Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Meting van endotheelafhankelijke vasorelaxatie in de thoracale aorta van de muis met behulp van tensometrische kamermyografie met klein volume

3.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63918

⸱

12 augustus 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, College of Graduate Studies, Midwestern University, 2Department of Child Health, College of Medicine-Phoenix, University of Arizona, Phoenix

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft de concepten en technische toepassing van de tensometrische myograaftechniek met behulp van een meerkamermyograafsysteem in de experimentele ex vivo beoordeling van de aorta-endotheelfunctie van muizen.

Samenvatting

Tensometrische myografie met een kleine volumekamer is een veelgebruikte techniek om de vasculaire contractiliteit van kleine en grote bloedvaten bij proefdieren en kleine slagaders geïsoleerd uit menselijk weefsel te evalueren. De techniek stelt onderzoekers in staat om geïsoleerde bloedvaten te behouden in een strak gecontroleerde en gestandaardiseerde (bijna-fysiologische) omgeving, met de mogelijkheid om zich aan te passen aan verschillende omgevingsfactoren, terwijl ze de geïsoleerde bloedvaten uitdagen met verschillende farmacologische middelen die vasoconstrictie of vaatverwijding kunnen induceren. De myograafkamer biedt ook een platform om vasculaire reactiviteit te meten als reactie op verschillende hormonen, remmers en agonisten die de functie van gladde spieren en endotheellagen afzonderlijk of tegelijkertijd kunnen beïnvloeden. De bloedvatwand is een complexe structuur die bestaat uit drie verschillende lagen: de intima (endotheellaag), media (gladde spier- en elastinevezels) en adventitia (collageen en ander bindweefsel). Om een duidelijk inzicht te krijgen in de functionele eigenschappen van elke laag, is het van cruciaal belang om toegang te hebben tot een experimenteel platform en systeem dat een gecombineerde benadering mogelijk maakt om alle drie de lagen tegelijkertijd te bestuderen. Een dergelijke benadering vereist toegang tot een semi-fysiologische toestand die de in vivo omgeving in een ex vivo omgeving zou nabootsen. Tensometrische myografie met kleine volumes heeft een ideale omgeving geboden om de impact van omgevingssignalen, experimentele variabelen of farmacologische agonisten en antagonisten op vasculaire eigenschappen te evalueren. Al vele jaren gebruiken wetenschappers de tensometrische myograaftechniek om de endotheelfunctie en gladde spiercontractiliteit te meten als reactie op verschillende middelen. In dit rapport wordt een tensometrisch myometrisch myograafsysteem met een kleine volumekamer gebruikt om de endotheelfunctie in de geïsoleerde muisaorta te meten. Dit rapport richt zich op hoe tensometrische myografie van de small volume chamber kan worden gebruikt om de functionele integriteit van het endotheel in kleine segmenten van een grote slagader zoals de thoracale aorta te evalueren.

Inleiding

De laatste decennia is het kleine kamermyografiesysteem gebruikt om de reactiviteit van verschillende lagen bloedvatwanden te meten als reactie op verschillende farmacologische middelen en neurotransmitters in een ex vivo, real-time setting. Vasculaire reactiviteit is een belangrijk onderdeel van een gezond functioneel bloedvat en is van cruciaal belang voor de regulatie van de bloedstroom en perfusie in perifere en cerebrale vasculatuur1. Binnen de bloedvatwand is de interactie tussen endotheel- en gladde spierlagen een belangrijke determinant van de vasculaire tonus, die ook voortdurend wordt beïnvloed door structurele veranderingen in de bindweefsellaag rond de bloedvatwand (adventitia).

De endotheellaag regelt vasomotie door een paar vaatverwijdende factoren vrij te geven, waaronder stikstofmonoxide (NO), prostacycline (BGA2) en van endotheel afgeleide hyperpolariserende factor (EDHF), of door vasoconstrictieve middelen zoals endotheline-1 (ET-1) en tromboxaan (TXA2)2,3,4 te produceren. Onder deze factoren is NO uitgebreid bestudeerd en de belangrijke regulerende rollen in andere kritieke cellulaire functies zoals ontsteking, migratie, overleving en proliferatie zijn sterk geciteerd in de wetenschappelijke literatuur 2,5.

Op het gebied van vasculaire biologie heeft kamermyografie vasculaire fysiologen en farmacologen een waardevol en betrouwbaar hulpmiddel geboden om de endotheelfunctie te meten in een strak gecontroleerd semi-fysiologisch systeem1. Momenteel zijn er twee verschillende myograafsystemen beschikbaar voor wetenschappers: draad (of pin) tensometrische (isometrische) myografie en drukmyografie. In een draadmyografiesysteem wordt het bloedvat uitgerekt tussen twee draden of pinnen, waardoor de isometrische meting van kracht- of spanningsontwikkeling in de wand van het bloedvat mogelijk is, terwijl drukmyografie een voorkeursplatform is voor metingen van vasculaire reactiviteit in kleine weerstandsslagaders, waar veranderingen in bloeddruk worden beschouwd als de belangrijkste stimulans voor veranderingen in vasculaire tonus en vasomotion. Er is een algemene overeenstemming dat, voor kleine weerstandsslagaders zoals mesenteriale en cerebrale slagaders, drukmyografie een aandoening creëert die dichter bij de fysiologische omstandigheden in het menselijk lichaam ligt. De kleine kamermyograaf kan worden gebruikt voor vaten met zeer kleine diameters (200-500 μm) tot veel grotere vaten zoals de aorta.

Hoewel de draadmyograaf een krachtig systeem is voor het registreren van de spanning van bloedvaten onder isometrische omstandigheden, is de drukmyograaf een geschikter systeem voor het meten van veranderingen in de diameter van het vat als reactie op veranderingen in isobare omstandigheden. De diameterveranderingen in het vat als reactie op veranderingen in druk of stroming zijn veel groter in een kleine spierslagader (arteriole) in vergelijking met grote elastische slagaders zoals de aorta. Om deze redenen wordt de drukmyograaf beschouwd als een beter hulpmiddel voor kleine bloedvaten met aanzienlijke vasoreactiviteit1. Een van de andere praktische sterke punten van multi-kamer tensometrische myografie met kleine volumekamers is dat men de bijdrage van verschillende mechanismen aan vasculaire reactiviteit kan onderscheiden door meerdere (maximaal vier) segmenten van dezelfde slagader en van hetzelfde dier te bestuderen om variabiliteit te verminderen en robuuste en sluitende gegevens te produceren. Het is ook relatief eenvoudig technisch in te stellen en te onderhouden. Vaten van bijna elke grootte kunnen worden bestudeerd met een draadmyograaf. Het is een meer kosteneffectieve oplossing voor het beoordelen van de vasculaire functie en is een goed alternatief voor drukmyografie in experimenten waarbij de lengte van het ontlede vat te kort is voor het drukmyograafprotocol.

Dit rapport biedt een gedetailleerd protocol voor de beoordeling van de endotheelfunctie in de geïsoleerde thoracale aortaring van muizen met behulp van montagepennen in de tensometrische myografietechniek van de kleine volumekamer met behulp van het DMT-620 multikamer myograafsysteem (DMT-USA). Dit protocol maakt gebruik van een 6 maanden oude mannelijke C57BL6-muis met een gemiddeld gewicht tussen 25-35 g. Gelukkig kan dit protocol worden toegepast op verschillende diertypen en gewichten, gezien het brede scala aan scheepstypen en diameters waarvoor dit protocol kan worden gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle chirurgische procedures en dierverzorging werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use and Care Committee (IACUC) van de Midwestern University (IACUC # AZ-3006, AZ-2936).

1. Buffervoorbereiding

OPMERKING: Hoewel de HEPES fysiologische zoutoplossing (HEPES-PSS) buffer stabiel is bij 4 °C gedurende 7 dagen, wordt aanbevolen dat alle buffers vers worden gemaakt op de dag van elk experiment. Alle andere reagentia en agonisten moeten voor elk experiment vers worden bereid. De HEPES-PSS-buffer die in dit protocol wordt gebruikt, is een gevestigde buffer voor ex vivo vasculaire studies waarvan is aangetoond dat deze langer dan 12 uur cytoprotectief is met behoud van de vaatverwijdende reacties van het vat - de belangrijkste focus van dit experimentele protocol 6,7.

  1. Bereid DE HEPES-PSS-oplossing (pH 7,4) als volgt: Meng 10 mmol/L HEPES, 6 mmol/L glucose, 1,5 mmol/L CaCl2, 130 mmol/L NaCl, 4 mmol/L KCl, 4 mmol/L NaHCO3, 1,2 mmol/L MgSO4, 1,2 mmol/L KH2PO4 en 0,03 mmol/L EDTA.
  2. Bereid HEPES-PSS hoge K+ buffer voor. Dit is identiek aan de HEPES-PSS-oplossing, behalve dat deze 5 mmol/L HEPES, 65 mmol/L NaCl, 10 mmol/L glucose, 1 mmol/L MgCl2, 80 mmol/L KCl bevat en geen MgSO4 en EDTA bevat.

2. Voorbereiding van de myograafeenheid

  1. Zet aan en zet het waterbad op 37 °C. Zorg voor een passend waterniveau.
  2. Plaats twee bekers die op de juiste manier zijn geëtiketteerd in het waterbad, één met 600 ml HEPES-PSS-oplossing en één met 150 ml hoge K+ oplossing.
  3. Belucht een bekerglas van 300 ml HEPES-PSS-oplossing met carbogengas (5% CO2 en 95% O2) gedurende ten minste 10 minuten.
  4. Voeg 30 ml van de beluchte HEPES-PSS-oplossing toe aan een centrifugebuis van 50 ml, etiketteer op de juiste manier (thoracale kooi, muisidentificatienummer) en plaats deze op ijs. Bewaar de resterende beluchte HEPES-PSS-oplossing op ijs voor gebruik tijdens het aortadissectieproces.
  5. Schakel de myograafeenheid met vier kamers in; voeg 6 ml HEPES-PSS-oplossing toe aan elke myograafkamer en stel de warmte in op 37 °C. Laat de oplossing in elke kamer gedurende 30 minuten beluchten (met carbogenmengsel) en controleer of de kamers de gewenste 37 °C hebben bereikt (gebruik deze wachttijd om de muisaorta te ontleden).
  6. Schakel de hardware en computer voor myograafgegevensverzameling in.

3. Muis aorta isolatie

  1. Anesthetiseer de experimentele muis met 5% isofluraaninhalatie en euthanaseer door cervicale dislocatie (een 6 maanden oude mannelijke C57BL / 6J-muis wordt gebruikt voor deze demonstratie).
  2. Leg de muis op een chirurgische plank in rugligging en bevestig de aanhangsels aan het bord met behulp van chirurgische tape.
  3. Spray de buikstreek met 70% alcohol zodat de vacht helemaal nat is en eventuele losse/droge haren niet in de incisie komen. Veeg de overtollige oplossing voorzichtig weg.
  4. Gebruik een tang om de buikhuid te lokaliseren en te isoleren die net inferieur is aan het xiphoid-proces van het borstbeen.
  5. Creëer spanning door de huid recht omhoog te tillen. Maak een stompe snede met een schaar en verwijder de oppervlakkige huid, waardoor de thoracale holte wordt blootgesteld.
  6. Til het xiphoid-proces op en maak laterale incisies die net inferieur zijn aan het proces langs de subcostale marges.
  7. Verleng de laterale incisies craniaal om het voorste deel van de ribbenkast te verwijderen.
  8. Verwijder de thoracale kooi door een stompe snee te maken door de wervelkolom, onder het middenrif en in de nek.
    OPMERKING: Onderzoekers kunnen de aorta ook rechtstreeks uit het dier verwijderen, maar er moet voor worden gezorgd dat het vat wordt beschermd en het gestolde bloed uit de aorta wordt gespoeld. Dit protocol gebruikt het voorbeeld van het verwijderen van de thoracale kooi en het zorgvuldig reinigen en ontleden van de aorta. Met de praktijk kan deze methode snel en efficiënt worden uitgevoerd en is gunstig voor het behoud van het extra weefsel voor andere studies zoals immunohistochemie, histologie en western blotting.
  9. Breng de thoracale kooi over in een heldere siliconen elastomeer gecoate petrischaal gevuld met ijskoude beluchte HEPES-PSS-buffer en speld deze aan beide zijden vast.
    OPMERKING: Gebruik een siliconen elastomeer kit (Tabel van Materialen). Meng basis- en uithardingsmiddel (10:1 van gewicht), giet vervolgens in een glazen petrischaal en laat 24 uur uitharden bij 25 °C.
  10. Plaats de petrischaal onder een stereozoommicroscoop, snijd en verwijder voorzichtig het hart en de bijgevoegde aorta uit de ribbenkast en breng over in een schone, heldere met siliconenelastomeer beklede schaal (figuur 1).
  11. Verwijder vervolgens voorzichtig vet en bindweefsel en eventueel gestolde bloed uit de aorta. Ontleed en isoleer met een scherpe, kleine schaar de hele aorta vanaf het booggebied tot het onderste deel van de dalende aorta. Vergeet niet dat de aortaboog niet geschikt is voor myografie-experimenten, maar kan worden gebruikt voor histologische studies.
  12. Gebruik koud beluchte HEPES-PSS-oplossing gedurende de dissectie. Verander de oplossing elke 10 minuten of wanneer het zicht wordt aangetast, wat er ook eerst komt. Het wordt aanbevolen om elke aortaring binnen 20 minuten na de dissectie (max. 60 min) op de myograafkamer te monteren.

4. Montage van de aortasegmenten op de myograafkamers

  1. Knip de ontlede aorta in vier segmenten van elk 2 mm met een scherpe kleine chirurgische schaar. Gebruik de mini-liniaal in de schaal als referentie.
  2. Plaats de myograafkamer onder de stereozoommicroscoop om de pinnen gemakkelijk te visualiseren en stel de micrometers zo in dat de pinnen elkaar bijna raken (figuur 2).
  3. Zorg ervoor dat beide weefselhoudpennen goed zijn uitgelijnd.
  4. Let op en vermijd het knijpen van de aorta tijdens het monteren van de segmenten om schade aan het endotheel te voorkomen.
  5. In kamers die al 5 ml verwarmde en beluchte HEPES-PSS-buffer bevatten, schuift u elk van de 2 mm aortasegmenten voorzichtig op de twee montagepennen met behulp van een tang. Wees heel voorzichtig terwijl je de aortasegmenten over de pinnen schuift. De endotheellaag is zeer fragiel en komt heel gemakkelijk los van de luminale kant.
  6. Beweeg de pinnen langzaam uit elkaar door de micrometer tegen de klok in te draaien, zodat het aortasegment niet van de pinnen glijdt wanneer de kamer terug in de myograafeenheid wordt geplaatst (figuur 3).
  7. Gebruik de eerder gekalibreerde oculair graticule van de ontleedmicroscoop om de ware en nauwkeurige lengte van de gemonteerde aortaring te meten door het begin van de liniaal aan het ene uiteinde van het segment te plaatsen (gemarkeerd als weefseleinde α1) en een notitie te maken van de meting aan het andere uiteinde van het aortasegment in oculaire delingen (gemarkeerd als weefseleinde α2)8. Deze waarden worden gebruikt tijdens de normalisatiestappen in paragraaf 5.
  8. Breng elke myograafkamer terug naar de eenheid en begin met het beluchten van de kamers bij 37 °C gedurende 30 minuten.
    OPMERKING: De vier segmenten van de aorta kunnen worden gebruikt als replica's voor dezelfde behandeling, of elk segment van de aorta kan tegelijkertijd worden gebruikt voor verschillende experimenten.

5. Normalisatie

OPMERKING: Een normalisatieprocedure is noodzakelijk om ervoor te zorgen dat de experimentele omstandigheden goed gestandaardiseerd zijn en de verzamelde gegevens betrouwbaar en reproduceerbaar zijn. De "IC1/IC100", of "Normalisatiefactor", wordt gedefinieerd als de verhouding van de interne omtrek van de slagader waarbij het mogelijk is om de maximale respons op een vasoconstrictor (bijv. 60 mM KCl) te registreren gedeeld door de interne omtrek waarbij een transmurale wanddruk van 100 mm Hg (d.w.z. IC100) wordt geregistreerd. Door de IC100 met deze verhouding te vermenigvuldigen, kunnen we daarom de interne omtrek van de slagader bepalen waarbij een optimale respons (d.w.z. IC1) kan worden vastgesteld.

  1. Stel de micrometer zo in dat de pinnen elkaar bijna raken.
  2. Stel de krachten op nul voor alle myograafkamers en laat het nog eens 1-2 minuten in evenwicht zijn.
  3. Noteer de eerste diametermeting van de micrometer. Dit is de positie waar de opening tussen twee pinnen als nul wordt beschouwd (nodig voor stap 5.7.).
  4. Open de normalisatie-instellingen van de data-acquisitiesoftware onder het vervolgkeuzemenu DMT ; er wordt een nieuw scherm geopend met de volgende instellingen en standaardwaarden:
    Oculairkalibratie (mm/div): 0,36
    Doeldruk (kPa): 13,3
    IC1/IC100: 0,9
    Online gemiddelde tijd (en): 2
    Vertragingstijd(en): 60
    Geluid afspelen bij voltooiing van de vertraging (selectievakje)
    Geluiden (met vervolgkeuzemenu of bladerfunctie)
  5. Afhankelijk van het aantal segmenten kiest u het juiste aantal beschikbare kanalen op het scherm en start u de grafiekopname.
  6. Gebruik het vervolgkeuzemenu om het interessante kanaal te selecteren; het normalisatiescherm verschijnt.
  7. Voer de constante waarden als volgt in de vensters in: Tissue-eindpunten α1; Eindpunten van weefsel α2; Pin diameter: 40 μm; Micrometer afleeswaarde van de analoge micrometerschaal.
  8. Om het eerste punt (de beginwaarde van X of X0) vast te leggen, klikt u op de knop Punt toevoegen . Na een vertraging van 60 s worden de waarden voor de kracht en de effectieve druk (ERTP) die overeenkomen met deze micrometer weergegeven en wordt de doos voor de micrometermeting actief en beschikbaar.
  9. Begin met het uitrekken van het vat door de micrometer tegen de klok in te draaien. Gebruik het vak micrometerlezen om de waarde in te voeren en klik op de knop Punt toevoegen (er is opnieuw een vertragingstijd van 60 s).
  10. Blijf het vat uitrekken en blijf micrometerwaarden toevoegen totdat de waarde van Micrometer X1 wordt gezien, de berekende micrometerinstelling die wordt gebruikt om het vat uit te rekken tot zijn IC1.
  11. Stel de micrometer in op de X1-waarde.
    OPMERKING: De genormaliseerde (optimale) spanning voor een 6 maanden oude C57BL6 muis is 6 mN.
  12. Laat na normalisatie het weefsel rusten en gedurende 30 minuten in evenwicht brengen. Het is op dit moment niet nodig om de HEPES-PSS-oplossing in de kamers te wijzigen.
    OPMERKING: Elke kamer kan 8 ml oplossing bevatten. Dit protocol is geschreven met het gebruik van 5 ml, wat volledige onderdompeling van het vat en montagepennen mogelijk maakt.
  13. Gebruik de rust- en evenwichtstijd om het volgende voor te bereiden.
    1. Bereid de werkvoorraad van seriële verdunningen van acetylcholine in gedestilleerd water (RO-water) van de laagste tot de hoogste concentraties als volgt: 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 100 μM, 500 μM en 1 mM. Houd alle buizen op ijs voor de duur van het experiment.
    2. Bereid een 100 mM werkoplossing van N-nitro-L-arginine methylester (L-NAME) in dubbel gedestilleerd water en houd de oplossing op ijs voor de duur van het experiment.
    3. Bereid de sub-maximale dosis fenylefrine (10 μM) voor, bepaald in een afzonderlijke reeks experimenten.
      OPMERKING: De evenwichtsperiode is noodzakelijk voor het bloedvatsegment om zich aan te passen aan de nieuwe omgeving in de myograafkamer, iongradiënten te resetten en een stabiel niveau van passieve spanning te bereiken voordat het wordt onderworpen aan verschillende farmacologische en mechanische uitdagingen.

6. Meting van endotheelafhankelijke vasorelaxatie in aortaringen

  1. Giet aan het einde van de evenwichtsperiode van 30 minuten de kamers af en voeg 5 ml verse, warme, beluchte HEPES-PSS-oplossing toe aan elke kamer. Giet één kamer per keer af om de blootstelling van weefsel aan lucht te minimaliseren. Het aftappen van de kamers wordt uitgevoerd met behulp van een vacuümpomp die is ingesteld op 60 cmHg en de myograafkleppen die zijn ingesteld op een vertraging van 6 s om de verwijdering van de 5 ml oplossing te garanderen.
  2. Pas indien nodig de krachtmetingen aan om de optimale spanning van 6 mN af te lezen. Het is van cruciaal belang om de kracht aan te passen aan de optimale spanning tijdens elke incubatieperiode, evenals voorafgaand aan elke nieuwe reeks experimenten. Laat het weefsel nog 15-20 minuten rusten.
  3. Open de software voor gegevensverzameling, wijzig de trackingnummers van 50:1 in 500:1 en druk op Start. In dit stadium is de geregistreerde kracht voor elke kamer te zien in software.
  4. Zorg ervoor dat u onmiddellijk voor de start van een nieuw experiment het juiste label op de software voor gegevensverzameling toevoegt.
  5. Giet de kamers nog een keer af voordat u 5 ml hoge K + - oplossing aan elke kamer toevoegt. Dit is geschikt voor het testen van de levensvatbaarheid van aortaweefsel en de integriteit van de gladde spiercontractiele reactie op membraandepolarisatie voordat het weefsel wordt gebruikt voor een ander experimenteel protocol. Dit helpt bepalen of het bloedvatsegment bruikbaar is voor verdere experimenten.
  6. Giet de kamers opnieuw af zodra de contractiele respons op de hoge K+ oplossing een plateau bereikt voor het genereren van kracht (figuur 4).
    OPMERKING: Laat de hoge K + -oplossing niet langer dan 3 minuten in de kamers liggen, omdat dit het weefsel zou beschadigen.
  7. Was de tissue met HEPES-PSS oplossing 3x. Voeg 5 ml hoge K+ oplossing toe aan elke kamer. Giet de kamers af zodra de contractiele reactie op een hoge K+ oplossing een plateau bereikt voor het genereren van kracht en was het weefsel 3x met HEPES-PSS voordat u het weefsel nog eens 15 minuten laat rusten.
    OPMERKING: In sommige laboratoria worden de bloedsegmenten drie opeenvolgende keren onderworpen aan een hoge K + -oplossing om de variabiliteit van het bloedvat te garanderen voordat de myografische experimenten worden gestart. In dit protocol worden de nieuw geïsoleerde aortasegmenten tweemaal onderworpen aan een hoge K+ oplossing voordat het weefsel wordt gebruikt voor verdere experimenten. Het is belangrijk om dit consistent te houden in alle experimenten.
  8. Gebruik het gemiddelde van de twee geregistreerde pieken van krachtontwikkeling (contractiekracht) als reactie op een hoge K + -oplossing om de geregistreerde waarden te normaliseren in reactie op andere vasoconstrictor- en vaatverwijdende middelen die in het experiment worden gebruikt.
  9. Laat het weefsel 15-20 min rusten.
  10. Precontracteer de aortasegmenten met het vasoconstrictormiddel fenylefrine (PE) bij een reeds vastgestelde sub-maximale dosis (10 μM eindconcentratie in de kamer).
    OPMERKING: De sub-maximale dosis fenylefrine (10 μM) werd bepaald in een afzonderlijke reeks experimenten, waarbij aortasegmenten werden onderworpen aan toenemende concentraties fenylefrineoplossing bij eindconcentraties van 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM en 50 μM. Als gevolg hiervan werd vastgesteld dat een eindconcentratie van 10 μM fenylefrine de submaximale contractiekracht (90% van de maximale kracht) in 2 mm aortasegmenten kon genereren, wat vlak voordat de contractiekracht een plateau bereikt. De reden voor het gebruik van de sub-maximale concentratie van fenylefrine is om problemen met betrekking tot aortaweefselverzadiging of desensibilisatie voor de vasoconstricting agonist te voorkomen.
  11. Laat de PE-geïnduceerde contractiecurve een plateau bereiken voor spanningsontwikkeling (kracht) (figuur 5).
  12. Voer op een plateau van spanningsontwikkeling tot fenylefrine de dosis-responscurve van acetylcholine uit door 5 μL van toenemende doses acetylcholine-werkvoorraadoplossingen toe te voegen in intervallen van 3 minuten om de uiteindelijke concentraties van acetylcholine in de myograafkamer als volgt vast te stellen: 50 pM, 100 pM, 500 pM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM en 1 μM (figuur 6).
    OPMERKING: Wacht na het toevoegen van elke dosis acetylcholine ten minste 3 minuten (totdat de spanning een plateau bereikt) voordat u de volgende dosis toevoegt.
  13. Pipetteer bij elke stap de acetylcholine stockoplossing heel langzaam en ver van de aortaringen in de kamer om weefselverstoring te voorkomen.
  14. Na het voltooien van het dosis-responsexperiment draineert u de kamers en wast u de aortasegmenten met warme en beluchte HEPES-PSS-oplossing 3x om eventuele resterende resten van het geneesmiddel te verwijderen.
  15. Laat het weefsel 30 minuten rusten voordat u aan de volgende experimentstappen begint. De levensvatbaarheid van de aorta wordt vóór elke experimentele stap gecontroleerd met behulp van hepes-pss high K+ oplossing. Als alle voorbereidende en experimentele stappen correct worden gevolgd, blijft de levensvatbaarheid van het aortaweefsel hetzelfde gedurende de duur van het hele experiment (4-6 uur).

7. Effecten van algemene NO-remmers op endotheelgemedieerde vasorelaxatie

  1. Gebruik hetzelfde aortaweefsel voor dit deel van het experiment na het zorgvuldig wassen en laten rusten van de segmenten gedurende ten minste 30 minuten.
    OPMERKING: Gebruik de rusttijd van 30 minuten om een 100 mM werkoplossing van N-nitro-L-arginine methylester (L-NAME) in dubbel gedestilleerd water te bereiden en houd de oplossing op ijs voor de duur van het experiment.
  2. Nadat u de aortasegmenten gedurende 30 minuten hebt laten rusten, giet u de kamers af en voegt u een verse, warme oplossing met een hoge K +(60 mM KCl) toe aan elke kamer.
    OPMERKING: Het is belangrijk dat voor elk deel van het experiment het aortaweefsel minstens één keer wordt uitgedaagd met een hoge K + -oplossing. De geregistreerde contractiepiek zal worden gebruikt voor het normaliseren van de gegevens die tijdens dat deel van het experiment zijn verzameld.
  3. Giet de kamers opnieuw af zodra de contractierespons op een hoge K+ oplossing een plateau bereikt en was het weefsel 3x met HEPES-PSS-oplossing.
  4. Om de bijdrage van de NO-productie aan de waargenomen acetylcholine-geïnduceerde vasorelaxatie te beoordelen (zie rubriek 6.), preïncubeert u in dit stadium de aortasegmenten met een algemene remmer van NO-productie (L-NAME) door 10 μL van de bereide 100 mM werkvoorraadoplossing van L-NAME toe te voegen aan elke myograafkamer (met 5 ml bufferoplossing) om een eindconcentratie van 200 μM in elke myograafkamer te bereiken.
    OPMERKING: L-NAME is een niet-selectieve en krachtige remmer van alle isovormen van NOS (een enzym dat verantwoordelijk is voor NO-productie) en daarom wordt het beschouwd als een effectief hulpmiddel om de productie van NO in de bloedvatwandte blokkeren 9.
  5. Laat de aortasegmenten rusten tijdens de pre-incubatietijd met L-NAME (30 min).
  6. Was op dit punt niet.
  7. Voeg zonder de L-NAME te verwijderen de sub-maximale dosis fenylefrine (10 μM eindconcentratie) toe aan de kamer om aortacontractie te induceren.
    OPMERKING: Vanwege de remmende werking van L-NAME op endogene NO-productie, zal de nieuw geregistreerde piek voor fenylefrine-geïnduceerde aortacontractie veel hoger zijn dan de initiële piek die werd geregistreerd voorafgaand aan het incuberen van het weefsel met L-NAME. Dit wordt verwacht vanwege het effect van L-NAME op de basale NO-productie in de aortawand, wat leidt tot een hogere krachtgeneratie (als gevolg van een hogere contractiele krachtgeneratie door de gladde spier).
  8. Wacht tot de door fenylefrine geïnduceerde contractiecurve een plateau bereikt voor de ontwikkeling van spanning (contractiele kracht).
  9. Voeg op dit punt acetylcholine toe aan de myograafkamer om een eindconcentratie van 500 nM te bereiken (dit is de sub-maximale concentratie van acetylcholine die werd vastgesteld tijdens de experimenten beschreven in sectie 5. van het protocol).
  10. Wacht een paar minuten om eventuele veranderingen in de krachtontwikkeling te registreren totdat het gevormde plateau stabiel is (figuur 7).
    OPMERKING: Vanwege de remmende werking van L-NAME op het vermogen van de endotheellaag om NO te produceren als reactie op acetylcholine, wordt niet verwacht dat er veranderingen zullen optreden in de geregistreerde krachtgeneratie als reactie op fenylefrine, omdat de aorta-endotheel NOS (eNOS) niet in staat is om NO te genereren als reactie op acetylcholinetoepassing.
  11. Giet de kamers af en was het weefsel 3x met warme, beluchte HEPES-PSS-oplossing.

8. Bijdrage van de endotheellaag aan aorta vasorelaxatie

  1. Om de rol van de endotheellaag in aortavasorelaxatie te onderstrepen, test acetylcholine-geïnduceerde vasorelaxatie in endotheel-denuded aortasegmenten, waarin de endotheellagen worden verwijderd.
  2. Plaats de myograafkamer onder de microscoop en laat voorzichtig een kleine draad (dezelfde draad die wordt gebruikt voor draadmyografie kan hier worden gebruikt) door het lumen van de aorta lopen. Beweeg de draad voorzichtig door het lumen (zachte cirkelvormige beweging) gedurende een korte periode. Dit is voldoende om het endotheel of intima te verwijderen.
  3. Snijd de aorta in aortaringen van 2 mm en monteer die ringen op de myograafkamer zoals eerder beschreven.
  4. Stel de optimale spanning in op 6 mN en laat het weefsel 30 minuten rusten in beluchte, warme HEPES-PSS-buffer
  5. Giet aan het einde van de evenwichtsperiode van 30 minuten de kamers af en voeg 5 ml verse, warme, beluchte HEPES-PSS-oplossing toe aan elke kamer.
  6. Nul de kracht voor alle myograafkamers door de micrometer tegen de klok in te draaien.
  7. Draai de micrometer langzaam tegen de klok in om de afstand tussen de pinnen te vergroten totdat de geregistreerde kracht de gewenste optimale spanning voor de muisaorta bereikt (6 mN voor C57BL/6J muisaorta). Laat het weefsel nog 15-20 minuten rusten op de optimale spanning (6 mN).
  8. Giet de kamers 1x meer af voordat u 5 ml hoge K + - oplossing aan elke kamer toevoegt.
  9. Giet de kamers opnieuw af zodra de contractierespons op een hoge K+ oplossing een plateau bereikt en was het weefsel 3x met HEPES-PSS-oplossing. Laat het weefsel 15-20 min rusten
  10. Contracteer de aortasegmenten vooraf met het vasoconstrictormiddel fenylefrine (10 μM eindconcentratie in de kamer).
    OPMERKING: Door de verwijdering van het endotheel is de basale NO-productie in de aortawand aanzienlijk verminderd; daarom wordt verwacht dat de piek voor fenylefrine-geïnduceerde contractie (de piek van krachtgeneratie) hoger zal zijn in aortaweefsel zonder de endotheellaag.
  11. Wanneer de door fenylefrine geïnduceerde kracht een plateau bereikt, voegt u de sub-maximale concentratie van acetylcholine toe aan de myograafkamer om een eindconcentratie van 500 nM te bereiken.
    OPMERKING: Als de verwijdering van de endotheellaag correct wordt uitgevoerd, zullen er geen veranderingen zijn in de geregistreerde fenylefrine-geïnduceerde kracht, omdat de door acetylcholine geïnduceerde NO-productie door het endotheel zal zijn verminderd als gevolg van de verwijdering van de endotheellaag. Het geregistreerde spoor zal sterk lijken op het spoor dat wordt waargenomen in aanwezigheid van L-NAME (rubriek 7.).
  12. Wacht 3 minuten om ervoor te zorgen dat het geregistreerde plateau voor fenylefrine-geïnduceerde krachtontwikkeling niet verandert voordat het experiment wordt beëindigd (figuur 8).
    OPMERKING: Als de toepassing van acetylcholine een daling van de door fenylefrine geïnduceerde contractie veroorzaakt terwijl deze zich in het plateau bevindt, is dit een indicatie dat de endotheellaag niet volledig is verwijderd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het hier uitgelegde tensometrische myografieprotocol voor kleine kamers is de standaardmethode voor het meten van vasculaire reactiviteit in kleine en grote slagaders en maakt gelijktijdige metingen van vasculaire reactiviteit mogelijk in maximaal vier bloedvatsegmenten van hetzelfde experimentele kleine proefdier. In dit rapport gebruiken we het systeem specifiek om de endotheelfunctie in de geïsoleerde muisaorta te meten (figuur 1). In dit protocol worden geïsoleerde aortasegmenten gemonte...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het gebied van vasculaire biologie is sterk afhankelijk van hulpmiddelen die onderzoekers helpen de functionele en structurele integriteit van de bloedvatwand te beoordelen. Het vraagt ook speciale aandacht voor de directe en indirecte interacties tussen de drie lagen van bloedvaten: de intima, media en adventitia. Onder die drie lagen wordt de intima gevormd door een monolaag van endotheelcellen en heeft een zeer belangrijke functie bij het reguleren van vasculaire gezondheid en hemostase.

He...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door financiering van de National Institutes of Health (R15HL145646) en Midwestern University College of Graduate Studies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AcetylcholineSigmaAldrichA6625-100G
CaCl2SigmaAldrichC4901-1KG
Carbogen gasMathesonH103847
Dissecting scissorsFST91460-11
DMT 620 Multi chamber myograph systemDMTDMT 620Multi chamber myograph system
Dumont forcepsFST91150-20
EDTASigmaAldrichE5134-10G
GlucoseSigmaAldrichG8270-1KG
HEPESSigmaAldrichH7006-1KG
KClSigmaAldrichP9541-1KG
KH2PO4SigmaAldrichP5655-1KG
LabChartADI instrumentsData acquisition software
Light sourceVolpi14363
L-NameFischer Scientific50-200-7725
MgSO4SigmaAldrichM2643-500G
MicroscopeLeicaS6Dstereo zoom microscope
NaClSigmaAldrichS5886-5KG
NaHCO3SigmaAldrichS5761-500G
Organ bath systemDMT720MO
PhenylephrineSigmaAldrichP6126-10G
PumpWelch2546B-01
SoftwareADI instrumentsLabChart 8.1.20
Spring ScissorsFST15003-08
Sylgard 184 KitElectron Microscopy Services24236-10silicone elastomer kit
Tank RegulatorFischer Scientific10575147
Water bath systemFischer Scientific15-462-10

Referenties

  1. Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 321 (1), 77-111 (2021).
  2. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  3. Lerman, A., Zeiher, A. M. Endothelial function: Cardiac events. Circulation. 111 (3), 363-368 (2005).
  4. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
  5. Galley, H. F., Webster, N. R. Physiology of the endothelium. British Journal of Anaesthesia. 93 (1), 105-113 (2004).
  6. Orita, H., et al. In vitro evaluation of phosphate, bicarbonate, and Hepes buffered storage solutions on hypothermic injury to immature myocytes. Cardiovascular Drugs and Therapy. 8 (6), 851-859 (1994).
  7. Liu, Y. H., Bian, J. S. Bicarbonate-dependent effect of hydrogen sulfide on vascular contractility in rat aortic rings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (4), 866-872 (2010).
  8. Griffiths, K., Madhani, M. The use of wire myography to investigate vascular tone and function. Methods in Molecular Biology: Atherosclerosis. 2419, 361-367 (2022).
  9. Pfeiffer, S., Leopold, E., Schmidt, K., Brunner, F., Mayer, B. Inhibition of nitric oxide synthesis by NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME): Requirement for bioactivation to the free acid, NG-nitro-L-arginine. British Journal of Pharmacology. 118 (6), 1433-1440 (1996).
  10. Bacon, P. A. Endothelial cell dysfunction in systemic vasculitis: New developments and therapeutic prospects. Current Opinion in Rheumatology. 17 (1), 49-55 (2005).
  11. Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: Current concepts and clinical implications. Frontiers in Medicine. 8, 798958(2021).
  12. Mikolajczyk, K., et al. The important role of endothelium and extracellular vesicles in the cellular mechanism of aortic aneurysm formation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13157(2021).
  13. Vallance, P., Hingorani, A. Endothelial nitric oxide in humans in health and disease. International Journal of Experimental Pathology. 80 (6), 291-303 (1999).
  14. Tousoulis, D., Kampoli, A. M., Tentolouris, C., Papageorgiou, N., Stefanadis, C. The role of nitric oxide on endothelial function. Current Vascular Pharmacology. 10 (1), 4-18 (2012).
  15. Gibson, C., et al. Mild aerobic exercise blocks elastin fiber fragmentation and aortic dilatation in a mouse model of Marfan syndrome associated aortic aneurysm. Journal of Applied Physiology. 123 (1), 147-160 (2017).
  16. Xiao, X., Ping, N. N., Li, S., Cao, L., Cao, Y. X. An optimal initial tension for rat basilar artery in wire myography. Microvascular Research. 97, 156-158 (2015).
  17. Chung, A. W., Yang, H. H., Yeung, K. A., van Breemen, C. Mechanical and pharmacological approaches to investigate the pathogenesis of Marfan syndrome in the abdominal aorta. Journal of Vascular Research. 45 (4), 314-322 (2008).
  18. Zhong, C., et al. Age impairs soluble guanylyl cyclase function in mouse mesenteric arteries. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11412(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Meting van vasorelaxatieendotheelfunctiekleine-volumemyografietensometrische myografievasculaire reactiviteitmuis aortaaortaringpreparaatremming van stikstofoxideacetylcholinerespons
Meting van endotheelafhankelijke vasorelaxatie in de thoracale aorta van de muis met behulp van tensometrische kamermyografie met klein volume
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.