Patiënten met ernstige peritoneale fibrose hebben een hoge morbiditeit en mortaliteit. Het mechanisme van peritoneale fibrose is onduidelijk. In deze studie beschrijven we een eenvoudig experimenteel muizenmodel van peritoneale fibrose geïnduceerd door de injectie van peritoneale dialysevloeistof.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een klinisch relevant muizenmodel van peritoneale fibrose door dialysaat en katheters
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Peritoneale fibrose kan optreden bij patiënten die peritoneale dialyse (PD) ondergaan en patiënten met ernstige peritoneale fibrose hebben een hoge morbiditeit en mortaliteit. Peritonitis, peritoneale dialysevloeistof met een hoog glucosegehalte en een lange periode van PD versnellen het begin van peritoneale fibrose. Een dierstudie van peritoneale fibrose is nodig vanwege de beperkingen van studies bij mensen en in vitro-studies . De meeste diermodellen bootsen echter geen klinische aandoeningen na. Om peritoneale fibrose te bestuderen, ontwikkelden we een klinisch relevant muizenmodel door een peritoneale katheter te implanteren en gedurende 21 dagen dagelijks 2,5% PD-vloeistof met een hoog glucosegehalte plus 20 mM methylglyoxal (MGO) in de peritoneale holte te injecteren. Implantatie van de peritoneale katheter voorkomt peritoneaal letsel door naalden en bootst klinische PD-patiënten na. Immunofluorescentiekleuring toonde aan dat myofibroblasten zich ophoopten in het fibrotische peritoneum. De experimentele groep had een lager ultrafiltratievolume en een lagere peritoneale membraantransportfunctie (peritoneale evenwichtstest). In dit artikel geven we een gedetailleerd protocol van het model.
Inleiding
Peritoneale dialyse (PD) is een vorm van niervervangende therapie die door ongeveer 11% van de patiënten met nierziekte in het eindstadium (ESRD) wordt ontvangen1. Studies hebben gemeld dat peritoneale fibrose zich ontwikkelt bij patiënten die PD2 krijgen. Het inkapselen van peritoneale sclerose (EPS), een ernstige vorm van peritoneale fibrose, resulteert in hoge morbiditeit en mortaliteit3. De risicofactoren van peritoneale fibrose zijn onder meer peritonitis, peritoneale dialysevloeistof met een hoog glucosegehalte, een lange periode van PD en genetische factoren4. Het mechanisme van peritoneale fibrose omvat complexe veranderingen in de peritoneale micro-omgeving en overspraak tussen verschillende celtypen. In vitro experimenten en klinische observaties beperken zich tot het verschaffen van mechanistische inzichten in peritoneale fibrose, en diermodellen zijn nodig. Proefdieren zoals honden, konijnen, varkens, ratten en muizen worden meestal gebruikt in onderzoek naar ziekten bij de mens5, waarvan muizen het meest worden gebruikt vanwege de voordelen van hun kleine formaat, lage kosten en het gemak van experimenteren. Bovendien kunnen specifieke cellen worden bestudeerd in ziektemodellen van muizen met behulp van technieken voor het traceren van afstamming.
Het opstellen van een geschikt diermodel zou nuttig zijn bij het begrijpen van de pathofysiologie van peritoneale fibrose. Idealiter zou dit model goedkoop moeten zijn, gemakkelijk te reproduceren moeten zijn en de basis moeten vormen voor de klinische behandeling van peritoneale fibrose.
Momenteel beschikbare diermodellen van peritoneale fibrose worden opgesteld met de intra-peritoneale injectie van PD-vloeistof met een hoog glucosegehalte dagelijks gedurende 28 dagen, chloorhexidinegluconaat (CG) driemaal per week gedurende 3 weken, of een enkele dosis natriumhypochloriethypochloriet 6,7,8. Deze modellen hebben echter beperkingen. De injectie van PD-vloeistof met een hoog glucosegehalte, hoewel zeer relevant voor de klinische praktijk, induceert slechts milde peritoneale fibrose en slaagt er niet in de klinische aandoeningen van ernstige peritoneale fibrose, zoals EPS, te recapituleren. CG of hypochloriet kan ernstige peritoneale fibrose veroorzaken die EPS nabootst door chemisch letsel9. CG en hypochloriet kunnen echter peritoneaal letsel en fibrose veroorzaken via andere mechanismen dan PD-vloeistof met een hoog glucosegehalte.
Deze studie beschrijft het protocol voor het ontwikkelen van een muizenmodel van peritoneale fibrose. In dit model wordt eerst een PD-katheter ingebracht en vervolgens worden gedurende 21 dagen dagelijkse injecties met PD-vloeistof met een hoog glucosegehalte plus methylglyoxal (MGO) uitgevoerd. MGO is een giftig glucoseafbraakproduct in PD-vloeistof en bevordert de vorming van geavanceerde glycatie-eindproducten, die ontstekingen en angiogenese veroorzaken10,11. De toevoeging van MGO aan PD-vloeistof met een hoog glucosegehalte induceert de accumulatie van myofibroblasten en bevordert peritoneale fibrose. Dit model bootst dus klinische aandoeningen na.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De experimenten werden goedgekeurd en uitgevoerd door het National Taiwan University College of Medicine en het College of Public Health Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alle muizen werden gehuisvest onder de standaardzorg.
1. Dierproeven
- Gebruik mannelijke en vrouwelijke C57BL/6 wildtype (WT) muizen ouder dan 11 weken.
- Bereid de chirurgische materialen voor, waaronder een muis 4-Franse siliconen poort, handschoenen, lakens, katheters, hechtingen en naalden.
- Implanteer de muispoort als volgt:
- Verdoof de muizen met ketamine/xylazine (100/10 mg/kg lichaamsgewicht) via subcutane injectie.
- Controleer de ademhalingsfrequentie en de diepte van de anesthesie van de muizen tijdens de operatie om de anesthesieomstandigheden te garanderen.
OPMERKING: Als de ademhalingsfrequentie van de muizen snel en kort wordt, voeg dan 20% van de vorige dosis toe.
- Controleer de ademhalingsfrequentie en de diepte van de anesthesie van de muizen tijdens de operatie om de anesthesieomstandigheden te garanderen.
- Plaats de muizen tijdens de narcose in buikligging. Scheer en reinig een gebied van 2 cm x 3 cm groot op de linkerrug voor een operatie en desinfecteer de huid met povidon-jodium.
- Maak een incisie van 1,5 cm in de huid op de linkerrug.
- Snijd voorzichtig tussen de huid en de spier op de linkerrug om een ruimte van 1 cm x 2 cm te creëren om de muispoort te implanteren.
- Perforeer een klein gaatje over de linkerrugspier.
- Steek het totale 4-Franse distale deel van de muispoort in de peritoneale holte
- Hecht (4-0 nylon) de wortel van de muispoort aan de rugspier.
- Plaats de kop van de muispoort tussen de huid en de rugspier.
- Sluit de huid af met reflexclips (7 mm).
OPMERKING: Reflexclips zijn beter dan hechtingen omdat muizen vaak in de wond bijten. - Start het experiment na 7 dagen implantatie van de muispoort. Verdeel de muizen willekeurig in experimentele en controlegroepen.
- Desinfecteer de huid op de toegangsplaats met povidon-jodium voordat u vloeistof injecteert.
- Injecteer de PD-vloeistof (PDF)-groep met 2,5% PD-vloeistof en 20 mM MGO in een totaal van 2 ml intraperitoneaal per dag gedurende 21 dagen. Injecteer de controlegroep met normale zoutoplossing (NS).
- Verdoof de muizen met ketamine/xylazine (100/10 mg/kg lichaamsgewicht) via subcutane injectie.
2. Peritoneale functietest (peritoneale evenwichtstest)
- Bereid 2,5% PD-vloeistof (2 ml) en meet de glucoseconcentratie van de PD-vloeistof, gedefinieerd als initiële glucoseconcentratie (D0).
- Injecteer de PD-vloeistof in de muispoort.
- Offer de muizen na 30 minuten via een overdosis isofluraan (100%).
- Vang de intra-abdominale vloeistof op met een spuit en meet vervolgens het vloeistofvolume, gedefinieerd als het ultrafiltratievolume.
- Meet de glucoseconcentratie van de intra-abdominale vloeistof, gedefinieerd als de uiteindelijke glucoseconcentratie (D).
- Bereken het peritoneale evenwicht of de peritoneale functie12.
OPMERKING: Peritoneale evenwichtstest12 = Finale PD-vloeistofglucoseconcentratie (D)/ Initiële PD-vloeistofglucoseconcentratie (D0). De glucoseconcentratie wordt gedetecteerd door de hexokinasemethode met een biochemische analysator13.
3. Weefselpreparatie en histologische analyse
- Verzamel de peritoneale weefsels: rechter bovenbuikwand (1 cm x 1 cm) en lever. Fixeer het peritoneale weefsel met 4% paraformaldehyde gedurende 2 uur en vervolgens een nacht in 18% sucroseoplossing7.
- Bereid 4 μm dikke bevroren delen van peritoneaal weefsel voor en voer histologische analyse uit zoals eerder gepubliceerd7.
- Voer immunofluorescentiekleuring uit.
- Gebruik primaire antilichamen tegen de volgende eiwitten voor immunolabeling: α-gladde spieractine (SMA; 2 uur, 1:200) voor het detecteren van myofibroblasten, cytokeratine (2 uur, 1:200) voor het detecteren van mesotheelcellen, en 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) (5 min, 1:1000) voor het detecteren van celkernen.
- Druk de verkregen gegevens uit in een geschikt formaat.
OPMERKING: In dit onderzoek werden de gegevens uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van geschikte statistische analysesoftware (Table of Materials) en de statistische significantie werd geëvalueerd door middel van eenrichtings-ANOVA of t-toets.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De histologie van het peritoneale weefsel werd onderzocht, waaruit bleek dat peritoneale fibrose met succes werd geïnduceerd in de PD-vloeistof plus MGO (PDF)-groep. Immunofluorescentiekleuring van het viscerale peritoneum van het leveroppervlak toonde meer myofibroblastaccumulatie in het beschadigde peritoneum van de PDF-groep dan in de controlegroep (Figuur 1). Zoals te zien is in figuur 2A, had de PDF-groep een lager ultrafil...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het peritoneum heeft een visceraal en pariëtaal peritoneum, dat de buikorganen en buikwanden bedekt. Het is samengesteld uit een monolaag van mesotheelcellen, een submesotheellaag, serosa, fibroblasten, lymfocyten en uitgescheiden eiwitten14. Peritoneale fibrose is het verlies en de denudatie van mesotheelcellen, submesotheliale verdikking en de ophoping van veel ontstekingscellen, zoals myofibroblasten en macrofagen 4,14
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door het National Taiwan University Hospital (NTUH) 111-UN0026.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| anti-wide spectrum Cytokeratin antibody | abcam | ab9377 | |
| Beckman Coulter | Beckman Coulter | AU5800 | Biochemische analyzer |
| DAPI, 4′,6-diamidino-2-fenylindole antilichaam | Sigma-Aldrich | 98718-90-3 | |
| Gordyn | elke | ||
| FITC geit anti-konijn | Jackson ImmunoResearch Secundair Antilichaam | 111-095-144 | |
| Handschoenen | elke | ||
| GraphPad Prizm | GraphPad Software | GraphPad Software 9.0 | |
| Kellys | elke | ||
| Methylglyoxal (MGO) | Sigma-Aldrich | ||
| Mini-UTE Muispoort | Access Technologies | MMP-4S 061108B | Muis 4-French siliconen poort |
| Monoklonaal anti-actine, α-gladde spier-Cy3 antilichaam | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Naalden | elke | ||
| Reflexklemmen 7 mm | elke | ||
| Hechtdraad 4-0 Nylon | elke |
Referenties
- Jain, A. K., Blake, P., Cordy, P., Garg, A. X. Global trends in rates of peritoneal dialysis. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 533-544 (2012).
- Zhou, Q., Bajo, M. A., Del Peso, G., Yu, X., Selgas, R. Preventing peritoneal membrane fibrosis in peritoneal dialysis patients. Kidney International. 90 (3), 515-524 (2016).
- Brown, M. C., Simpson, K., Kerssens, J. J., Mactier, R. A. Scottish Renal Registry. Encapsulating peritoneal sclerosis in the new millennium: A national cohort study. ClinicalJournal of the American Society of Nephrology. 4 (7), 1222-1229 (2009).
- Aroeira, L. S., et al. Epithelial to mesenchymal transition and peritoneal membrane failure in peritoneal dialysis patients: Pathologic significance and potential therapeutic interventions. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2004-2013 (2007).
- Yang, B., et al. Experimental models in peritoneal dialysis (Review). Experimental and Therapeutic Medicine. 21 (3), 240(2021).
- Pawlaczyk, K., et al. Animal models of peritoneal dialysis: Thirty Years of our own experience. BioMed Research International. 2015, 261813(2015).
- Chen, Y. T., et al. Lineage tracing reveals distinctive fates for mesothelial cells and submesothelial fibroblasts during peritoneal injury. Journal of the American Society of Nephrology. 25 (12), 2847-2858 (2014).
- Yokoi, H., et al. Pleiotrophin triggers inflammation and increased peritoneal permeability leading to peritoneal fibrosis. Kidney International. 81 (2), 160-169 (2012).
- Hoff, C. M. Experimental animal models of encapsulating peritoneal sclerosis. Peritoneal Dialysis International. 25, Suppl 4 57-66 (2005).
- Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrology Dialysis Transplantation. 24 (2), 437-447 (2009).
- Nagai, T., et al. Linagliptin ameliorates methylglyoxal-induced peritoneal fibrosis in mice. PLoS One. 11 (8), 0160993(2016).
- Kakuta, T., et al. Pyridoxamine improves functional, structural, and biochemical alterations of peritoneal membranes in uremic peritoneal dialysis rats. Kidney International. 68 (3), 1326-1336 (2005).
- Barthelmai, W., Czok, R. Enzymatic determinations of glucose in the blood, cerebrospinal fluid and urine. Klinische Wochenschrift. 40, 585-589 (1962).
- Williams, J. D., et al. Morphologic changes in the peritoneal membrane of patients with renal disease. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (2), 470-479 (2002).
- Hurst, S. M., et al. Il-6 and its soluble receptor orchestrate a temporal switch in the pattern of leukocyte recruitment seen during acute inflammation. Immunity. 14 (6), 705-714 (2001).
- Pawlaczyk, K., et al. Vascular endothelial growth factor in dialysate in relation to intensity of peritoneal inflammation. The International Journal of Artificial Organs. 31 (6), 535-544 (2008).
- Loureiro, J., et al. Blocking TGF-beta1 protects the peritoneal membrane from dialysate-induced damage. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (9), 1682-1695 (2011).
- Margetts, P. J., et al. Transforming growth factor beta-induced peritoneal fibrosis is mouse strain dependent. Nephrology, Dialysis Transplantation. 28 (8), 2015-2027 (2013).
- Huang, J. W., et al. Tamoxifen downregulates connective tissue growth factor to ameliorate peritoneal fibrosis. Blood Purification. 31 (4), 252-258 (2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
