 min gevolgd door 72 °C gedurende 10 min.
      4. Visualiseer de versterkte fragmenten door scheiding in een 1,5% agarose gel. Axeen oppervlakte-gesteriliseerde monsters zullen geen banden vormen.

3. Het verhogen van H. bacteriophora hermafrodieten voor micro-injectie

1. Bereid petrischaaltjes van 6 cm met NA+chol (1,5x nutrient bouillon, 1,5% agar en 10 μg/ml cholesterol).
2. Bereid 3 ml PP3-oplossing (2% Protease Peptone #3, PP3) in een kweekbuis van 10 ml.
3. Gebruik een steriele tip van 20 μL om de bovenkant van de P. luminescens glycerol-bouillon (25% vol/ vol steriele glycerol) te schrapen die op -80 °C wordt gehouden en laat deze in de kweekbuis vallen.
4. Incubeer de buis een nacht in een temperatuurgecontroleerde shaker ingesteld op 28 °C, 200 rpm.
5. De volgende dag zal de cultuur lichtrood van kleur zijn. Leg 50 μL van de cultuur op een 6 cm NA+chol petrischaaltje en verspreid deze met behulp van een bacterieverspreider op een cirkelvormige manier.
6. Plaats de platen in een incubator van 28 °C. Het P. luminescens gazon is klaar in 24-36 uur en ziet er lichtrood van kleur uit.
7. Ent de plaat in met 50-100 oppervlakte gesteriliseerde IJs en houd de plaat op 28 °C.
8. Gezonde L4 hermafrodiet zal ongeveer 48-54 uur na inenting verschijnen. Gezonde, niet-uitgehongerde late L4 H. bacteriophora hermafrodieten zijn nodig voor injectie.

4. Bereiding van dsRNA

1. Primer ontwerp
   1. Ontwerp primers voor dsRNA om ~500 basenpaar exon regio's van H. bacteriophora DNA te targeten.
      1. Primers voor interessante regio's kunnen worden bepaald met behulp van Primer3 (https://primer3.ut.ee) of een vergelijkbaar programma, waarbij wordt gekozen voor een optimale productlengte van 500 basenparen, Tm van 60 °C en primerlengte van 22 nucleotiden.
      2. Voeg een T7-site (TAATACGACTCACTATAGGG) toe aan de 5′uiteinden van elke voorwaartse primer om in vitro transcriptie mogelijk te maken.
2. Genomische DNA-isolatie
   1. Gebruik genomisch DNA geïsoleerd uit bevroren pellets van ~ 50.000 H. bacteriophora IJs voor dsRNA-synthese.
   2. Gebruik een IJ-pellet resuspendeerd in 50 μL lysisbuffer (50 mM KCl, 0,05% (w/v) gelatine, 10 mM Tris-HCl pH 8,2, 0,45% Tween 20, 60 μg/ml Proteïnase K, 2,5 mM MgCl₂) geplaatst op −80 °C gedurende ten minste 30 min.
   3. Homogeniseer de pellet met een kleine buis stamper.
   4. Verwarm de oplossing tot kamertemperatuur en incubeer bij 60 °C gedurende 2 uur, vortexing om de 15 minuten.
   5. Denatureer het proteïnase K door het gehomogeniseerde weefsel gedurende 15 minuten bij 95 °C te incuberen.
   6. Koel het monster af tot 4 °C en centrifugeer gedurende 1 minuut op 3.400 x g .
   7. Gebruik het resulterende supernatant als sjabloon voor de volgende PCR.
   8. Stel een PCR-reactie van 50 μL in met behulp van een commerciële mastermix met 200 ng sjabloon-DNA, 0,2 μM voorwaartse en omgekeerde primer en de door de fabrikant voorgestelde fietsomstandigheden.
   9. Analyseer de PCR-reactie op een 1,2% agarose-gel om te controleren of de reacties enkele banden van de voorspelde grootte produceerden.
3. dsRNA-synthese
   1. Gebruik een commerciële transcriptiekit.
   2. Gebruik een PCR-reactie van 5 μL voor in vitro transcriptie. Volg de instructies van de fabrikant.
   3. Incubeer de reactie gedurende 16 uur bij 37 °C.
   4. Reinig de in vitro transcriptiereacties met een commerciële kit met behulp van ammoniumacetaat/ethanolprecipitatie om het dsRNA te concentreren.
   5. Suspensie het gepelletiseerde dsRNA in 10 μL RNase-vrij water.
   6. Kwantificeer het RNA met behulp van een spectrofotometer.
   7. Beoordeel de kwaliteit door het dsRNA te scheiden op een 1,2% agarose gel

5. Micro-injectie

LET OP: Een injectiepad is een glazen afdekplaat met een laag van 2% (w/v) agarose op het midden. Wanneer de te injecteren wormen op deze pads worden overgebracht, zal de agarose-laag ze immobiliseren voor de procedure. Normaal gesproken worden extra pads in de buurt van de microscoop gehouden voor algemeen gebruik.

1. Het injectiekussen voorbereiden
   1. Kook 2% agarose in water door 0,2 g agarose toe te voegen aan 10 ml water.
   2. Plaats 1-4 druppels (~50 μL) op het midden van een dunne glazen afdekplaat van 50 mm x 70 mm.
   3. Gebruik een andere coverslip om de druppel af te vlakken.
   4. Laat de coverslip 2-3 min drogen voordat je de coverslip zijwaarts schuift.
   5. Markeer met een 'R' de rechterkant van de naar boven gerichte coverslip.
   6. Laat de glaasjes 1 dag drogen bij kamertemperatuur voordat je ze gebruikt.
2. Voorbereiding van injectienaalden
   1. Gebruik glazen haarvaten van 1,0 mm die een inwendig fijn filament bevatten. Dit maakt een efficiënte vulling van de naald mogelijk.
      OPMERKING: Elke commerciële naaldtrekker (bijv. Narishige PB-7) kan worden gebruikt.
   2. Zet de naaldtrekker aan.
   3. Zorg ervoor dat de kachel is ingesteld op max en dat de solenoïde is ingesteld op 8,40 om de vereiste naaldscherpte en de juiste lengte te garanderen.
   4. Steek de capillaire buis in de bovenste knoprand door de gloeidraad en draai de bovenste knop vast. De bovenkant van de capillaire buis zal gelijk zijn met de bovenkant van de naaldtrekker en de verwarmingsdraad bevindt zich in het midden van het capillair.
   5. Verplaats de onderste eenheid naar boven en draai vervolgens de onderste knop vast. Zorg ervoor dat het capillair goed is geplaatst.
   6. Sluit het deksel van de naaldtrekker en druk op start. Het groene lampje gaat branden. Na een paar minuten wordt het capillair verwarmd en uit elkaar getrokken om in twee helften te scheiden.
      OPMERKING: De twee gescheiden naalden zijn niet van dezelfde lengte, maar ze kunnen beide worden gebruikt voor de injecties. Langere naaldpunten hebben de voorkeur.
   7. Plaats de naalden in een verticale positie met hun punten naar beneden met behulp van een stuk modelleerklei. U kunt de naalden ook bewaren in een petrischaaltje dat op zijn plaats wordt gehouden door twee stroken modelleerklei.
3. De naald laden
   OPMERKING: De nucleïnezuuroplossing moet gedurende ten minste 10 minuten bij 20.784 x g worden gecentrifugeerd tot pelletonzuiverheden die in de suspensie aanwezig kunnen zijn. De centrifugatie van de onzuiverheden voorkomt dat ze de stroom van de injectienaald blokkeren.
   1. Gebruik een van de twee methoden om nucleïnezuren in de naalden te laden.
   2. Methode 1
      1. Gebruik een pipet om ongeveer 0,5 μL van het gecentrifugeerde DNA-monster over te brengen naar het onverpulteerde uiteinde van de injectienaald. Dit zal verschijnen als een kleine druppel vloeistof die bovenop de capillaire buis zit.
      2. Blijf 5 tot 7 minuten staan om het vloeistofmonster het uiteinde van de naald te laten bezetten. Het eindproduct zal een gevulde naald zijn waar geen luchtbellen aanwezig zijn.
      3. Gebruik een dissectiemicroscoop om de aanwezigheid van oplossing in de naaldpunt vóór injectie te bevestigen.
   3. Methode 2
      1. Gebruik laadtips voor de microinjector.
      2. Pipetteer met deze laadpunt 5 μL van de nucleïnezuuroplossing.
      3. Terwijl de getrokken naald op de naaldtrekker zit, maakt u de bovenste knop los, beweegt u de bovenste getrokken naald iets naar boven en maakt u de knop opnieuw vast.
      4. Steek de punt van de lader voorzichtig in de capillaire buis en verleng deze naar de bodem van de injectienaald.
      5. Pipetteer de nucleïnezuuroplossing in de injectienaald.
      6. Verwijder de lader van de getrokken naald en houd deze gescheiden voor verdere belasting, indien nodig. Zorg ervoor dat u laders uitschakelt bij het laden van een ander nucleïnezuurmengsel.
4. Voorbereiding van de injectiemicroscoop
   OPMERKING: Een omgekeerde microscoop met diffuse verlichting van de microscoopbasis wordt gebruikt voor wormvoorbereiding, micro-injectie en herstel. Het gebruik van een hoge resolutie omgekeerde microscoop met 10x en 40x objectieven wordt beschreven. De microscoop is uitgerust met een naaldmanipulator die de naald vasthoudt en in positie brengt voor de injectie. Micro-injectieolie wordt gebruikt om te voorkomen dat de worm snel uitdroogt terwijl hij op de agarose-laag van het injectiekussen zit. De voorgestelde olie om te gebruiken is Halocarbon Oil 700.
   1. Schakel de lamp in en kalibreer de helderheid met het bedieningspaneel.
   2. Controleer het nummer op het condensor Wollaston prisma; het komt overeen met de gebruikte doelstelling (40x).
   3. Controleer of het DIC-torentje, gemarkeerd met "DIC", zich op de juiste positie bevindt.
   4. Zorg ervoor dat de knop op het doel op nul (0) is ingesteld.
   5. Draai de Ph-ring naar rechts tot het einde.
   6. Stel de polarisator zo in dat de pijl op horizontale positie staat.
   7. Leg een stuk papier op het podium om het brandpunt (licht) te observeren.
   8. Sluit het veldmembraan tot het punt dat er een vlek op het papier is.
   9. Gebruik de draaiknop aan de linkerkant om de condensor op en neer te bewegen tot het punt dat er een zeer scherpe lichtvlek op het stukpapier te zien is.
   10. Open het veldmembraan langzaam tot het punt dat een kleine cirkel van licht zichtbaar is.
   11. Haal het papiertje weg.
   12. Zorg ervoor dat de lichtvlek zich in het midden van het objectief bevindt. Anders lijnt u de lichtvlek uit met het midden van het objectief door de zilveren schroeven aan de bovenkant van de condensor aan te passen.
   13. Open het veldmembraan volledig.
   14. Controleer of de analyzer ICT/P is ingedrukt.
5. Montage van de injectienaald op de microscoop
   1. Schakel de stikstofgasstroom naar de micro-injectienaald in. De gasdruk naar de naald zal ongeveer 20 psi zijn.
   2. Controleer of de micromanipulatorknoppen (het deel van de microscoop dat de naald beweegt) in het midden zijn geplaatst, waardoor het breedste bewegingsbereik mogelijk is wanneer de naald is gemonteerd.
   3. Schroef de montage los die de metalen staaf vasthoudt om deze uit de naaldhouder te verwijderen.
   4. Steek de nieuwe naald in het bovenste deel van de microscoop; installeer vervolgens de rubberen pakking om de naald op zijn plaats te houden.
   5. Bevestig het onderste deel van de naaldhouder door deze op de montage te monteren.
   6. Steek de naald in de groef op de micromanipulator en schroef deze goed vast om hem stabiel te houden. Zorg ervoor dat de schroef ongeveer 1 inch van het uiteinde van de micromanipulator verwijderd is.
   7. Plaats de punt van de naald in het midden van het gezichtsveld in een hoek van ongeveer 45° ten opzichte van de podiumplaat, met behulp van de knoppen en grove bedieningselementen van de micromanipulator. Het is van cruciaal belang om de naaldpunt hoog genoeg te laten, zodat deze niet per ongeluk breekt.
6. De naalden breken
   1. Plaats de naald in de micromanipulator waar de punt van de naald normaal gesproken zal breken om de nucleïnezuuroplossing er doorheen te laten stromen.
   2. Breek een capillair en plaats het op een glazen schuif met een druppel micro-injectieolie.
   3. Plaats de dia op de microscoop en stel scherp.
   4. Breng de punt van de naald op hetzelfde niveau als de zijkant van het capillair met behulp van de fijne bedieningselementen van de microscoop (figuur 4).
   5. Schakel de stikstofstroom kort in met behulp van de voetactuator om te bevestigen dat de punt van de naald niet is gebroken. Een snelle aan-uit is voldoende.
   6. Beweeg de naald voorzichtig zodat deze nauwelijks de zijkant van het capillair raakt.
   7. Tik lichtjes op de zijkant van de microscoop om de punt van de naald te breken.
   8. Verwijder de naald uit het capillair en zet de stikstofstroom aan om te controleren of de naald goed gebroken is.
   9. De naald zal een kleine injectiedruppel creëren die ongeveer vijf keer groter is dan de punt van de naald (figuur 4). Als de injectiedruppel kleiner is, breek de punt dan verder. Als de injectiedruppel groter is, probeer dan een nieuwe naald te gebruiken.

6. Micro-injectie

1. Pipetteer een druppel micro-injectieolie op een injectiepad.
2. Dompel een vlam-gesteriliseerde pik in de micro-injectie oliedruppel en verzamel een jonge H. bacteriophora volwassen nematode van de plaat.
3. Pluk de nematoden uit delen van de plaat die niet in de buurt van het bacteriële gazon liggen om de overdracht van grote aantallen bacteriële cellen naar het injectiekussen te voorkomen. Oogst ook een nematode met goed gevormde geslachtsklieren.
4. Verplaats de aaltjes naar het injectiekussen en plaats ze verticaal zodat de geslachtsklieren naar de naald gericht zijn. Zorg ervoor dat de vulva in dezelfde richting wijst als de injectienaald en dat de twee distale geslachtsklierarmen zich in de tegenovergestelde richting en tegen de lichaamswand van de nematoden bevinden.
   OPMERKING: Net als Pristionchus pacificus migreert de geslachtsklier van H. bacteriophora dorsaal van de ventrale vulvapositie en migreert vervolgens terug naar de ventrale positie.
5. Controleer of de hoeveelheid olie voldoende is om uitdroging van nematoden te voorkomen zonder dat de nematode ronddwaalt.
6. Breng de nematode in beeld met het 10x objectief door de naald ruim boven de glijbaan te houden. In olie worden de nematoden gonaden gezien als twee heldere gebieden dicht bij de voorste en achterste van de worm. Zorg ervoor dat de geslachtsklieren scherp zijn en niet de andere delen van de worm.
7. Plaats de nematode onder een hoek van 15° tot 45° naar de injectienaald, waardoor de naald in de gonade meer ruimte krijgt. Ook voorkomt deze aanpak dat de naald door het hele lichaam van de nematoden gaat wanneer de naald in de geslachtsklier wordt gebracht.
8. Plaats de injectienaald en de nematode op hetzelfde niveau door de naald geleidelijk te laten zakken totdat deze scherp wordt gesteld (figuur 5). Zorg ervoor dat als de naald wordt neergelaten, deze naast de nematode blijft en niet boven de worm.
9. Gebruik het 40x-objectief om te focussen op de syncytiele gonadearm van de nematode.
10. Beweeg de naald op en neer met behulp van de fijnversteller totdat de punt in focus is samen met de syncytiele geslachtsarm van de nematoden.
11. Beweeg de nematode langzaam naar de naald met behulp van de schuiffase. Duw vervolgens de gonade voorzichtig naar positie met de naald tegen de lichaamswand van de nematoden, wat zal resulteren in een efficiënte naaldpenetratie in het nematodenlichaam.
12. Stap kort op de voetactuator om de stroom van de nucleïnezuuroplossing te starten. Een snelle aan-uit is voldoende. Als de naald zich in de gonade bevindt, zal de gonade zich vullen met de oplossing en opzwellen.
13. Zodra de naald in de juiste positie is bevestigd, vult u de gonade met de nucleïnezuuroplossing totdat de armen van de gonade zijn gevuld. Het is belangrijk om de uitdrijving van vloeistof uit de worm door het gat waar de naald het heeft doorboord te voorkomen.
14. Gebruik de schuiffase en beweeg de worm voorzichtig weg van de naald.
15. Til de naald op en draai hem tegen de klok in.
16. Plaats een druppel van 1x PBS-buffer bovenop de worm om deze te laten drijven.
17. Gebruik de vlam-gesteriliseerde pick om de worm op te tillen en plaats deze in een andere druppel M9 op een verse P. luminescens gezaaide plaat om de worm van overtollige olie te ontdoen.
18. Verwijder de nematode van de M9 en plaats deze aan de andere kant van het bacteriële gazon.
19. Gebruik dezelfde plaat om meerdere geïnjecteerde nematoden over te brengen.
20. Evalueer binnen 2-3 dagen de eerste generatie (F1) nematoden voor het transgene fenotype. Scheid de transgene F1-nematoden op individuele platen om te bepalen welke wormen stabiele transgene lijnen zullen genereren.

Resultaten

Om de status van H. bacteriophora-nematoden die de axenisatie hebben doorgemaakt te beoordelen, werd de aan- of afwezigheid van P. luminescens-bacteriekolonies in IJs bepaald. Om dit te doen, werd een pellet van ongeveer 500 IJs verzameld die eerder aan het oppervlak was gesteriliseerd en gehomogeniseerd in PBS. De positieve controlebehandeling bestond uit een pellet van ongeveer 500 IJs uit de nematodencultuur met symbiotische P. luminescens-bacteriën . De pellets van axenized en positive cont...

Discussie

Het begrijpen van de moleculaire basis van entomopathogene nematodeninfectie en insecten-anti-nematodenimmuniteit vereist de scheiding van de parasieten van de mutualistisch geassocieerde bacteriën 13,15,16. De entomopathogene nematoden H. bacteriophora en S. carpocapsae leven samen met respectievelijk de Gram-negatieve bacteriën P. luminescens en X. nematophila ¹⁷. Van...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agarose	VWR	97062-244
Ambion Megascript T7 Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1333
Ampicillin	Fisher Scientific	611770250
Cell culture flask T25	Fisher Scientific	156367
Cell culture flask T75	Fisher Scientific	156499
ChoiceTaq Mastermix	Denville Scientific	C775Y42
Corn oil	VWR	470200-112
Corn syrup	MP Biomedicals/VWR	IC10141301
Culture tube 10 mL	Fisher Scientific	14-959-14
Eppendorf Femtotips Microloader Tips	Eppendorf	E5242956003
Ethanol	Millipore-Sigma	E7023
Falcon tube 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Femtojet Microinjector	Eppendorf	5252000021
Filter paper	VWR	28320-100
Galleria mellonella waxorms	Petco	-
Glass coverslip	Fisher Scientific	12-553-464	50 x 24 mm
Halocarbon Oil 700	Sigma	H8898
Inoculating loop	VWR	12000-806
Kanamycin	VWR	97062-956
Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-3	1.0 mm
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425-500	LB agar miller powder 500 g
LB Broth	Fisher Scientific	BP1426-500	LB broth miller powder 500 g
Leica DM IRB Inverted Research Microscope	Microscope Central	-
MacConkey medium	Millipore-Sigma	M7408-250G
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1908
Microcentrifuge tube	VWR	76332-064	1.5 ml
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
Needle syringe	VWR	BD305155	22G
Nutrient broth	Millipore-Sigma	70122-100G
Parafilm	VWR	52858-076
Partitioned Petri dish	VWR	490005-212
PBS	VWR	97062-732	Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab
PCR primers	Azenta	-
Pestle	Millipore-Sigma	BAF199230001	Bel-Art Disposable Pestle
Petri dish 6 cm	VWR	25384-092	60 x 15 mm
Petri dish 10 mm	VWR	10799-192	35 x 10 mm
Proteose Peptone #3	Thermo Fisher Scientific	211693
Yeast extract	Millipore-Sigma	Y1625