Deze studie presenteert een methode voor glycomics-analyse van glycoproteïnen door een combinatie van pronase E-digestie, permethylering en massaspectrometrie-analyse. Deze methode is in staat om alle soorten N-gebonden glycanen te analyseren, inclusief bacteriële N-glycanen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Niet-specifieke op proteolyse gebaseerde Glycomics-strategie voor bacteriële glycoproteïnen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Eiwitglycosylering is een van de meest voorkomende en complexe posttranslationele modificaties. Er zijn veel technieken ontwikkeld om de specifieke rollen van glycanen, de relatie tussen hun structuren en hun impact op de functies van eiwitten te karakteriseren. Een veelgebruikte methode voor glycaananalyse is het gebruik van exoglycosidase-splitsing om N-gebonden glycanen vrij te maken uit glycoproteïnen of glycopeptiden met behulp van peptide-N-glycosidase F (PNGase F). De glycaan-eiwitbindingen in bacteriën zijn echter anders en er is geen enzym beschikbaar om glycanen vrij te maken uit bacteriële glycoproteïnen. Daarnaast zijn vrije glycanen ook beschreven in zoogdiercellen, bacteriën, gisten, planten en vissen. In dit artikel presenteren we een methode die het N-gebonden glycosyleringssysteem in Campylobacter jejuni kan karakteriseren door asparagine (Asn)-gekoppelde en vrije glycanen te detecteren die niet aan hun doeleiwitten zijn gehecht. Bij deze methode werden de totale eiwitten van C. jejuni verteerd door Pronase E met een hogere enzym-eiwitverhouding (2:1-3:1) en een langere incubatietijd (48-72 uur). De resulterende Asn-glycanen en vrije glycanen werden vervolgens gezuiverd met behulp van poreuze grafietkoolstofpatronen, gepermethyleerd en geanalyseerd door middel van massaspectrometrie.
Inleiding
Eiwit N-glycosylering is een van de meest voorkomende en complexe posttranslationele modificaties in eukaryoten1. N-glycanen spelen een essentiële rol bij het vouwen van eiwitten en hebben ook een impact op het sorteren van eiwitten in het biosynthetisch verkeer2. Massaspectrometrie wordt veel gebruikt bij de analyse van glycanen die vrijkomen bij exoglycosidasesplitsing (glycomics). De resterende gedeglycosyleerde peptiden (glycoproteomics) zijn vaak gebruikt om de sequenties van geglycosyleerde peptiden in eukaryoten te identificeren3. De identificatie van N-gebonden glycanen in Campylobacter jejuni suggereerde dat N-glycosylering niet beperkt is tot eukaryoten 4,5,6,7,8. Voor bacteriën is er echter een gebrek aan effectieve exoglycosidasen of endoglycosidasen om oligosacchariden vrij te maken voor glycaananalyse.
Er is een alternatieve benadering ontwikkeld om glycosyleringsplaatsen en glycaanstructuren in glycoproteïnen te karakteriseren, die is gebaseerd op het gebruik van niet-specifieke proteolyse om de ruggengraat van de meeste peptiden te verteren en pseudo-oligosacchariden te genereren die slechts een paar aminozuren bevatten. Er zijn verschillende niet-specifieke enzymen gebruikt om pseudo-oligosacchariden te genereren en het is gebleken dat Pronase E de meest efficiënte en reproduceerbare spijsvertering bood9. We hebben een glycomics-strategie ontwikkeld op basis van Pronase E om C. jejuni N-glycanen10,11 te analyseren. De pseudo-oligosacchariden werden direct geanalyseerd met behulp van capillaire elektroforese massaspectrometrie (CE-MS) en/of met matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) na permethylering.
Hier wordt een universele methode beschreven voor glycomics-analyse die gebruik maakt van niet-specifieke Pronase E-vertering en permethylering om glycosylering van mucosale pathogeen C. jejuni te bestuderen. Deze methode is in staat om N-gebonden glycanen te karakteriseren die tot expressie worden gebracht door zowel eukaryote als bacteriële systemen en is ook nuttig bij het identificeren van nieuwe tussenproducten in N-gebonden glycosyleringsroutes.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Kweek van C. jejuni 11168H en extractie van het totale eiwitgehalte
OPMERKING: C. jejuni 11168H is een hypermotiel klonaal derivaat van NCTC 1116812.
- Begin de celkweek door de celpellet (ongeveer 0,15 g, NCTC) te rehydrateren met ongeveer 5 ml Mueller-Hinton-kweekmedium. Gebruik enkele druppels van de primaire bouillonbuis om een Mueller-Hinton-agarplaat te inoculeren. Incubeer gedurende 18 uur bij 37 °C onder een micro-aerofiele atmosfeer, d.w.z. 5% O2, 10% CO2 en 85% N2.
- Oogst bacteriële gazons met 1 ml Brain Heart Infusion (BHI) bouillon. Verdun de oogst tot ongeveer 1 x 105 c.f.u./ml met BHI-bouillon. Cellen laten gedurende 18 uur groeien door te schudden (100 rpm) in een micro-aerofiele atmosfeer bij 37 °C.
- Koel de cellen af door de platen 10 minuten op ijs te leggen en oogst de cellen door centrifugeren (4.500 x g bij 4 °C). Gooi het bovenstaande weg en was de cellen 2x in 3 L ijskoud 0,1 M Tris-HCl (pH 7,8).
- Resuspendeer cellen (10,8-10,11 C. jejuni-cellen ) in 8 ml ijskoude 0,1 M Tris-HCl (pH 7,8) en lyseer door sonicatie (Materiaaltabel). Voer de sonicatie als volgt uit: puls 4 s, 1 s uit, 1 minuut per keer en drie keer in totaal.
- Centrifugeer bij 9.500 x g gedurende 45 minuten bij 4 °C en breng het bovenstaande over in een andere buis. Dialyseer eiwitten in het bovenstaande 2x tegen 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) bij 4 °C gedurende 3 uur.
- Bepaal de eiwitconcentraties met een in de handel verkrijgbare Protein Assay13 (moet in een bereik van 4 tot 6 μg/μL liggen).
- Los 1 mg eiwitten op in 1 ml 0,1 M Tris-HCl-buffer (pH 7,5) en voeg 2,5 mg Pronase E toe aan de oplossing. Incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C, gevolgd door het koken van de oplossing bij 100 °C gedurende 5 minuten om het enzym te deactiveren.
- Bewaar de eiwitdigestieoplossing bij -80 °C voor verder gebruik.
2. Zuivering met behulp van poreuze grafietkoolstof (PGC)
- Activeer PGC-patronen (100 mg, 5 ml) door 1 ml 80% (v/v) acetonitril (ACN) met 0,1% trifluoazijnzuur (TFA) toe te voegen en herhaal 2x.
- Was de PGC-cartridge 3x met 1 ml water.
- Laad de Pronase E-digestie van 1 mg eiwit op PGC (volume is afhankelijk van de eiwitconcentratie).
- Was de cartridge 3x met telkens 1 ml water om zouten te verwijderen.
- Elute Asn-glycanen met 1 ml 25% ACN in 0,1 % TFA, gevolgd door 1 ml 50% ACN in 0,1 % TFA.
- Pool beide fracties en droog de monsters met de gekoelde vacuümconcentrator (Table of Materials) voor verdere verwerking.
OPMERKING: Gebruik oplosmiddelen van MS-kwaliteit voor Asn-glycaanzuivering.
3. Permethylering van Asn-glycanen
- Solubiliseren gedroogde Asn-glycanen met 100 μL dimethylsulfoxide (DMSO) in een tube van 1,5 ml.
- Bereid DMSO-NaOH-slurry voor door twee pellets NaOH te mengen met 2 ml DMSO. Voeg 200 μL DMSO-NaOH slurry en 100 μL methyljodide toe aan het monster.
- Sluit de buis goed af en roer 10 minuten bij 3.000 tpm bij kamertemperatuur met een vortexmixer.
- Blus de permethylering door 1 ml water toe te voegen.
- Voeg 1 ml chloroform en vortex toe gedurende 1 minuut om gepermethyleerde Asn-glycanen te extraheren.
- Centrifugeer op 9.000 x g gedurende 3 min. Verwijder het bovenstaande en behoud de onderste chloroformfase met gepermethyleerde Asn-glycanen.
- Was de organische laag door 1 ml water met vortex toe te voegen gedurende 1 minuut. Centrifugeer 3 minuten bij 9.000 x g en verwijder het supernatant. Herhaal 2x.
- Plaats de organische fase in een zuurkast en laat deze met een stikstofstraal bij kamertemperatuur drogen.
- Bewaar gepermethyleerde Asn-glycanen bij -80 °C voor massaspectrometrische analyse.
4. Elektrospray ionisatie massaspectrometrie (ESI-MS) en ESI-MS/MS analyse
- Los gepermethyleerde Asn-glycanen op in 20 μL 50% 2-propanol in water (v/v).
- Voer een CE-ESI-MS-analyse uit met behulp van een capillair van 90 cm blank gesmolten silica met een omhulselstroom van 50% 2-propanol in water van 1 μL/min.
OPMERKING: CE-MS is een systeem dat capillaire elektroforese (CE) en een massaspectrometrie combineert. CE scheidt ionen op basis van hun ionenmobiliteit. In dit protocol wordt het CE-systeem gebruikt om een minuscuul volume aan monsters in te voeren en online te ontzouten. - Stel de ESI-spanning in op 5 kV in de positieve modus.
- Laad gepermethyleerde Asn-glycaanmonsters bij 500 mbar gedurende 0,2 min, wat overeenkomt met ongeveer 100 nL.
- Verkrijg MS-gegevens met behulp van een massaspectrometer (Table of Materials) met behulp van de volgende acquisitieparameters.
- Stel voor volledige MS de verblijftijd in op 2,0 ms per stap van 0,1 m/z-eenheid. In de MS2 - en MS3-experimenten met verbeterde productionenscan (EPI) stelt u de scansnelheid in op 4.000 Da/s, met Q0-trapping. Stel de vultijd van de overvulling in op Dynamisch en de resolutie van Q1 op Eenheid. Stel voor MS3-experimenten de excitatiecoëfficiënt in om ervoor te zorgen dat alleen de mono-isotopische piek voor een enkele geladen voorloper wordt geselecteerd. Stel de excitatietijden in op 100 ms.
5. Analyse van gepermethyleerde glycanen door MALDI-TOF MS
- Los gepermethyleerde Asn-glycanen op in 10 μL 50% methanol/water (v/v).
- Meng 1 μl opgeloste Asn-glycanen met 2 μl 2,5-dihydroxybenzoëzuuroplossing (10 mg/ml in 50% acetonitril/water (v/v)).
- Voeg 1 μL gemengd monster toe aan een MALDI-plaat met 384 putjes en wacht tot het monster volledig is opgedroogd.
- Plaats de plaat in de MALDI-TOF-massaspectrometer die is uitgerust met een gepulseerde stikstoflaser (337 nm). Stel de acceleratiespanning in op 20 kV in de positieve modus.
- Stel het laservermogen in op een willekeurige schaal van 6.000 en verkrijg gegevens in positieve reflectronmodus van m/z 1.000 tot 5.000.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De methode, gebaseerd op de combinatie van pronase E-digestie en permethylering, werd toegepast op N-glycaananalyse van totale eiwitextracten van C. jejuni 11168H. Figuur 1 toont een stroomschema van de experimentele procedure. Bij typische spijsvertering werd de verhouding tussen enzym en glycoproteïne vastgesteld tussen 1:100 en 1:20. Hier werd de verhouding van pronase E tot eiwit verhoogd tot 2:1-3:1 en werd een langere spijsvertering gebruikt o...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn twee cruciale stappen in het protocol voor de implementatie van deze universele glycomics-strategie. De eerste kritieke stap is de voltooiing van de uitlaatgasvertering. Deze methode is sterk afhankelijk van de voltooiing van de Pronase E-digestie. Het is dus essentieel om een lange spijsverteringstijd en een hoge enzym-eiwitverhouding te hanteren. Meestal wordt voorgesteld om een verhouding van 2:1-3:1 te gebruiken voor Pronase E/proteïne en een incubatietijd van 48 uur. Het is ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
De auteurs danken Kenneth Chan, David J. McNally, Harald Nothaft, Christine M. Szymanski, Jean-Robert Brisson en Eleonora Altman voor hun hulp en nuttige discussies.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB), | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 149357 | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific( Ottawa, Ontario,Canada) | AA22906K7 | |
| 4000 Q-Trap | AB Sciex (Concord, Canada) | Mass spectrometer | |
| 4800 MALDI-TOF/TOF | Applied Biosystems (Foster City, CA) | Mass spectrometer | |
| acetonitrile (ACN) | Fisher Scientific( Ottawa, Ontario,Canada) | A996-4 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) broth | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 5121 | |
| C18 Sep-Pak cartridges | Waters (Milford, MA). | WAT036945 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | CX1054 | |
| Difco | Fisher Science (Ottawa, Ontario,Canada) | DF0037-17-8 | Fisher Science |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 276855 | |
| Eppendorf tube | Diamed (Missisauga, Ontario,Canada) | SPE155-N | |
| glacial acetic acid | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | A6283 | |
| methanol | Fisher Scientific, Ottawa, Ontario,Canada) | A544-4 | |
| methyl iodide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 289566 | |
| PGC cartridge | Thermo Scientific(Waltham,MA) | 60106-303 | Porous graphitic carbon |
| Pronase E | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 7433-2 | |
| Protein Assay Kit | Bio-rad (Mississauga, Ontario, Canada) | 5000001 | |
| Refrigerated vacuum concentrator | Thermo Scientific(Waltham,MA) | SRF110P2-230 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 367176 | |
| Sonicator Ultrasonic Processor | Mandel Scientific (Guelph, Ontario,Canada) | XL 2020 | |
| Trifluoacetic acid (TFA) | Fisher Scientific( Ottawa, Ontario,Canada) | A11650 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T3253 |
Referenties
- Dwek, R. A. Glycobiology: more functions for oligosaccharides. Science. 269 (5228), 1234-1235 (1995).
- Scheiffele, P., Peränen, J., Simons, K. N-glycans as apical sorting signals in epithelial cells. Nature. 378 (6552), 96-98 (1995).
- Hofmann, J., Hahm, H. S., Seeberger, P. H., Pagel, K. Identification of carbohydrate anomers using ion mobility-mass spectrometry. Nature. 526 (7572), 241-244 (2015).
- Kowarik, M., et al. N-linked glycosylation of folded proteins by the bacterial oligosaccharyltransferase. Science. 314 (5802), 1148-1150 (2006).
- Young, N., et al. Structure of the N-linked glycan present on multiple glycoproteins in the Gram-negative bacterium, Campylobacter jejuni. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42530-42539 (2002).
- Wacker, M., et al. N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).
- Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).
- Linton, D., et al. Functional analysis of the Campylobacter jejuni N-linked protein glycosylation pathway. Molecular Microbiology. 55 (6), 1695-1703 (2005).
- Nwosu, C. C., et al. Simultaneous and Extensive Site-specific N- and O-Glycosylation Analysis in Protein Mixtures. Analytical Chemistry. 85, 956-963 (2013).
- Liu, X., et al. Mass spectrometry-based glycomics strategy for exploring N-linked glycosylation in eukaryotes and bacteria. Analytical Chemistry. 78 (17), 6081-6087 (2006).
- Nothaft, H., Liu, X., McNally, D. J., Li, J., Szymanski, C. M. Study of free oligosaccharides derived from the bacterial N-glycosylation pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 15019-15024 (2009).
- Macdonald, S. E., et al. Draft genome sequence of Campylobacter jejuni 11168H. Genome Announcements. 5 (5), e01556(2017).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Liu, X., Chan, K., Chu, I. K., Li, J. Microwave-assisted nonspecific proteolytic digestion and controlled methylation for glycomics applications. Carbohydrate Research. 343 (17), 2870-2877 (2008).
- Liu, X., et al. 34;One-pot" methylation in glycomics application: Esterification of sialic acids and permanent charge construction. Analytical Chemistry. 79 (10), 3894-3900 (2007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
