Method Article

Microfluïdica en fluorescentiemicroscopie gebruiken om de assemblagedynamiek van single actinefilamenten en -bundels te bestuderen

DOI:

10.3791/63891

⸱

May 5th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Université Paris Cité, CNRS, Institut Jacques Monod

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren protocollen voor eenvoudige actinefilamentmicrofluïdische assays, in combinatie met fluorescentiemicroscopie, waarmee men individuele actinefilamenten in realtime nauwkeurig kan volgen terwijl ze sequentieel worden blootgesteld aan verschillende eiwitoplossingen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de complexe moleculaire mechanismen te ontcijferen die de assemblage en demontage van actinefilamenten reguleren, is het een grote aanwinst om individuele reacties live in goed gecontroleerde omstandigheden te monitoren. Om dit te doen, zijn er de afgelopen 20 jaar levende single-filament experimenten ontstaan, meestal met behulp van total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie, en hebben ze een schat aan belangrijke resultaten opgeleverd. In 2011, om de mogelijkheden van deze experimenten verder uit te breiden en terugkerende problematische artefacten te voorkomen, introduceerden we eenvoudige microfluïdica in deze testen. Deze studie beschrijft ons basisprotocol, waarbij individuele actinefilamenten aan één uiteinde worden verankerd aan het gepassiveerde coverslipoppervlak, worden uitgelijnd met de stroom en achtereenvolgens kunnen worden blootgesteld aan verschillende eiwitoplossingen. We presenteren ook de protocollen voor specifieke toepassingen en leggen uit hoe gecontroleerde mechanische krachten kunnen worden toegepast, dankzij de viskeuze weerstand van de stromende oplossing. We belichten de technische kanttekeningen van deze experimenten en presenteren kort mogelijke ontwikkelingen op basis van deze techniek. Deze protocollen en verklaringen, samen met de huidige beschikbaarheid van eenvoudig te gebruiken microfluïdica-apparatuur, moeten niet-specialisten in staat stellen deze test in hun laboratoria te implementeren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De assemblage en demontage van actinefilamenten en actinefilamentnetwerken worden gecontroleerd door verschillende biochemische reacties en zijn afhankelijk van de mechanische context. Om inzicht te krijgen in deze complexe mechanismen is het van onschatbare waarde om individuele reacties op individuele filamenten (in voldoende grote aantallen) te kunnen waarnemen. In de afgelopen decennia is de observatie van dynamische actinefilamenten in realtime, meestal met behulp van total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie, naar voren gekomen als een belangrijke techniek en heeft een indrukwekkende lijst van resultaten opgeleverd die niet konden worden verkrege....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Microfluïdische kamervoorbereiding

  1. Selecteer een SU-8 master mal met verschillende kamerpatronen. Typische kamers zijn kruisvormig met drie inlaten en één uitlaat, 20 μm hoog en 800 μm breed (figuur 1). Dergelijke mastermallen kunnen worden gekocht bij externe bedrijven of worden gemaakt in academische laboratoria (bijv. Gicquel, Y. et al.5).
  2. Plaats tape rond de rand van de mal.
    1. Leg ~50 cm lang, 19 mm breed, standaard transparante kantoortape (zie Materiaaltabel) op een bank, plakkerige kant naar boven. Plaats de mal verticaal aan het ene uiteinde en ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor alle hierboven beschreven experimenten moeten fluorescerend gelabelde actinefilamenten duidelijk zichtbaar zijn, met een goed contrast, wat wijst op een lage achtergrondfluorescentie vanaf het oppervlak (figuur 4, zie aanvullend bestand 1 voor het oplossen van veelvoorkomende problemen). Actinefilamenten mogen ook niet aan het oppervlak kleven: wanneer de dominante stroomsnelheid laag is, moeten de laterale fluctuaties van de actinefilamenten waarneembaar zijn wanneer z.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vergeleken met standaard single-filament methoden waarbij actinefilamenten op meerdere punten over hun lengte aan het oppervlak worden verankerd of er dicht bij worden gehouden door een verdringingsmiddel zoals methylcellulose, biedt microfluïdica een aantal voordelen. Omdat interacties met het oppervlak minimaal zijn, worden de kunstmatige pauzes die deze interacties kunnen induceren tijdens zowel rek als depolymerisatie vermeden. De filamenten worden uitgelijnd door de stroom, parallel aan elkaar, waardoor hun monitori.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn de B. Ladoux en R.-M. dankbaar. Mège lab voor het gebruik van hun UV-reiniger apparatuur, en J. Heuvingh en 0. du Roure voor de initiële training die we kregen over het bereiden van mallen op siliciumwafers en het geven van tips over microfluïdica. We erkennen financiering van European Research Council Grant StG-679116 (aan A.J.) en Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin en Conformin (aan G.R.-L.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
β-CaseinMerckC6905Used at 8 mg/mL
Biopsy punch (with plunger)Ted Pella15115-2ID 0.75 mm, OD 1.07 mm
Biotin-BSAMerckA8549Used at 1 mg/mL
BSAMerckA8022Used at 50 mg/mL
Coverslip Mini-Rack
Teflon holder		InvitrogenC14784for 8 coverslips
Coverslips 22x40mm
Thickness #1.5		Menzel Gläser631-1370
DABCOMerckD27802component in f-buffer
DTTEuromedexEU0006-Dcomponent in f-buffer
Ester NHS Alexa Fluor 488InvitrogenA20000Fluorophore for actin labeling on Lys328.
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo Scientific21338To biotinylate actin on Lys328
Hellmanex IIIHellma9-307-011-4-507Glass cleaning detergent
ImageJNIHN/Aopen source software
LaboportKNF811kn.18vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar)
Magic invisible tapeScotch7100024666standard transparent office tape
MicrewtubeSimportT341-6T2 mL microfluidic reservoir tubes
Microfluidic device Part 1: Flow Unit SFluigentFLU-S-D-PCKBFlowmeter
Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mLFluigent14002001PCKReservoir holder
Microfluidic device Part 3: MFCS-EZFluigentEZ-11000001
EZ-00345001		Pressure controller
Model 42 - UVO-CleanerJelight Inc.42-220Ultraviolet cleaner
N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488Jena BioscienceNU-805-488ATP-ATTO used to label actin
neutravidinThermo Scientific31000
PLL-PEGSuSoSPLL(20)-g[3.5]- PEG(2)Use at 1 mg/mL in PBS.
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon ElastomerDow Corning1673921Contains PDMS base and curing agent
Polyetheretherketone (PEEK) tubingMerckZ226661“Blue” : I.D. = 0.25 mm
Safety blow gunCoilhose Pneumatics700-Sfiltered air
Silicon tubingVWR228-0701Pconnect PEEK to coupler
Stainless steel catheter couplerPrime BioscienceSC22/15Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing
Thermoplastic filmSigma AldrichPM996Standard "parafilm"
Ultrapure ethanolVWR64-17-5
Ultrasonic cleaning bathVWRUSC200THTo accomodate 1 L beakers
Vacuum dessicatorSP Bel-ArtF42022-0000to degas the PDMS or solutions

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119(2022).
  2. Kuhn, J. R., Pollard, T. D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Actin Filament AssemblyMicrofluidics AssayFluorescence MicroscopyTIRF MicroscopyActin BundlesFilament PolymerizationFilament DepolymerizationSurface PassivationActin Binding ProteinsMechanical Forces

Related Articles