Computer numerieke controle Micromilling van een microfluïdisch acrylapparaat met een gespreide beperking voor magnetische immunoassays op basis van nanodeeltjes

Summary

Microfluïdica is een krachtig hulpmiddel voor de ontwikkeling van diagnostische tests. Dure apparatuur en materialen, evenals bewerkelijke fabricage- en handlingtechnieken, zijn echter vaak vereist. Hier beschrijven we het fabricageprotocol van een acryl microfluïdisch apparaat voor magnetische micro- en nanodeeltjesgebaseerde immunoassays in een goedkope en eenvoudig te gebruiken omgeving.

Abstract

Microfluïdische systemen hebben de immunoassaytechnieken sterk verbeterd. Veel microfabricagetechnieken vereisen echter gespecialiseerde, dure of gecompliceerde apparatuur, waardoor fabricage duur en incompatibel is met massaproductie, wat een van de belangrijkste voorwaarden is voor point-of-care-tests (POCT) om te worden toegepast in omgevingen met weinig middelen. Dit werk beschrijft het fabricageproces van een acryl (polymethylmethacrylaat, PMMA) apparaat voor nanodeeltjes-geconjugeerde enzymatische immunoassay testen met behulp van de computer numerieke controle (CNC) micromilling techniek. De werking van het microfluïdische apparaat wordt aangetoond door een immunoassay uit te voeren om een commercieel antilichaam te detecteren met behulp van lysozym als een modelantigeen geconjugeerd aan 100 nm magnetische nanodeeltjes. Dit apparaat integreert een fysieke gespreide beperking van slechts 5 μm in hoogte, gebruikt om magnetische microdeeltjes die deel uitmaken van een magnetische val te vangen door een externe magneet te plaatsen. Op deze manier is de magnetische kracht op de immunosupport van geconjugeerde nanodeeltjes voldoende om ze te vangen en weerstand te bieden aan de stromingsweerstand. Dit microfluïdische apparaat is bijzonder geschikt voor goedkope massaproductie zonder het verlies van precisie voor immunoassay-prestaties.

Introduction

De afgelopen jaren heeft microfluïdica een belangrijke rol gespeeld bij immunoassaytechnieken¹. Miniaturisatietechnologie heeft veel uitstekende voordelen in vergelijking met traditionele immunoassays, zoals een lager monster- en reagensverbruik, kortere incubatietijden, efficiënte uitwisseling van oplossingen en hogere integratie en automatisering².

Bovendien verminderen microfluïdische systemen in immunoassays, in combinatie met magnetische nanodeeltjes als immunosupport, de incubatietijden aanzienlijk, waardoor een hoge detectiegevoeligheid wordt bereikt vanwege de verhoogde oppervlakte-volumeverhouding³. Brownse beweging van de deeltjes verbetert de reactiekinetiek tijdens de vorming van het antigeen-antilichaamcomplex ^4,5. Bovendien bieden de magnetische eigenschappen van nanodeeltjes de veelzijdigheid om te worden geïntegreerd in verschillende microfluïdische apparaatconfiguraties, waardoor ze een ideale kandidaat zijn voor signalering en molecuulvangst in geminiaturiseerde on-chip biosensingsystemen⁵. Magnetische krachten zijn echter aanzienlijk zwakker dan luchtweerstandskrachten op nanometerschaal vanwege de hoge oppervlakte-volumeverhouding⁶. Daarom kan het vastleggen van nanodeeltjes voor cruciale immunoassay-stappen zoals wassen en detecteren een uitdaging zijn, en een conventionele magneet is onvoldoende⁴.

Een efficiënte manier om de nanodeeltjes te manipuleren is het gebruik van een microfluïdische magnetische val gevormd door ijzeren microdeeltjes, die zijn verpakt in een microfluïdische structuur³. Daarom, wanneer een externe magneet nadert, wordt een complexe interactie gecreëerd binnen het gemagnetiseerde poreuze medium tussen de magnetische en fluxkrachten. De magnetische kracht die op de nanodeeltjes inwerkt, is sterk genoeg om ze op te vangen en weerstand te bieden aan^de stromingsweerstand ^3,4,7. Deze aanpak vereist microfabricagetechnieken die resoluties bereiken in de orde van enkele micrometers om micrometrische structuren te genereren die de microdeeltjes vasthouden.

De huidige microfabricagetechnieken maken het mogelijk om structuren met hoge resolutie te fabriceren van enkele microns tot honderden nanometers⁸. Veel van deze technieken vereisen echter gespecialiseerde, dure of gecompliceerde apparatuur. Een van de grootste problemen is de vereiste voor een cleanroom voor matrijsfabricage, die duur en tijdrovend blijft ^8,9. Onlangs hebben microfluïdische ingenieurs dit nadeel overwonnen door een verscheidenheid aan alternatieve fabricagemethoden te ontwikkelen, met verschillende voordelen zoals lagere kosten, snellere doorlooptijden, goedkopere materialen en gereedschappen en verhoogde functionaliteit⁸. Op deze manier bracht de ontwikkeling van nieuwe microfabricagetechnieken goedkope, niet-cleanroommethoden met resoluties zo laag als 10 μm⁸. Patroonvorming kan direct op een substraat worden gebruikt zonder een duur gietpatroon te genereren, waardoor een tijdrovend proces wordt vermeden. Directe fabricagemethoden omvatten CNC-frezen, laserablatie en directe lithografie⁸. Al deze methoden zijn geschikt voor het produceren van kanalen met een hoge beeldverhouding in een breed scala aan materialen, ongeacht hun hardheid⁹, waardoor nieuwe en voordelige geometrieën, fysiek gedrag en kwaliteiten in microfluïdische apparaten^{mogelijk worden 8}.

CNC-microfrezen creëren microschaalstructuren met behulp van snijgereedschappen die bulkmateriaal uit een substraat verwijderen en is een effectieve fabricagemethode voor microfluïdische apparaten^10,11. De micromolentechniek kan nuttig zijn in microfluïdische toepassingen om microkanalen en functies direct op het werkoppervlak te creëren, wat een belangrijk voordeel biedt: een werkstuk kan in korte tijd (minder dan 30 minuten) worden vervaardigd, waardoor de doorlooptijd van ontwerp tot prototype¹² aanzienlijk wordt verkort. Bovendien maakt de brede beschikbaarheid van snijaccessoires van verschillende materialen, maten en vormen CNC-freesmachines een geschikt hulpmiddel dat de fabricage van verschillende functies in vele soorten goedkope wegwerpmaterialen mogelijk heeft gemaakt¹³.

Van alle materialen die vaak worden gebruikt in micromolens, blijven thermoplasten een toonaangevende keuze vanwege hun vele gunstige eigenschappen en compatibiliteit met biologische toepassingen ^10,14. Thermoplasten zijn een aantrekkelijk substraat voor microfluïdische systemen vanwege hun aanzienlijke voordelen voor de ontwikkeling van goedkope, wegwerpanalysesystemen⁹. Bovendien zijn deze materialen zeer geschikt voor productieprocessen met een hoog volume, waardoor ze geschikt zijn voor commercialisering en massaproductie. Om deze redenen worden thermoplasten zoals PMMA sinds de beginjaren van microfluïdica als betrouwbare en robuuste materialen beschouwd¹⁰. Er zijn verschillende protocollen beschreven om gesloten kanalen in thermoplasten te fabriceren, zoals solventbinding¹⁵, warmtebinding¹⁶ en ultraviolette (UV) / ozonoppervlakbehandelingsbinding¹⁷.

In veel gevallen is de positioneringsresolutie die wordt bereikt met conventionele micromolenmachines niet voldoende voor sommige microfluïdische toepassingen die structuren kleiner dan 10 μm vereisen. High-end micromilling heeft voldoende resolutie. Helaas is het gebruik ervan vanwege de hoge prijzen beperkt tot een handvol gebruikers¹². Eerder rapporteerde onze onderzoeksgroep de fabricage en manipulatie van een goedkoop gereedschap dat bewerkingsstructuren van minder dan 10 μm mogelijk maakt, waardoor de resolutie van conventionele freesmachines^{wordt overwonnen 12}. Het armatuur is een platform vervaardigd door 3D-printen met eenvoudige elektronica, met drie piëzo-elektrische actuatoren. Het oppervlak bevat scharniervormige verbindingen die het mogelijk maken om te worden opgetild wanneer de piëzo-elektrische elementen tegelijkertijd werken. Z-as verplaatsing kan worden geregeld met een resolutie van 500 nm en een nauwkeurigheid van ±1,5 μm¹².

Dit artikel presenteert de stappen van het productieproces van een acrylapparaat (PMMA) door middel van een micromolentechniek. Het chipontwerp bestaat uit een hoofdkanaal van 200 μm breed en 200 μm hoog en een zijkanaal met dezelfde afmetingen om de stroom van de reagentia te zuiveren. In het centrale gebied wordt het kanaal onderbroken door een fysieke beperking van slechts 5 μm hoog, vervaardigd met het 3D-geprinte piëzo-elektrische platform gemaakt door deze groep¹², om magnetische microdeeltjes te vangen die een magnetische val vormen voor nanodeeltjes door een externe magneet te plaatsen. We tonen de werking van het microfluïdische apparaat door een immunoassay uit te voeren om een commercieel antilichaam te detecteren met behulp van lysozym als een modelantigeen geconjugeerd aan 100 nm magnetische nanodeeltjes. Dit apparaat combineert verschillende functies die het uniek maken⁴: het gebruik van magnetische nanodeeltjes als immuunondersteuning vermindert de totale testtijd van uren tot minuten; het gebruik van een fluorogeen enzym voor detectie zorgt voor detectielimieten die vergelijkbaar zijn met die van standaard enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA's); en het gebruik van een thermoplast als fabricagemateriaal maakt het compatibel met massaproductie, wat niet het geval was voor eerdere magnetische vallen van microfluïdische nanodeeltjes³, en maakt het een uitstekende kandidaat om POCT te ontwikkelen.

Protocol

1. Micromolens

1. Oppervlakte slijpen
   1. Schakel de micromolenmachine en de piëzo-elektrische controller in. Start hun respectievelijke besturingssoftware¹².
   2. Selecteer de vereiste eindmolenbits (diameters van 200 μm en 800 μm). Plaats ze in het daarvoor bestemde compartiment van de freesmachine (figuur 1).
   3. Knip 9 mm x 25 mm rechthoeken van 1,3 mm dik PMMA met de 800 μm eindfreesbit. Bevestig een van deze rechthoeken voorzichtig met dubbelzijdig plakband aan het piëzo-elektrische platform (figuur 2).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de acrylrechthoek altijd op dezelfde positie plaatst, zodat een van de hoeken samenvalt met de oorsprongscoördinaten op de x- en y-as voor bewerking.
   4. Sluit de z-sensor aan en plaats deze op het oppervlak van de PMMA-rechthoek. Selecteer de detectiepen en beweeg deze over het sensoroppervlak. Laat de pin handmatig zakken zonder contact te maken met de sensor. Activeer de Z0-detectiemodus (figuur 3).
   5. Selecteer de eindfreesbit van 200 μm en verplaats deze naar de x, y-oorsprong. Verwijder de z-sensor. Laat het bit voorzichtig zakken zonder in contact te komen met het acryloppervlak.
   6. Draai de 200 μm eindfreesbit op 14.500 tpm. Laat het langzaam zakken naar de oorsprongscoördinaat op de z-as (z = 0). Reset de z-as 30 μm onder de oorsprong. Stel deze coördinaat in als de nieuwe z-origin.
      OPMERKING: Verlaag het bit nooit als het niet draait. Anders dreigt het te breken.
   7. Klik op de knop Knippen in de software van de micromolenmachine om het snijpaneel te activeren. Klik op de knop Toevoegen en selecteer het .txt bestand (Supplemental Coding File 1) met een eerder gemaakte code voor het slijpen van het acryloppervlak. Klik op de knop Uitvoer om het proces te starten.
   8. Breng het eindfrebit naar de coördinaat waar de beperking wordt bewerkt. Voorkom dat de eindfreesbit van het grondoppervlak wordt getild zodra deze coördinaat is bereikt door op de knop Pauze te klikken. Verplaats anders de eindfrebit handmatig naar deze coördinaat (figuur 4A).
2. Frezen van de 5 μm beperking
   1. Stel de rotatiesnelheid van de eindfrees in op 11.000 tpm. Verhoog het platform 6,5 μm met de interface van het piëzo-elektrische platform (aanvullende figuur S1). Beweeg de eindfreesbit langs de y-as met 500 μm. Breng het piëzo-elektrische platform terug naar de beginwaarde op de z-as met de besturingsinterface.
3. Frezen van microkanalen
   1. Open het eerder gemaakte ontwerpbestand vanuit de ontwerpsoftware (Supplemental Design File 1). Klik op de knop Afdrukken . Open het menu Eigenschappen en klik op het kleurenvenster dat overeenkomt met de laag met het te bewerken ontwerp. Stel de fabricageparameters in het deelvenster Gereedschap in zoals opgegeven in Aanvullende afbeelding S2.
   2. Activeer ongewenste lagen door de optie Geen te selecteren in het vervolgkeuzemenu Extra .
4. Frezen van gaten
   1. Schakel over naar de 800 μm eindmolenbit. Activeer de ontwerplaag van de gaten met een diameter van 1,2 mm door op het bijbehorende kleurenvenster te klikken.
   2. Herhaal stap 1.3.2., maar stel in dit geval de overeenkomstige fabricageparameters in zoals beschreven in aanvullende figuur S3A voor de gaten.
      OPMERKING: De diepte van de bewerkte gaten is de helft van de acryldikte.
   3. Werk twee extra gaten op contralaterale hoeken van de rechthoek om de acryl omgekeerd uit te lijnen op een nieuw platform (figuur 4B). Verwijder de acrylrechthoek van het piëzo-elektrische platform. Draai het acrylaat om en plak het met dubbelzijdig plakband over de adapter met de bewerkte pilaren (figuur 4C, D).
   4. Open het bestand met het ontwerp van de gaten voor het tegenovergestelde vlak van de ontwerpsoftware (Supplemental Design File 2). Stel de bijbehorende fabricageparameters in zoals beschreven in aanvullende figuur S3B. Frees de resterende helft van de reagensinlaat- en uitlaatgaten met een diameter van 1,5 mm en een diepte van 0,7 mm (aanvullende figuur S3C).

Figuur 1: Plaatsing van de eindfrebit. (A) De eindfrebits van 200 μm en 800 μm worden door een schroef op de stalen steun geplaatst en bevestigd. (B) Elke eindfreesbit wordt in het specifieke compartiment van de micromolenmachine geplaatst voor automatische selectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Piëzo-elektrisch platform. Het platform is vervaardigd door 3D-printen en bestaat uit twee zeshoekige bases verbonden door scharnieren die een fijne verplaatsing in de z-as mogelijk maken, bestuurd door drie piëzo-elektrische actuatoren. Er wordt ook een acryladapter waargenomen, waarop de PMMA-rechthoek is bevestigd en die het mogelijk maakt om de uitlijningshoek van de coördinaten in te stellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Z-as kalibratie. De stappen van de z-askalibratie zijn gedetailleerd. (A) De z-sensor bevat een kabel die op de micromolenmachine wordt aangesloten. (B) De sensor wordt direct op het te bewerken oppervlak geplaatst. (C) De detectiepen bestaat uit een metalen staaf die in een speciaal compartiment naast de eindfresbits is geplaatst. (D) Wanneer beide accessoires in contact komen, berekent de micromolenmachine automatisch de oorsprongscoördinaat op de z-as. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Gerectificeerd acryloppervlak. (A) De eindfreesbit met een diameter van 200 μm veegt het gehele oppervlak van de acrylrechthoek en verwijdert een laag van ongeveer 30 μm hoog. (B) De afbeelding toont de verschillende structuren die op de voorkant van het eerder gerectificeerde acryl zijn gefreesd. Kanalen en gaten voor reagensinlaat en -uitlaat worden waargenomen. De beperking van 5 μm is niet met het blote oog te zien. (C) Micromilled oppervlak met uitlijningsgaten en adapter met uitlijningsstijlen op tegenovergestelde hoeken. (D) Het acrylaat wordt ondersteboven op de adapter uitgelijnd met pilaren, waarin de uitlijningsgaten passen. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

2. Kanaalafdichting

1. Acryl reiniging
   1. Verwijder de rechthoek acryl van het platform van de pijleradapter. Neem nog een onbewerkte acrylrechthoek. Was beide acrylplaten met isopropylalcohol (IPA) en spoel af met gedestilleerd water. Draag handschoenen en vermijd contact met IPA.
   2. Dompel het acryl onder in een ultrasoon bad gedurende 10 minuten (figuur 5A, B).
2. Blootstelling aan gasvormig chloroform
   1. Droog beide acrylplaten perfect. Plak ze aan de binnenkant van een glazen petrischaaldeksel met dubbelzijdige tape. Zorg ervoor dat u de zijkant van het bewerkte kanaal bloot legt (figuur 5C). Draag handschoenen en raak het acryloppervlak niet direct aan.
   2. Plaats de basis van de glazen petrischaal in een grotere glazen petrischaal (figuur 5D). Giet 1 ml chloroform in de basis van de petrischaal. Plaats het deksel snel met de acrylplaten bevestigd aan de binnenkant.
   3. Voeg onmiddellijk gedestilleerd water toe aan de basis van de grotere petrischaal tot het niveau van het petrischaaldeksel. Laat het acrylaat gedurende 1 minuut aan chloroformgas ontsnappen (figuur 5E).
      OPMERKING: Houd er rekening mee dat een langere blootstellingstijd aan chloroform het acryloppervlak zal aanvallen en dat de beperking van 5 μm zal smelten, de hoogte ervan zal wijzigen of volledig zal verdwijnen.
   4. Kantel de petrischaal om de ontstane waterafdichting te verbreken. Verwijder het acrylaat onmiddellijk uit de chloroform door de petrischaal bloot te leggen. Pas op dat je het water niet morst.
      LET OP: Doe dit proces in de zuurkast en gebruik handschoenen omdat chloroform zeer giftig is.
3. Verlijmen door persen en verwarmen
   1. Pel beide acrylplaten van de dubbelzijdige tape.
   2. Lijn beide acrylverf uit met de zijden die werden blootgesteld aan gasvormig chloroform van aangezicht tot aangezicht, waardoor een sandwich wordt gevormd. Plaats de acrylverf in de pers op 18 kgf/cm² en een temperatuur van 90 °C (figuur 5F,G).
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het acryl in de lengterichting uitgelijnd te plaatsen en de uitlijning na 2 minuten te wijzigen voor een betere afdichting. Als de afdichting na deze tijd onvoldoende is, plaats deze dan terug in de pers voor intervallen van niet meer dan 1 min. Controleer met behulp van de stereoscoop de status van de kanalen en de beperking. Bedenk dat, in geval van overschrijding van de perstijd, er een risico bestaat op het elimineren van de beperking.
4. Slangbevestiging
   1. Snijd 2-3 cm lengtes van de slang. Maak een volledig rechte snede. Bevestig elke slang aan de gaten van het apparaat met directdrogende vloeibare lijm (figuur 6A). Voorkom dat de lijm in de chip komt.

Figuur 5: Afdichtingsproces van het apparaat. (A) Elk van de acrylplaten wordt in een hersluitbare zak met gedestilleerd water geplaatst en ondergedompeld in het ultrasone bad. (B) De afbeelding aan de linkerkant toont de kanalen net na de fabricage, en de afbeelding aan de rechterkant toont hetzelfde apparaat na het wassen met IPA en het ultrasone bad, die alle onzuiverheden en acrylresten uit het microkanaal verwijdert. De randen van de beperking die het centrale kanaal van 200 μm onderbreekt, worden waargenomen, wat het succesvolle freesproces bevestigt. Schaalstaven = 500 μm. (C) Beide acrylverf wordt gedroogd en op het glazen platform op het deksel geplakt. (D) De basis van de petrischaal wordt in een andere schaal met een grotere diameter geplaatst. (E) Bij het sluiten van de petrischaal voorkomt de waterafdichting dat gasvormig chloroform ontsnapt. (F) Beschrijving van de elementen van de hendel met een gewicht van 5 kg. (G) Afbeelding van de open hendel, die in rood het gebied toont waar het acrylaat is geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Voorbereiding van het apparaat

1. Vul de kanalen met gedestilleerd water met behulp van een spuit. Zorg ervoor dat er geen lekken of weerstand tegen stroming zijn. Dompel het apparaat gedurende 10 minuten onder in een ultrasoon bad om achtergebleven acryl, lijm of ongewenst materiaal in de kanalen te verwijderen.
2. Leeg het water in de kanalen van het apparaat. Gebruik een spuit om een blokkerende oplossing te introduceren die is bereid met 5% (w /v) runderserumalbumine (BSA) verdund in 1x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) en eerder gefilterd door een 0,2 μm polyethersulfon (PES) spuitfilter.
3. Bereid een suspensie van ijzeren microdeeltjes met een diameter van 7,5 μm in 5% BSA.
   OPMERKING: De microdeeltjes zijn eerder gefunctionaliseerd met een silica-polyethyleenglycol (PEG) laag die weerstand biedt tegen eiwitabsorptie⁴.
4. Incubeer de chip en de microdeeltjessuspensie met de blokkerende oplossing gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur. Laat indien mogelijk een nacht blokkeren bij 4 °C.

4. Vorming van microdeeltjesval

1. Steek de microdeeltjes in de chip met een spuitnaald door de uitlaatslang aan de zijkant. Plaats de chip verticaal en laat de microdeeltjes onder invloed van de zwaartekracht door het zijkanaal stromen. Draai de chip 180° in twee stappen van 90° en laat de microdeeltjes richten en compacteren op de 5 μm beperking.
2. Verwijder overtollige microdeeltjes door de zwaartekracht 45° naar het zijkanaal te draaien.
3. Houd het apparaat rechtop om te voorkomen dat de microdeeltjesval ongedaan wordt gemaakt. Zie figuur 6B voor een samenvatting van het vormingsproces van de microdeeltjesval.

5. Immunoassay

1. Nanodeeltjes voorbereiding
   1. Neem 2 μL van de suspensie van 100 nm nanodeeltjes die eerder zijn geconjugeerd met lysozym (antigeenmodel). Voeg het toe aan een microcentrifugebuis van 1,5 ml met 100 μL blokkeringsoplossing. Incubeer een nacht bij 4 °C.
   2. Voeg 150 μL wasbuffer toe (1x TBS, 0,05% Tween 20).
   3. Plaats de microcentrifugebuis van 1,5 ml in een magnetische afscheider. Gedurende 15 minuten bewaren om de nanodeeltjes te scheiden (aanvullende figuur S4).
      OPMERKING: Het minimumvolume voor de magnetische separator is 200 μL. Vermijd het gebruik van een kleiner volume.
   4. Verwijder de vloeistof uit de buis met een micropipette. Vermijd contact met de wand van de buis waar de nanodeeltjeskorrel is gevormd.
   5. Voeg 250 μL verse wasbuffer toe. Houd de buis 15 min onder roeren.
   6. Herhaal stap 5.1.3.-5.1.5. 2x meer, slechts 5 minuten schudden.
   7. Voeg de gewenste concentratie van primair anti-lysozymantilichaam toe (zie de materiaaltabel). Stel in op een eindvolume van 100 μL antilichaamverdunningsmiddel (1x TBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20).
   8. Incubeer gedurende 15 min bij 37 °C. Blijf nog eens 15 minuten schudden bij kamertemperatuur.
   9. Herhaal de wasstappen 5.1.2.-5.1.6.
   10. Voeg 100 μL antilichaamverdunningsmiddel toe. Voeg het mierikswortelperoxidase-gekoppeld secundair antilichaam (HRP-AbII) (zie de tabel met materialen) toe bij een verdunning van 1:500.
   11. Herhaal de wasstappen 5.1.2.-5.1.6.
   12. Bewaar de nanodeeltjes in een eindvolume van 50 μL antilichaamverdunningsmiddel.

6. Experimentele montage

1. Vul de twee glazen spuiten van 100 μL met water, sluit een 6,5 cm lange slang aan op elke spuit, steek een metalen pin in het uiteinde van de slang en plaats beide spuiten op de computergestuurde spuitpomp.
2. Sluit alle slangen van het acrylapparaat af met warmte.
3. Snijd de inlaatslang door en bewaar slechts enkele millimeters. Vul de doseernaald met wasbuffer en steek deze in de gesneden slang. Laat de oplossing druppelen voordat u de naald op het apparaat aansluit om luchttoegang tot het apparaat te voorkomen.
4. Knip de uitlaatslang uit het zijkanaal. Sluit aan op de spuitpomp. Voer vervolgens dezelfde procedure uit voor de uitlaatslang van het hoofdkanaal.
   OPMERKING: Het is belangrijk om stappen 6.3.-6.4 uit te voeren. in deze volgorde om te voorkomen dat de microdeeltjesval wordt uitgepakt. Controleer indien mogelijk de status van de val tijdens deze stappen met behulp van een vergrootglas.
5. Plaats een glasglaasje op het microscooppodium. Bevestig de magneet aan de dia met dubbelzijdige tape en plaats een klein stukje tape aan elke kant om de spaanranden aan het glas te bevestigen.
6. Stel een debiet in van 50 μL/h via de tabbladen Debiet en Eenheden in de pompregelaar van de spuit. Selecteer de opnamemodus en klik op de knop Start om de stroom van de wasbuffer te activeren.
7. Benader het apparaat voorzichtig naar de dia met de magneet op een horizontale manier, zodat het gebied van de chip met de val contact maakt met de magneet.
8. Plak de randen van het apparaat met dubbelzijdige tape op het glas om beweging te voorkomen. Vermijd het belemmeren van het optische pad voor microscopie (figuur 6C).

Figuur 6: Definitieve configuratie van het apparaat. (A) Acrylapparaat met de slangen aangesloten op de overeenkomstige in- en uitgangen. De schaal toont de afmetingen van het apparaat in centimeters. B) Protocol voor de vorming van de houder van microdeeltjes. Microdeeltjes stromen door de zwaartekracht door het kanaal wanneer het apparaat in een verticale positie wordt geplaatst. Microdeeltjes worden geconcentreerd bij de 5 μm-beperking. Overtollige microdeeltjes kunnen eenvoudig worden verwijderd door de chip door het zijkanaal te draaien. De chip wordt verticaal gehouden om de val te behouden voor immunoassay. (C) Microfluïdisch apparaat gemonteerd op een glazen dia met de magneet, op het podium van de omgekeerde fluorescentiemicroscoop. De doseernaald waardoor de reagentia worden toegevoegd, wordt geobserveerd, evenals de uitlaatslangen die op een spuitpomp worden aangesloten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

7. Immunodetectie

1. Laat de wasbuffer gedurende 10 minuten stromen bij 50 μL/h om overtollige BSA te verwijderen.
2. Verwijder de resterende wasbuffer van de doseernaald met een micropipette. Voeg 50 μL van de suspensie van het nanodeeltje toe.
3. Laat de suspensie van nanodeeltjes gedurende 7 minuten stromen met een stroomsnelheid van 100 μL/h. Wijzig vervolgens het debiet in 50 μL/h en debiet gedurende nog eens 15 minuten.
4. Vervang de doseernaald. Laat de wasbuffer gedurende 10 min vloeien bij 50 μL/h. Bereid het fluorogene substraat volgens de specificaties van de fabrikant tijdens de wasstap.
5. Verwijder de resterende wasbuffer van de doseernaald met een micropipette. Voeg 100 μL van het fluorogene substraat toe (zie de materiaaltabel). Laat het fluorogene substraat gedurende 6 minuten bij 50 μL/h stromen.
6. Stel de meetparameters debiet (1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h en 10 μL/h) en tijd (6 min) in op de overeenkomstige tabbladen Debiet en Timer instellen van de interface die de spuitpomp besturen. Zorg ervoor dat u de opnamemodus selecteert voor elk van de uit te voeren metingen.
7. Stel een extra tabblad Debiet in op 50 μL/h en Stel Timer in op 3 min voor de wasstap.
8. Schakel de fluorescentie van de microscoop 15 s voordat het substraat bij 50 μL/h stopt. Start de opname met de foto met de software van de microscoopcamera 10 s voordat het substraat stopt met een belichtingstijd van 1.000 milliseconden. Voer gedurende 6 minuten beeld uit bij 1 frame/s (FPS).
9. Klik op de knop Start van de gewenste debietparameter onmiddellijk nadat het substraatwasdebiet bij 50 μL/h stopt. Klik op de knop Start van de wasstroom (50 μL/h) onmiddellijk nadat de geselecteerde meetstroom stopt.
10. Stop de opname van het beeld en schakel de fluorescentie van de microscoop uit om fotobleaching van het substraat te voorkomen.
11. Herhaal stap 7.8.-7.10. voor elk gebruikt meetdebiet.

Results

Het was mogelijk om een zeer reproduceerbaar fabricageprotocol op te stellen dat de resolutie van de conventionele micromolentechniek verbetert. Met behulp van dit protocol wordt de fabricage bereikt van een kanaal zo klein als 5 μm hoog dat werkt als een gespreide beperking in een 200 μm hoog kanaal. Het eenvoudige ontwerp van de verspringende beperking vangt ijzeren microdeeltjes op met een diameter van 7,5 μm die, wanneer ze in het microkanaal worden samengeperst, de creatie van een magnetische val mogelijk maken wann...

Discussion

Een acryl microfluïdisch apparaat voor immunoassays met behulp van nanodeeltjes als immunosupport werd gefabriceerd met behulp van een micromilling-techniek. De methode van directe productie op het substraat heeft het voordeel dat het gebruik van een hoofdmatrijs en de tijd en kosten die dit met zich meebrengt, wordt vermeden. Het is echter beperkt tot rapid prototyping en de productie van grote hoeveelheden apparaten.

Hier gebruikten we een eerder gemeld accessoire piëzo-elektrisch platform v...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.008 Endmill	KYOCERA SGS	2204	2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12
0.032 Endmill	KYOCERA SGS	2228	2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12
Carbonyl-iron microparticles	Sigma-Aldrich	44890	7 μm
Chloroform	Fermont	6201	Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate
CMOS camera Moment	Teledyne Photometrics		Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2
Dr Engrave Software	Roland DGA Corporation		Engraving software om het graveerpad op het oppervlak te ontwerpen en te creëren
Extraction hood	Onbekend	Onbekend
Flexible Plastic Tubing	Tygon	AAD04103	ID = 0.020, OD = 0.060
Fluorescence microsope	ZEISS	Axio Vert.A1
High Precision Dispense Needle	Loctite	98612
Homemade piezoelectric controller application	LabView		Zie referentie 12 voor meer details.
Loctite 495 instant adhesive	Henkel	49503	Aanbrengen met micropipettip of doseernaald
MagJET Separation Rack	thermoscientific		12 x 1.5 mL
Mechanic press	Home-made
Milling Machine	Roland	MDX-50
Piezoelectric platform	Home-made		Zie referentie 12
Polymethylmethacrylate - Sheet - PMMA, Acrylic	Goodfellow	ME303018/1	Dikte: 1,3 mm, Transparantie: Helder/Transparant
PVCamTest software	Teledyne Photometrics	Version 3.10.107	Beeldverwervingssoftware
Stereo microscope	Nikon	SMZ 7457
SuperMag Carboxyl Beads	Ocean NanoTech	KSC0100	100 nm
Syringe pump	kd Scientific	KDS200	Kan tot twee spuiten bevatten
Utrasonic bath	Branson	2800
VPanel software	Windows OS	Version 1.0.3.0	Software voor het besturen van de microfreesmachine