Detectie en kwantificering van tunnelende nanobuizen met behulp van 3D-volumeweergaveafbeeldingen

Summary

Tunneling nanobuisjes (TNT's) zijn voornamelijk open-end F-actine membraan nanobuizen die naburige cellen verbinden, waardoor intercellulaire communicatie wordt vergemakkelijkt. Het opvallende kenmerk dat TNT's onderscheidt van andere celuitsteeksels is de zwevende aard van de nanobuisjes tussen cellen. Hier karakteriseren we TNT's door een 3D-volumeweergave van confocale z-stack-afbeeldingen te construeren.

Abstract

Recente ontdekkingen hebben aangetoond dat cellen directe, intercellulaire overdracht op lange afstand uitvoeren via nanoschaal, actine-membraankanalen, namelijk "tunneling nanobuisjes" (TNT's). TNT's worden gedefinieerd als open einde, lipide bilayer-omcirkelde membraanuitbreidingen die de continuïteit bemiddelen tussen naburige cellen met diameters variërend tussen 50 nm en 1 μm. TNT's werden aanvankelijk aangetoond in neuronale cellen, maar opeenvolgende studies hebben het bestaan van TNT's aangetoond in verschillende celtypen en ziekten, zoals neurodegeneratieve ziekten, virale infecties en kanker. Verschillende studies hebben verwezen naar close-ended, elektrisch gekoppelde membraan nanostructuren tussen naburige cellen als TNT's of TNT-achtige structuren.

De opheldering van ultrastructuur in termen van membraancontinuïteit op het eindpunt is technisch uitdagend. Bovendien zijn studies over cel-celcommunicatie een uitdaging in termen van de karakterisering van TNT's met behulp van conventionele methoden vanwege het ontbreken van specifieke markers. TNT's worden voornamelijk gedefinieerd als op F-actine gebaseerde, open membraanuitsteeksels. Een belangrijke beperking is echter dat F-actine aanwezig is in alle soorten uitsteeksels, waardoor het een uitdaging is om TNT's van andere uitsteeksels te onderscheiden. Een van de opmerkelijke kenmerken van op F-actine gebaseerde TNT's is dat deze structuren tussen twee cellen zweven zonder het substraat aan te raken. Daarom kunnen verschillende F-actine-gekleurde TNT's gemakkelijk worden onderscheiden van andere uitsteeksels zoals filopodia en neurieten op basis van hun zweven tussen cellen.

We hebben onlangs aangetoond dat de internalisatie van oligomere amyloïde-β_1-42 (oAβ) via actine-afhankelijke endocytose geactiveerde p21-geactiveerde kinase-1 (PAK1) stimuleert, wat de vorming van F-actine-bevattende TNT's bemiddelt die gecoexpresseerd zijn met fosfo-PAK1 tussen SH-SY5Y neuronale cellen. Dit protocol schetst een 3D-volumeanalysemethode om TNT's te identificeren en te karakteriseren uit de vastgelegde z-stackbeelden van F-actine- en fosfo-PAK1-immunogekleurde membraanuitsteeksels in met oAβ behandelde neuronale cellen. Verder onderscheiden TNT's zich van het ontwikkelen van neurieten en neuronale uitwassen op basis van F-actine- en β-III tubuline-immunostained membraankanalen.

Introduction

Tunneling nanobuizen (TNT's) zijn op F-actine gebaseerde, voornamelijk open membraankanalen en spelen een vitale rol bij de intercellulaire overdracht van lading en organellen¹. Het unieke kenmerk van TNT's is dat ze naburige cellen verbinden zonder enig contact met het substraat; ze zijn meer dan 10-300 μm lang en hun diameters variëren tussen 50 nm en 1 μm ^2,3. TNT's zijn voorbijgaande structuren en hun levensduur duurt tussen enkele minuten tot enkele uren. TNT's werden voor het eerst aangetoond in PC12 neuronale cellen¹; later toonden talrijke studies hun bes....

Protocol

OPMERKING: SH-SY5Y-cellen gekweekt in DMEM/F-12-media werden gedifferentieerd met 10 μM retinoïnezuur gedurende 7 dagen en behandeld met 1 μM oAβ-oligomeren gedurende 2 uur bij 37 °C (5% CO₂). Na de behandeling werden de cellen gefixeerd met Karnovsky's fixatieve oplossing en dubbel-immunos gekleurd met fosfo-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) antilichaam en F-actine-bindende falloïdine. Later werden confocale z-stack beelden gemaakt met behulp van een confocale laserscanmicroscoop. De TNT's werden gekwantificeerd door handmatig tellen en onderscheiden van andere neurieten / celuitsteeksels door 3D-volumeweergavebeelden te construeren en de structuren te identif....

Results

Hier identificeren en karakteriseren we oAβ-geïnduceerde TNT's in SH-SY5Y neuronale cellen door 3D-volumeweergaven te construeren uit confocale z-stack-afbeeldingen (figuur 1). De cellen waren dubbel-immunostained met F-actine en fosfo-PAK1. Confocale z-stack beelden van immunogekleurde cellen werden geanalyseerd om TNT's te identificeren (figuur 2). Verder werden DIC-beelden geanalyseerd om te verifiëren dat de F-actine- en fosfo-PAK1-gekleurde TNT-structuren m.......

Discussion

Verschillende onderzoekers in de afgelopen 2 decennia hebben geprobeerd de structuur van TNT's¹⁸ te begrijpen en te karakteriseren. Het ontbreken van specifieke markers belemmert de vooruitgang en er is een toenemende vraag naar een handige, gestandaardiseerde methode die kan worden gebruikt om TNT's te identificeren, karakteriseren en kwantificeren. TNT's worden gedefinieerd als op F-actine gebaseerde membraankanalen die tussen twee cellen zweven. Studies hebben aangetoond dat β-tubuline-positiev.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip	Cellvis	D35-14-1.5-N	Imaging dish used to seed cells for staining experiments
Aβ (1-42) 1 mg	AnaSpec	#64129	Oligomers of amyloid beta to treat the cells
Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A11070	Secondary antibody for phospho-PAK1
Biological Safety Cabinet	Thermo Scientific (MSC Advantage)	51025411	Provide aspetic conditions duirng cell culture
CO2 Incubator	Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)	51026556	For growing cells at or near body temperature
Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS (Carl Zeiss)	LSM 880	Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution
DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane]	Merck	8034560100	Anti-bleaching reagent
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Sigma	D9542-1MG	Neuclear stainer
DMEM media	Gibco	11965092	Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42)
DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12)	Gibco	12500062	Culture media for SH-SY5Y
DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade	Cryopur	CP-100	Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid
DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade	Himedia	MB058	Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42)
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Major supplement for Culture media (US origin)
Formalin Fixative (Neutral buffered 10%)	Sigma Aldrich	HT5014-120ML	Component in the Karnovsky's fixative solution
Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O)	Sigma	G5882	Component in the Karnovsky's fixative solution
HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution	TCI	H024	Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg
Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ)	National Institute of Health (NIH)		Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer".
Lyophilizer	Christ, Alpha	2.4 LDplus	0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only
Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture	Thermo fisher Scientific	15640055	Antibiotic mixture
Phalloidin-iFlor 555	Abcam	ab176756	F-actin binding stain
Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit]	CST	#2601	Primary antibody
Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3)	Cloud clone	PAE711Hu01	Primary antibody
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Differentiating reagent
Saponin	Merck	8047-15-2	Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining
Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater)	Ultrasonic Cleaner	3.0 L/3.2	Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42)
ZEN Microscopy software	ZEISS (Carl Zeiss)		Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation