Synthese van stimuli-responsieve nanogels met behulp van waterige eenstaps crosslinking en co-nanopolymerisatie

Samenvatting

Nanogels zijn een uitstekend en veelzijdig nanodeeltjesplatform voor de levering van biologische geneesmiddelen. Stimuli-responsieve poly(ethyleen) glycol-gebaseerde polymere nano-gels, die in staat zijn om op eiwitten gebaseerde ladingen in te kapselen, werden gesynthetiseerd met behulp van een eenstaps cross-linking co-nanopolymerisatiestrategie in waterige omstandigheden. De optimale fabricage en karakterisering van deze nieuwe nanodeeltjes worden hier gepresenteerd.

Samenvatting

Nanogels bestaande uit verknoopte polymere nanodeeltjes zijn ontwikkeld voor de levering van tal van chemische en biologische therapieën, vanwege hun veelzijdige bottom-up synthese en biocompatibiliteit. Hoewel er tot nu toe verschillende methoden zijn gebruikt voor de synthese van nanogels, zijn er maar heel weinig die dit hebben bereikt zonder het gebruik van agressieve organische oplosmiddelen of hoge temperaturen die de integriteit van de biologische lading kunnen schaden. Daarentegen bereikt de hier gepresenteerde methodologie de synthese van met eiwitten beladen nanogels van minder dan 100 nm met behulp van milde reactieomstandigheden. Hier presenteren we een methode voor de niet-covalente inkapseling van op eiwitten gebaseerde ladingen in nanogels die werden gesynthetiseerd met behulp van een op water gebaseerde, single-step, crosslinking copolymerisatietechniek. Bij deze techniek binden we een op eiwit gebaseerde lading in eerste instantie elektrostatisch aan een kationisch quaternair ammoniummonomeer en verknopen en co-polymeriseren we het tegelijkertijd met ammoniumpersulfaat en N,N,N',N'-tetramethylethyleendiamine om nanogels te vormen die de eiwitlading vangen. De grootte en polydispersiteitsindex van de nanogels wordt bepaald met behulp van dynamische lichtverstrooiing (DLS), terwijl de oppervlaktemorfologie wordt beoordeeld door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). De massa eiwit die in nanogels is opgesloten, wordt bepaald door de inkapselingsefficiëntie te berekenen. Bovendien wordt het vermogen van de nanogels met gecontroleerde afgifte via de geleidelijke afbraak van redox-responsieve structurele elementen ook beoordeeld in bioreductietests. We geven voorbeelden van gegevens over de optimalisatie van nanodeeltjes om alle kanttekeningen bij de synthese en karakterisering van nanogel met behulp van deze techniek aan te tonen. Over het algemeen werden nanogels van uniforme grootte verkregen met een gemiddelde grootte van 57 nm en een polydispersiteitsindexwaarde van 0,093. Er werd een hoge inkapselingsefficiëntie van 76% bereikt. Bovendien vertoonden de nanogels een gecontroleerde afgifte van maximaal 86% van het ingekapselde eiwit door geleidelijke afbraak van nieuwe redox-responsieve componenten in aanwezigheid van glutathion gedurende 48 uur.

Inleiding

Nanogels zijn driedimensionale hydrogels ter grootte van een submicron met verknoopte polymeernetwerkstructuren die grote hoeveelheden vloeistoffen in hun kernschil kunnen vasthouden zonder hun morfologische^{integriteit aan} te tasten1. Over het algemeen worden nanogels gesynthetiseerd door de polymerisatie van functionele monomeren via fysische of chemische verknoping in heterogene colloïdale systemen, zoals water-in-olie inverse micro-emulsies ^2,3. Amfifiele copolymeren kunnen zichzelf assembleren tot structuren op nanoschaal in waterige omgevingen. Ze moeten echter worden gestabiliseerd met behulp van chemische verknopingsstrategieën met disulfiden of op amide gebaseerde koppeling, klikchemie, of kunnen fysiek worden geïnduceerd (hydrofobe, elektrostatische of waterstofbindingsstrategieën) of foto-geïnduceerd⁴. Onder deze strategieën is de fysieke zelfassemblage van polymeren gevolgd door chemische crosslinking gerapporteerd als een succesvolle nanogelfabricagetechniek⁵. Hoewel historisch gezien de eerste nanogel in de jaren 1990 werd geïntroduceerd door Vingradov et ^al.6, Akiyoshi et ^al.7 en Lemieux et ^al.8, is er de laatste tijd een verscheidenheid aan slimme nanogels ontwikkeld en onderzocht die zijn samengesteld uit zowel natuurlijke als synthetische polymeren voor diverse biomedische toepassingen⁹.

Nanogels hebben een groot ladingvasthoudend vermogen, een groot oppervlak, in vivo stabiliteit en aanpasbare chemische en mechanische eigenschappen¹⁰. De synthese van nanogels is ook schaalbaar en kan op water worden gebaseerd. Bovendien maakt het verhoogde watergehalte van de nanogels ze tot effectieve dragers van gevoelige biologische ladingen¹¹. Bovendien kan het grote oppervlak voldoen aan meerdere bioconjugatiebehoeften, waardoor het mogelijk wordt om targetingmodaliteiten aan te koppelen om actieve targeting mogelijk te maken. Met name de veelzijdigheid van het nanogel-ontwerp maakt het gebruik van een breed scala aan stimuli-responsieve monomeren mogelijk die een nauwkeurige controle van hun fysisch-chemische eigenschappen mogelijk maken⁹. Deze unieke maakbaarheid maakt de rationele verbetering van het nanogelontwerp mogelijk, wat moeilijk te bereiken is met conventioneel gebruikte liposomen, micellen of polymerosomen ^12,13. Door stimuli-responsieve groepen op te nemen in speciaal ontworpen monomeren, kunnen nanogels worden ontworpen om de gecontroleerde afgifte van hun lading te activeren als reactie op verschillende fysiologisch relevante stimuli, zoals pH, redoxomstandigheden, enzymen, ^enz.9,14. Dergelijke slimme nanogels zijn nuttiger dan conventionele nanogels, omdat ze een superieure stabiliteit hebben voor een verlengde bloedcirculatie, en ze kunnen fysiologische omstandigheden doorstaan om de integriteit van hun lading te behouden en de gecontroleerde afgifte ervan op de gewenste doellocaties te bemiddelen¹⁵. Inderdaad, vanwege hun veelzijdige aard hebben nanogels aan populariteit gewonnen in de biomedische arena, met opmerkelijke vooruitgang in de ontwikkeling van stimuli-responsieve nanogels voor tal van theranostische en diagnostische toepassingen ^2,16,17.

Biologische geneesmiddelen kunnen een categorie farmaceutische producten vertegenwoordigen die bestaat uit eiwitten, peptiden en/of nucleïnezuren en hebben een revolutie teweeggebracht in het therapeutische landschap vanwege hun opmerkelijke selectiviteit, waardoor ze de snelst groeiende klasse van therapieën zijn geworden¹⁸. De groeiende markt voor dergelijke therapieën blijkt inderdaad uit de sterke toename van hun goedkeuring door de Amerikaanse Federal Drug Association (FDA), waar biologische geneesmiddelen ~40% van de totale goedkeuring van geneesmiddelen vertegenwoordigden, in 2023¹⁹. Naast hun specificiteit en potentie hebben snelle ontdekkingen van nieuwe doelwitten voor geneesmiddelen, efficiëntere bio-engineeringprocessen en een grotere kennis van het in vivo lot van deze therapieën geleid tot een toenemend gebruik ervan²⁰. Traditionele biologische geneesmiddelen omvatten interfererend RNA, vervangende eiwitten, cytokinen en hormonen die meestal worden gegenereerd met behulp van recombinant-DNA-technologie²¹. Sinds de goedkeuring van humane recombinante insuline in 1982 zijn biologische geneesmiddelen ontwikkeld voor vele aandoeningen, waaronder kanker (bijv. trastuzumab, avelumab), inflammatoire darmaandoeningen (bijv. adalimumab, certolizumab) en zeldzame genetische ziekten (bijv. mipomersan, myozyme, aldurazyme, fabrazyme)²¹. Hoewel de hoge specificiteit van de interacties van biologische geneesmiddelen met hun doelwitten theoretisch eventuele off-target effecten zou moeten compenseren, zijn er verschillende klinische zorgen naar voren gekomen met betrekking tot het gebruik ervan met betrekking tot ongewenste bijwerkingen²². Deze bijwerkingen kunnen worden gegroepeerd in twee categorieën, waaronder overdreven farmacologie (overstimulatie van doelen) en immunogeniciteit. Bovendien beperken hun korte halfwaardetijden, beperkte biologische beschikbaarheid, proteaseschade, korte houdbaarheid en dure productieprocessen hun therapeutische voordelen²¹. Conventionele methoden om deze problemen te verminderen, omvatten covalente modificatie van deze biologische geneesmiddelen die hun functie, en dus de werkzaamheid, in gevaar kunnen brengen²³. Als alternatief kan de nanomedische benadering voor het inkapselen van therapeutische ladingen tal van voordelen opleveren voor farmacologische eigenschappen, met name passieve targeting op de ontstoken plaats via het verbeterde permeatie- en retentie-effect (EPR)²⁴. Andere voordelen die verband houden met nanodeeltjes kunnen zijn: verbeterde circulatietijden, verminderde klaringssnelheid, grotere flexibiliteit van de formulering, verbeterde vasculatuurpermeatie en cellulaire opname²⁵. Hoewel een enorme verscheidenheid aan formuleringen van nanodeeltjes momenteel wordt onderzocht voor de levering van biologische ladingen, kunnen weinigen de multifunctionaliteit van nanogels nabootsen. Nanogels overschrijden inderdaad de laadcapaciteiten die worden bereikt door liposomale en micelgebaseerde nanodeeltjes, en ze vertonen een grotere colloïdale stabiliteit dan de meeste anorganische nanodeeltjes. Als zodanig vormen nanogels een waardevol platform voor de toediening van verschillende biologische therapieën.

We hebben eerder met succes een anti-oxidatief enzym afgeleverd in nieuwe matrix metalloproteïnase-responsieve verknoopte polymere nanogels, waarbij de gebruikte milde inkapselingsstrategie de bioactiviteit van het eiwit handhaafde bij vrijlating²⁶. In dit werk demonstreren we de geoptimaliseerde synthese van redox-responsieve nanogels voor de levering van op eiwitten gebaseerde payloads. Met name de synthetische methodologie maakt nanogelsynthese mogelijk met behulp van milde omstandigheden om de gewenste lading in te kapselen, zonder het gebruik van agressieve organische oplosmiddelen of hoge temperaturen. We hebben de redoxhomeostase in de intracellulaire omgeving benut om de afgifte van de ingekapselde lading te reguleren ^27,28. Doorgaans regelt de van nature overvloedige antioxidant glutathion (GSH) de extracellulaire en intracellulaire redoxpotentialen, waarbij de concentratie varieert tussen 2-20 μM en 1-10 mM, respectievelijk^29,30. Tot op heden zijn er talloze redoxgevoelige nanodeeltjes gerapporteerd, waardoor dit een bewezen en betrouwbare strategie is om gecontroleerde afgifte van geneesmiddelen in vivo mogelijk te maken ^27,28. Disulfidebindingen zijn inderdaad geïnstalleerd in polymere nanomaterialen door gebruik te maken van disulfide-bevattende crosslinkers^31,32, zelfassemblage van biologisch afbreekbare polymeren uit disulfide-bevattende monomeren³³ en redox-responsieve polymeerprodrugs of geneesmiddel/polymeerconjugaten^34,35. Daarom onderzoekt deze studie de incorporatie van een unieke, zeer GSH-gevoelige disulfide-crosslinker in de polymere nanodeeltjes, waardoor de gecontroleerde afgifte van een ingekapselde eiwitlading mogelijk wordt.

In deze studie was het ontwerp van nanogel gericht op de volgende criteria om de specificiteit en de afgifte van de lading aan te pakken: klein formaat (~100 nm) en een uniforme grootteverdeling (polydispersiteitsindex (PI) <0,3) om een efficiënte penetratie van het endotheel en in vivo stabiliteit te garanderen²⁷; efficiënte inkapseling van de eiwitlading en gecontroleerde afgifte van de lading als reactie op GSH. We rapporteren de synthese van GSH-responsieve verknoopte nanogels, die homogene nanodeeltjes van minder dan 100 nm aantoonden, met een inkapselingsefficiëntie van 76% van de gewenste eiwitlading.

Protocol

1. Synthese van redox-responsieve crosslinker

1. Voeg 2-aminoethylmethacrylaathydrochloride (44,79 mg, 0,270 mmol) en 0,063 ml triethylamine toe aan 3 ml watervrij dichloormethaan en laat 20 minuten mengen onder een inert N_2-gas in een kolf van 25 ml met ronde bodem.
2. Los 4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41,44,47,50,53-hexadecaoxa-28,29-dithiahexapentacontodiozuur di-N-succinimidylester (100 mg, 0,045 mmol) op in 1 ml watervrij dichloormethaan en voeg toe aan de kolf.
3. Voeg 4 ml watervrij dichloormethaan toe aan de kolf. Wikkel de reactiekolf in aluminiumfolie en laat onder N₂ op kamertemperatuur roeren.
4. Bevestig de productvorming door middel van dunnelaagchromatografie. Zorg voor de juiste referenties voor het uitgangsmateriaal en bevestig de productvorming volgens deze methode.
   1. Dunnelaagchromatografie is een op affiniteit gebaseerde methode die wordt gebruikt om de gewenste verbindingen uit het reactiemengsel te scheiden. Gebruik hier de sterk polaire en adsorberende silicaplaat als een stationaire fase. Plaats het monster van het uitgangsmateriaal en het monster van het reactiemengsel op het ene uiteinde van de silicaplaat en plaats het verticaal in een gesloten glazen beker met het eluent (mobiele fase: 5% methanol: dichloormethaan).
   2. Door capillaire werking beweegt de mobiele fase omhoog langs de silicaplaat en migreren de monsterverbindingen over verschillende afstanden, afhankelijk van hun affiniteiten voor de stationaire en mobiele fasen. Wanneer het front van het oplosmiddel 3/4^e van de plaat heeft gekruist, verwijdert u de plaat en droogt u deze. De afgescheiden verbindingen verschijnen als vlekken op de plaat. Kwantificeer de retentiefactor (R_f) van de gewenste verbinding als de afstand die de verbinding heeft afgelegd/de afstand die het oplosmiddel heeft afgelegd. Hier was R_f van het product 0,35. UV-licht of kleuring kan worden gebruikt om de vlekken zichtbaar te maken (kaliumpermanganaat).
5. Concentreer het mengsel in vacuüm en zuiver het via flitskolomchromatografie (isocratisch mengsel van 5% methanol: dichloormethaan)³⁶. Breng het reactiemengsel aan op de bovenkant van een glazen kolom gevuld met silica (stationaire fase) en elueer vervolgens met het oplosmiddelsysteem (mobiele fase)³⁶. Verzamel alle breuken en test met behulp van TLC om de productfracties te onderscheiden met behulp van de eerder bepaalde_Rf-waarde .
6. Concentreer de gezuiverde fracties door het oplosmiddel te verdampen met behulp van een roterende verdamper (temperatuur: 40 °C), stel de vacuümdruk in op de atmosferische druk om eerst het lagere kookpunt dichloormethaan te verwijderen. Wanneer het niveau van het oplosmiddel niet meer daalt, stelt u de vacuümdruk in op 337 mbar om methanol te verwijderen en een lichtgele olie te verkrijgen, die vervolgens verder wordt gekarakteriseerd om de productvorming te bevestigen³⁷.
7. Voer Fourier-Transform Infrared (FT-IR)-analyse uit³⁸, ¹H NMR (in gedeutereerd dimethylsulfoxide (DMSO-d ₆)⁾³⁹, ¹³C NMR³⁹ en matrix-ondersteunde laserdesorptie/ionisatie time-of-flight (MALDI-ToF)^40-analyse om de productvorming te bevestigen voordat u de volgende stappen uitvoert.
   1. Voor FT-IR-analyse laadt u 1 mg olie op het instrument om de spectra te verkrijgen.
   2. Voor NMR-analyses lost u 10 mg van het product opnieuw op in 0,75 ml van het relevante NMR-oplosmiddel, brengt u het over in een NMR-buis en sluit u het goed af om lekkage te voorkomen. Laad het monster op het NMR-instrument, waarna de spectra worden verkregen³⁹.
   3. Voor de massaspectrometrie-analyse sluit u 1 mg van het product af in een injectieflacon, lost u het op in DMSO en laadt u het op het instrument.
      OPMERKING: Infraroodanalyse geeft informatie over de belangrijkste functionele groepen in het gewenste product, namelijk de carbonylrekken (C=O) geïdentificeerd door de scherpe piek op 1650 ^cm-1 geeft de vorming van de amidebinding aan, waardoor de productvorming wordt benadrukt. De ¹H NMR en de ¹³C geven informatie over de chemische milieus en kunnen daardoor worden gebruikt om de chemische samenstelling van het gewenste product te bepalen via de identificatie van de chemische milieus die in de verbinding aanwezig zijn. Ten slotte kan het gebruik van massaspectrometrie de exacte massa van het gewenste product verifiëren.

2. Test splitsing van disulfide crosslinker met glutathion

1. Incubeer de disulfide-crosslinker (tot een eindconcentratie van 4,55 mg/ml) met het reductiemiddel glutathion (finale [GSH]: 10 mM), tot een eindvolume van 1 ml, gedurende 24 uur in een glazen injectieflacon van 1,5 ml.
2. Om de splitsing van de disulfidelinker te bevestigen, dient u de injectieflacon in voor MALDI-ToF-analyse^26,40.

3. Redox-responsieve nanogelsynthese

1. Zorg ervoor dat al het glaswerk dat voor de reactie wordt gebruikt, stofvrij is door te wassen met gefilterd (0.20 μm) gedeïoniseerd water en het glaswerk vervolgens te drogen met perslucht die toegankelijk is via de persluchtvoorziening aan de zijkant van de zuurkast. Bevestig een veilig mondstuk aan de persluchtuitlaat om de toegang te vergemakkelijken. Houd de injectieflacon stevig vast en plaats het mondstuk erin. Activeer de perslucht en laat een gecontroleerde stroom in de injectieflacon ontsnappen. Observeer het proces om een effectieve droging te garanderen en controleer op eventuele resterende verontreinigingen of vocht.
2. Bereid een glazen injectieflacon van 10 ml voor door deze te vullen met gedeïoniseerd water en sluit de kolf af met een rubberen septum. Deoxygeneer het water door er minstens 30 minuten N₂ doorheen te borrelen voordat de reactie begint. Vul hiervoor een ballon met N_2-gas en bevestig een naald aan de ballon; plaats het op het septum en gebruik de naald om het rubberen septum te doorboren en N₂ te laten stromen. Bevestig een uitgangsnaald aan de kolf om een constante stroom van N₂ te garanderen.
3. Los runderserumalbumine (BSA; 2 mg, 30 nmol) of Cy7-gelabeld BSA (2 mg, 30 nmol) op in 1 ml zuurstofarm gedeïoniseerd water en voeg toe aan een andere schone glazen injectieflacon van 10 ml.
4. Voeg [2-(acryloyloxy)ethyl]trimethylammoniumchloride (AETC)-oplossing (12,00 mg/10,86 μl, 0,060 mmol) toe aan de kolf en sluit deze af met een ander rubberen septum. Zorg ervoor dat het reactiemengsel onder een constante stroom van N_2-gas wordt gehouden en roer gedurende 30 minuten.
5. Los acrylamide (9,21 mg, 0,13 mmol) op in 1 ml zuurstofarm gedeïoniseerd water en voeg toe aan het mengsel in de injectieflacon.
6. Los disulfide crosslinker (4,44 mg, 0,004 mmol) op in 1 ml gedeïoniseerd water en voeg toe aan het mengsel in de injectieflacon. Spoel het mengsel gedurende 20 minuten door met N₂ gas.
7. Los natriumdodecylsulfaat (2 mg, 0,007 mmol) op in 1 ml zuurstofarm gedeïoniseerd water en voeg toe aan het mengsel via een N₂ gasgespoelde spuit en roer het mengsel gedurende 30 minuten.
   OPMERKING: Door de spuit met N₂ te spoelen, minimaliseren we de blootstelling van het reactiemengsel aan zuurstof in de atmosfeer, wat de radicale polymerisatiereactie kan remmen.
8. Voeg N,N,N',N'-tetramethylethyleendiamine (1,5 μL, 0,010 mmol) toe en laat het reactiemengsel 3 minuten onder N_2-gas zuurstofarm deoxygeneren.
9. Los ammoniumpersulfaat (1 mg, 0,004 mmol) op in 1 ml zuurstofarm gedeïoniseerd water en voeg toe aan het reactiemengsel. Zorg ervoor dat N_2-gas gedurende 10 minuten door het reactiemengsel borrelt.
   OPMERKING: Als de opvoegstap N₂ wordt overgeslagen, is het waarschijnlijk dat er witte deeltjes in de reactiekolf ontstaan. Dit zijn grotere deeltjes en/of aggregaten en kunnen elke verdere karakterisering in de war brengen.
10. Sluit de kolf af onder een_N2-atmosfeer en laat 3 uur en 30 minuten roeren bij kamertemperatuur.
11. Om de reactie te beëindigen, verwijdert u de afdichting van de kolf en laat u het reactiemengsel minstens 10 minuten roeren. Dit zou het reactiemengsel blootstellen aan atmosferische niveaus van_O2-gas , dat vervolgens eventuele resterende radicalen in het reactiemengsel zou doven. De reactie eindigt wanneer het mengsel een helderblauw opaalachtig uiterlijk aanneemt.
12. Om de nanogels te zuiveren, voegt u het reactiemengsel toe aan een centrifugaalfiltereenheid van 15 ml (100 kDa MWCO) en voegt u gedeïoniseerd water toe om de centrifugaaleenheid te vullen. Centrifugeer het reactiemengsel op 1000 x g gedurende 10 minuten. Dit verwijdert alle niet-gereageerde chemicaliën (of niet-ingekapselde lading) die kleiner zijn dan 100 kDa en concentreert het nanogelmonster.
13. Zodra het waterpeil in de centrifugaaleenheid daalt, voegt u 2 ml gedeïoniseerd water toe om het nanogelmonster te verdunnen en centrifugeert u om het product te concentreren. Herhaal deze stap 3x.
14. Bewaar het monster bij 2-8 °C om de afbraak van het ingekapselde eiwit te voorkomen.
15. Voer FT-IR- en ¹H NMR-analyse uit (in gedeutereerd dimethylsulfoxide (DMSO-d ₆)) om polymerisatie te bevestigen^39,41. Om het monster voor te bereiden, vriesdroogt u 1 ml van de nanogeloplossing in een injectieflacon van 1,5 ml. Het vriesdroogproces omvat het invriezen van het monster en vervolgens het toepassen van een vacuüm om het bevroren oplosmiddel te verwijderen door middel van sublimatie, waarbij een poedervormig residu achterblijft. Los het monster na het vriesdrogen weer op in het relevante NMR-oplosmiddel, breng het over in een NMR-buis en sluit het goed af. Laad het monster op de NMR-machine, zoals eerder beschreven³⁹. Voor FT-IR-analyse moet 1 mg van het droge poeder op het instrument worden geladen om de spectra te verkrijgen.

4. Morfologische karakterisering van nanogel

1. Dynamische lichtverstrooiing (DLS)
   OPMERKING: Hydrodynamische diameter (nm), polydispersiteitsindex (PI) en zeta-potentiaal werden gemeten bij 25 °C, 632,8 nm lasergolflengte en 173° signaaldetector met behulp van een DLS-machine. Elke run mat 25 subscancycli.
   1. Hydrodynamische grootte (nm) meting
      1. Bereid een cuvet of een wegwerp gevouwen capillaire cel voor door deze schoon te maken met gefilterd gedeïoniseerd water. Blaas perslucht in de cuvet (geschikt voor zowel DLS- als zeta-potentiaalmetingen) om ervoor te zorgen dat deze vrij is van grote stofdeeltjes.
      2. Vul de cuvet met ten minste 50-100 μL van het monster en verdun in 750-1000 μL gefilterd gedeïoniseerd water. Zorg er bij het gebruik van een zetapotentiaalcuvet voor dat de cuvet is gevuld met een monster zonder luchtbelvorming, dit kan de metingen verstoren.
      3. Plaats de cuvet in het DLS-instrument en zorg ervoor dat deze correct is geplaatst. Open hiervoor het deksel van het monstercompartiment van het DLS-instrument. Houd de cuvet aan de bovenranden vast om vingerafdrukken op de optische vensters te voorkomen. Zorg ervoor dat de cuvet goed in de cuvethouder zit en zorg ervoor dat deze waterpas staat en is uitgelijnd met het optische pad van het instrument. Sluit het monstercompartiment om interferentie met omgevingslicht te voorkomen.
         OPMERKING: Het verdunningsmedium wordt gefilterd met een spuitfilter met een poriegrootte van 0,45 μm.
      4. Klik om de deeltjesgroottemeting te starten in de relevante DLS-machinesoftware.
      5. Selecteer de resultaten die overeenkomen met de steekproef om het z-gemiddelde (gemiddelde deeltjesgrootte), de gemiddelde PI, het aantal kilo's per seconde (kcps), zeta-potentiaal en relevante grafieken te verkrijgen. Zorg ervoor dat de correlatiefunctie een vloeiende sigmoïdale curve vertoont, aangezien dit een uniforme steekproef suggereert.
      6. Zodra de analyse is voltooid, verwijdert u de cuvet uit het DLS.
2. De microscopie van het transmissieelektron (TEM)
   1. Bereid monsters voor door 10 μL van de nanodeeltjesoplossing (0,077 mg/ml) op met koolstof beklede koperen roosters te plaatsen. Laat 1 uur aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.
   2. Was de roosters met gefilterd gedeïoniseerd water en beits ze met 5 μL gefilterd 1% uranylacetaat in water gedurende 2 min.
   3. Nadat het overtollige kleurmiddel in filtreerpapier is gedrenkt, droogt u de roosters een nacht bij kamertemperatuur. Leg de volgende dag TEM-beelden vast met een vergroting van 45.000x met behulp van een helderveldcamera.
   4. Gebruik de meegeleverde software voor beeldverwerking (resolutie: 2048 x 2048 pixels).

5. Kwantificering van eiwit (BSA) ingekapseld in de nanogels met behulp van een micro-bicinchoninezuur (BCA) test

1. Genereer volgens het microBCA-testprotocol (weergegeven op de website van de fabrikant) een standaardcurve op basis van een vooraf gedefinieerde eiwitconcentratie⁴².
2. Zuiver na hun synthese de eiwit-inkapselende nanogels met behulp van centrifugaalfiltereenheden van 15 ml met 100 kDa MWCO (1000 x g, 10 min) zoals beschreven in de stappen 3.12-3.14.
3. Verzamel het filtraat en analyseer het met behulp van de microBCA-assay (protocol beschikbaar op de website van de fabrikant). Meet de extinctie bij 562 nm met behulp van een plaatlezer. Aangezien deze meting correleert met de niet-ingekapselde eiwitconcentratie, bepaalt u de massa van het ingekapselde eiwit. Gebruik de volgende vergelijking om de inkapselingsefficiëntie (EE) % te berekenen:
   

6. Kwantificering van de eiwitafgifte uit nanogels in aanwezigheid van glutathion

1. Incubeer 200 μL van 5 mg/ml Cy7BSA-geladen nanogels met 200 μL 10 mM glutathion (GSH) in de centrifugaalfiltereenheden van 0,5 ml (100 kDa MWCO). Plaats de filterunits in een waterbad om de temperatuur op 37 °C te houden.
2. Centrifugeer op 1000 x g gedurende 3 minuten elke 10 min gedurende ten minste 1 uur - daarna elke 2-8 uur.
3. Verzamel het filtraat en gebruik het voor verdere analyse. Houd het volume van het filtraat in de centrifugaalfiltereenheden op 500 μL door meer gedeïoniseerd water of PBS toe te voegen.
4. Meet de hoeveelheid eiwit in de filtraten aan de hand van een standaardcurve voor met Cy7BSA beladen nanogels, waarbij de absorptie van het fluorescerende eiwit werd gemeten met behulp van een nanodruppelinstrument bij 750 nm.
   OPMERKING: Deze standaardcurve kan worden berekend door seriële verdunningen van Cy7BSA te bereiden binnen het bereik van 0 mg/ml tot 2 mg/ml. Waarden verkregen uit de nanodruppel kunnen worden geïnterpoleerd tegen deze kalibratiecurve om de inkapselingsefficiëntie te bepalen.

Resultaten

Synthese en karakterisering van poly(ethyleenglycol) (PEG) disulfidediacrylaat crosslinker De redox-responsieve crosslinker werd gesynthetiseerd door de nucleofiele substitutie van een N-hydroxysuccinimide (NHS) ester door het 2-aminoethylmethacrylaat via de vorming van een amidebinding (Figuur 1). De synthese van het vereiste product werd voornamelijk gevalideerd door ¹H NMR (aanvullende figuur 1), die w...

Discussie

De groeiende vraag naar doelspecifieke biologische geneesmiddelen in de biofarmaceutische industrie heeft geleid tot een behoefte aan technologieën die hun in vivo farmacologische profielen kunnen verbeteren, terwijl hun snelle fysiologische afbraak wordt voorkomen en ongewenste bijwerkingen worden gecompenseerd. Met dit in gedachten wordt een eenvoudige procedure voor de synthese van met eiwitten beladen nanogels beschreven. Zoals aangegeven in het protocol, moet de redox-respo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Chemicaliën
2-( acryloyloxy)ethyl]trimethylammoniumchloride-oplossing	Sigma Aldrich	496146
2-aminoethylmethacrylaathydrochloride	Sigma Aldrich	516155
4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41, 44,47,50,53-Hexadecaoxoa-28,29-dithiahexapentacontaandicarbonzuur di-N-succinimidester	Sigma Aldrich	671630
Acrylamide	Sigma Aldrich	23701
Ammoniumpersulfaat	Sigma Aldrich	248614
Rundermelserumalbumine	Sigma Aldrich	B6917
Cy7- gelabeld rundermelserumalbumine	Nanocs	BS1-S7-1
Gedeutereerd dimethylsulfoxide	Sigma Aldrich	547239
Dichloormethaan	Sigma Aldrich	270997 (watervrij) en D65100
Glutathione	Sigma Aldrich	G4251
Methanol	Sigma Aldrich	34860
N,N,N’,N’-tetramethylethyleendiamine	Sigma Aldrich	411019
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	ThermoFisher	10010023
Natriumdodecylsulfaat	Sigma Aldrich	436143
Triethylamine	Sigma Aldrich	471283
Uranylacetaat	Agar Scientific	AGR1260A
Benodigd apparatuur voor nanogelsynthese en -karakterisering
Amicon Ultra-15 centrifugaalfiltereenheden (100kDa MWCO)	Merck Millipore	C7715
Camera	Olympus	Veleta
Koolstof-gecoate koperroosters	Agar Scientific	AGS160
Dialyseslang (100kDa MWCO)	Spectrum labs	11405949
Dynamische lichtspreiding	Malvern	Zetasizer Nano Ultra
Vriesdroger	Labconco	WZ-03336-01
Infraroodspectroscopie	Agilent	Cary 630 FTIR
iTEM-software	Olympus
Massaspectrometrie	Waters	Micromass MALDI microMX MALDI Q-ToF
MF-MilliporeTM membraanfilter (0,45/0,2μm poriëngrootte)	Merck Millipore, UK	HAWP04700, GSWP04700
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23235
Plate reader	Beckman	Coulter-PARADIGM
Proton- en Koolstof-13 nucleaire magnetische resonantiegegevens	Bruker	400MHz AV-400 NMR-spectrometer
Rotorverdamper	Buchi	R-114 Rotary Vap System
Naald voor eenmalig gebruik	Sterican	4665643
Suba-Seal septums	Sigma Aldrich	Z124575
Transmissie-elektronenmicroscopie	Phillips	CM 100 TEM
UV-vis-spectrofotometer	Nanodrop	Nanodrop One/One C microvolume