Septines zijn cytoskeletale eiwitten. Ze interageren met lipidembranen en kunnen membraankromming op micronschaal waarnemen maar ook genereren. We beschrijven in dit protocol bottom-up in vitro methodologieën voor het analyseren van membraanvervormingen, krommingsgevoelige septinebinding en septinefilament ultrastructuur.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bottom-up in vitro methoden om de ultrastructurele organisatie, membraanhervorming en krommingsgevoeligheidsgedrag van septines te testen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Membraanremodellering vindt constant plaats op het plasmamembraan en in cellulaire organellen. Om de rol van de omgeving (ionische condities, eiwit- en lipidensamenstellingen, membraankromming) en de verschillende partners geassocieerd met specifieke membraanhervormingsprocessen volledig te ontleden, ondernemen we in vitro bottom-up benaderingen. In de afgelopen jaren is er grote belangstelling geweest voor het onthullen van de rol van septine-eiwitten geassocieerd met belangrijke ziekten. Septines zijn essentiële en alomtegenwoordige cytoskeletale eiwitten die interageren met het plasmamembraan. Ze zijn betrokken bij celdeling, celmotiliteit, neuromorfogenese en spermiogenese, naast andere functies. Het is daarom belangrijk om te begrijpen hoe septines interageren en organiseren op membranen om vervolgens membraanvervormingen te induceren en hoe ze gevoelig kunnen zijn voor specifieke membraankrommingen. Dit artikel heeft tot doel het samenspel te ontcijferen tussen de ultrastructuur van septines op moleculair niveau en de membraanremodellering op micronschaal. Daartoe werden ontluikende gist- en zoogdierseptinecomplexen recombinant tot expressie gebracht en gezuiverd. Een combinatie van in vitro assays werd vervolgens gebruikt om de zelfassemblage van septines aan het membraan te analyseren. Ondersteunde lipide bilayers (SLBs), gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs), grote unilamellaire blaasjes (LUVs) en golvende substraten werden gebruikt om het samenspel tussen septine zelfassemblage, membraanverandering en membraankromming te bestuderen.
Inleiding
Septines zijn cytoskeletale filamentvormende eiwitten die interageren met lipidembranen. Septines zijn alomtegenwoordig in eukaryoten en essentieel voor tal van cellulaire functies. Ze zijn geïdentificeerd als de belangrijkste regulatoren van celdeling in ontluikende gist en zoogdieren 1,2. Ze zijn betrokken bij membraanhervormingsgebeurtenissen, ciliogenese3 en spermiogenese4. In zoogdiercellen kunnen septines ook interageren met actine en microtubuli 5,6,7 in een bindm....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bepaling van membraanhervormen met behulp van gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs)
OPMERKING: In deze sectie worden GUVs gegenereerd om de membraanvervormingen na te bootsen die mogelijk worden veroorzaakt door septines in een cellulaire context. Inderdaad, in cellen worden septines vaak gevonden op plaatsen met micrometerkrommingen. GUVs hebben afmetingen variërend van enkele tot tientallen micrometers en kunnen worden vervormd. Ze zijn dus geschikt om eventuele septine-geïnduceerde vervormingen op micrometerschaal te testen. Fluorescerende lipiden, evenals fluorescerend gelabelde septines (met behulp van Green Fluor....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
GUVs vervormingen
Typische confocale fluorescentiebeelden van GUVs die opnieuw zijn gevormd nadat ze zijn geïncubeerd met septines, worden weergegeven in figuur 3, in omstandigheden waarin septines polymeriseren. Kale GUVs (figuur 3A) waren perfect bolvormig. Bij incubatie met meer dan 50 nM ontluikende gist septineslamenten leken de blaasjes vervormd. Tot een concentratie van 100 nM ontluikende gistseptine-octameren leken de blaasjes gefacet.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Zoals hierboven vermeld, is een lipidenmengsel gebruikt dat de PI(4,5)P2-opname in de lipide bilaag verbetert en zo septine-membraaninteracties vergemakkelijkt. Inderdaad, we hebben elders25 aangetoond dat ontluikende gist septines interageren met blaasjes op een PI(4,5)P2-specifieke manier. Deze lipidesamenstelling werd empirisch aangepast door het screenen van meerdere samenstellingen en wordt nu veel gebruikt door de auteurs. PI(4,5)P2 lipiden moeten zorgvuldig .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Wij danken Patricia Bassereau en Daniel Lévy voor hun nuttige adviezen en discussies. Dit werk heeft de steun gekregen van het ANR (Agence Nationale de la Recherche) voor de financiering van het project "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 en het project "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin wordt gefinancierd door de Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" en Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa werd ondersteund door Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink werd ondersteund door de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) via de 'BaSyC-Building a Synthetic Cell'. Zwaartekra....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Bath sonicator | Elma | Elmasonic S10H | |
| Bodipy-TR-Ceramide | invitrogen, Thermo Fischer scientific | 11504726 | |
| Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Confocal microscope | nikon | spinning disk or confocal | |
| Critical point dryer | Leica microsystems | CPD300 | |
| Deionized water generator | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ integral 3 |
| Egg L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| Field Emission Gun SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
| Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
| High vacuum grease, Dow corning | VWR | ||
| IMOD software | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction | |
| Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids | Eloise | 01883-F | |
| Lipids | Avanti Polar Lipids | ||
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
| Metal evaporator | Leica microsystems | EM ACE600 | |
| NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 | Norland Products | NOA71, NOA81 | |
| Osmium tetraoxyde 4% | delta microscopies | 19170 | |
| Osmometer | Löser | 15 M | |
| Plasma cleaner | Alcatel | pascal 2005 SD | |
| Plasma generator | Electron Microscopy Science | ||
| Plunge freezing equipment | leica microsystems | EMGP | |
| Transmission electron microscope | Thermofischer | Tecnai G2 200 kV, LaB6 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22451 | this product is not available for purchase any longer |
| Wax plates, Vitrex | VWR |
Referenties
- Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
- Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto se....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
