Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Doseringsgecorrigeerde weerstandstraining bij muizen met een verminderd risico op spierschade

1.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64000

⸱

31 augustus 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Physical Therapy Program, Department of Health Care Sciences, Eugene Applebaum College of Pharmacy and Health Sciences, Wayne State University, 2Department of Pharmacology, University of Nevada, Reno School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft een unieke techniek genaamd dosering-aangepaste weerstandstraining (DART), die kan worden opgenomen in precisierevalidatiestudies die worden uitgevoerd bij kleine dieren, zoals muizen.

Samenvatting

Progressieve weerstandstraining (PRT), waarbij spiercontracties worden uitgevoerd tegen progressief grotere externe belastingen, kan de spiermassa en kracht bij gezonde personen en in patiëntenpopulaties vergroten. Er is behoefte aan precisierevalidatietools om de veiligheid en effectiviteit van PRT te testen om spiermassa en kracht te behouden en / of te herstellen in preklinische studies op kleine en grote diermodellen. De PRT-methodologie en het apparaat dat in dit artikel wordt beschreven, kunnen worden gebruikt om doseringsgecorrigeerde weerstandstraining (DART) uit te voeren. Het DART-apparaat kan worden gebruikt als een stand-alone rollenbank om objectief het concentrische contractiele koppel te beoordelen dat wordt gegenereerd door de enkel dorsiflexoren bij muizen of kan worden toegevoegd aan een reeds bestaand isokinetisch dynamometriesysteem. Het DART-apparaat kan worden vervaardigd met een standaard 3D-printer op basis van de instructies en open-source 3D-afdrukbestanden die in dit werk worden geleverd. Het artikel beschrijft ook de workflow voor een studie om contractie-geïnduceerde spierschade veroorzaakt door een enkele aanval van DART te vergelijken met spierschade veroorzaakt door een vergelijkbare aanval van isometrische contracties (ISOM) in een muismodel van limb-girdle spierdystrofie type 2B / R2 (BLAJ-muizen). De gegevens van acht BLAJ-muizen (vier dieren voor elke aandoening) suggereren dat minder dan 10% van de tibialis anterieure (TA) spier werd beschadigd door een enkele aanval van DART of ISOM, waarbij DART minder schadelijk was dan ISOM.

Inleiding

Oefening verleent tal van gezondheidsvoordelen aan de skeletspieren (besproken in Vina et al.1). In het bijzonder is bekend dat progressieve weerstandstraining (PRT), waarbij spiercontracties worden uitgevoerd tegen progressief grotere externe belastingen (bijv. Halters, dumbbells, kabel-katrol-gewichtscircuits), helpen de spiermassa en kracht te vergroten bij zowel gezonde individuen als patiëntenpopulaties (besproken in eerdere publicaties 2,3 ). PRT is gebaseerd op het overbelastingsprincipe, dat stelt dat, wanneer de spier samentrekt tegen geleidelijk grotere externe belastingen, deze zich aanpast door zijn fysiologische dwarsdoorsnedegebied en krachtproducerende capaciteit te vergroten4. Bestaande modellen van PRT bij knaagdieren omvatten ladderklimmen met weerstand toegepast op de staart, co-contractie van agonistische spieren tegen weerstand van antagonisten, hardlopen met een verzwaard harnas, een hurkoefening veroorzaakt door een elektrische schok en weerstand tegen wiellopen 5,6,7,8,9,10 (besproken in eerdere publicaties 11,12 ). Er zijn momenteel echter geen onderzoeksinstrumenten om precies spiergerichte, doseringsgecorrigeerde PRT uit te voeren bij muizen die sterk lijken op de PRT-methoden en -apparaten die worden gebruikt in menselijk klinisch onderzoek en praktijk12,13. Dit beperkt het vermogen van onderzoekers om de veiligheid en effectiviteit van nauwkeurig gedoseerde PRT te bestuderen in basis- en preklinische studies bij muizen.

Om deze barrière te overwinnen, worden in deze studie een PRT-methodologie en -apparaat ontwikkeld op basis van de kabel-katrolgewichtcircuitontwerpen die worden gebruikt in weerstandstrainingsapparatuur in moderne sporthallen 14,15,16. Deze methode van PRT wordt doseringsgecorrigeerde weerstandstraining (DART) genoemd en het apparaat wordt het DART-apparaat genoemd. Naast de functionaliteit als een precisierevalidatietrainingsinstrument, kan het DART-apparaat ook worden gebruikt als een op zichzelf staand instrument om objectief het maximale concentrische contractiele koppel te beoordelen dat kan worden gegenereerd door de tibialis anterieure (TA) spier in een muis, vergelijkbaar met hoe het maximum van één herhaling (1RM, de maximale belasting die met succes kan worden opgetild / verplaatst / ingedrukt / gehurkt met behoud van een goede vorm) wordt beoordeeld bij mensen17, 18. Het DART-apparaat kan ook worden gekoppeld aan een op maat gemaakte of commerciële isokinetische rollenbank om de piek isometrische tetanische kracht te meten die wordt geproduceerd door de TA-spier in een muis (vergelijkbaar met maximale vrijwillige contractie [MVC] bij mensen) en vervolgens doseringsgecorrigeerde PRT uit te voeren met een weerstand die is gebaseerd op de piektetanische kracht (bijv. 50% van de piekkracht).

Dit artikel beschrijft de constructie van het DART-apparaat en legt uit hoe het kan worden gekoppeld aan een op maat gemaakte rollenbank, die is beschreven in eerdere publicaties 19,20,21,22, om het contractiele koppel te beoordelen en DART uit te voeren. De studie beschrijft ook hoe het DART-apparaat werd gebruikt om door inspanning geïnduceerde spierschade veroorzaakt door een enkele aanval van DART (4 sets van 10 concentrisch bevooroordeelde contracties met 50% 1RM) te vergelijken met schade veroorzaakt door een vergelijkbare aanval van isometrische contracties (4 sets van 10 isometrische contracties) in een muismodel van limb-girdle spierdystrofie type 2B (LGMD2B, of LGMDR2)23,24. Het muismodel dat werd bestudeerd, mist een eiwit genaamd dysferline, dat een belangrijke rol speelt bij het beschermen van de skeletspieren tegen spierschade met vertraagde aanvang na schadelijke excentrische contracties 22,25,26,27,28,29,30 . Het is ook aangetoond bij dysferline-deficiënte mannelijke muizen dat concentrisch bevooroordeelde gedwongen lichaamsbeweging niet zo schadelijk is als excentrisch bevooroordeelde gedwongen lichaamsbeweging en dat eerdere blootstelling aan concentrisch bevooroordeelde training bescherming biedt tegen letsel van een volgende aanval van excentrisch bevooroordeelde weeën22. Aangezien de huidige studie werd uitgevoerd om de haalbaarheid van de huidige DART-methodologie en het apparaat te testen bij het uitvoeren van doseringsgecorrigeerde, concentrisch bevooroordeelde weerstandstraining, werden mannelijke dysferline-deficiënte muizen gekozen voor het onderzoek om nieuwe gegevens van het DART-apparaat te vergelijken met eerdere gegevens. In toekomstige studies zullen vrouwelijke BLAJ-muizen worden opgenomen om het effect van seks als biologische variabele in relatie tot de respons op DART te bestuderen. Muizen die ~ 1,5 jaar oud waren, werden bestudeerd omdat ze al dystrofische veranderingen hebben in veel spiergroepen en daarom de pathofysiologische toestand modelleren waarin spieren zich kunnen bevinden bij patiënten die al spierzwakte en -verspilling hebben en rehabilitatiezorg zoeken om spiermassa en kracht te behouden26.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De experimenten die in dit artikel worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Wayne State University, Detroit, Michigan, VS, in overeenstemming met de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (1996, gepubliceerd door National Academy Press, 2101 Constitution Ave. NW, Washington, DC 20055, VS). B6. A-Dysfprmd/GeneJ muizen (ook bekend als BLAJ muizen, mannetjes, ~1,5 jaar oud) die model LGMD2B/R2 werden gebruikt voor deze studie. De muizen werden verkregen uit een commerciële bron (zie Tabel van Materialen).

1. Studieopzet

  1. Kies muizenstam(en) die relevant zijn voor de onderzoeksvraag(en) - bijvoorbeeld studie B6. A-Dysfprmd / GeneJ-muizen (BLAJ-muizen) als ze proberen de vraag te beantwoorden of concentrisch bevooroordeelde DART al dan niet wijdverspreide spierschade veroorzaakt bij muizen die LGMD2B / R2 modelleren.
  2. Wijs muizen toe aan studiegroepen op basis van de onderzoeksopzet, wijs muizen bijvoorbeeld willekeurig toe aan een dart-groep (dosage-adjusted resistance training) of aan een isometrische trainingsgroep (ISOM) en probeer de groepen zo goed mogelijk in evenwicht te brengen op basis van matching per nest en/of leeftijd (bijv . Tabel 1).

2. Fabricage van het DART-apparaat

  1. Ontwerp de DART-apparaatcomponenten met geschikte computerondersteunde (CAD) software (figuur 1) volgens de onderstaande stappen.
    1. Designbehuizing voor wiellagers met lage wrijving (zie Materiaaltabel, gebaseerd op het ontwerp van kussenblokkenlagers) met een ingebouwde gradenboog (voor gebruik als goniometer om enkelgewrichthoeken te meten).
    2. Ontwerp een toren voor wiellagerbehuizing plus een gradenboog.
    3. Ontwerp een voetplaat voor het positioneren van de voet van de muis. Ontwerp een as om de voetplaat met het wiellager te verbinden.
  2. Vervaardiging van de DART-apparaatcomponenten met een geschikte 3D-printer (figuur 1).
    1. Sla de ontwerpen die met CAD-software zijn gemaakt op als stereolithografie (. STL-extensie) -bestanden.
      OPMERKING: De . STL-bestanden (Supplementary Coding Files 1-4) kunnen worden gebruikt en gewijzigd door de corresponderende auteur van dit artikel te vermelden en dit artikel te citeren.
    2. Open de . STL-bestanden met geschikte snijsoftware (zie Materiaaltabel).
      OPMERKING: Slicing-software converteert een virtueel 3D-model naar een stapel segmenten, die achtereenvolgens door een 3D-printer kunnen worden afgedrukt om een 3D-object te genereren.
    3. Genereer met snijsoftware G-CODE computerondersteunde productie (CAM, . GCODE-extensie) bestanden, die specifiek zijn voor de 3D-printer en filament dat zal worden gebruikt.
    4. Volg de handleiding van de 3D-printer (zie Materiaaltabel) om DART-apparaatonderdelen af te drukken met . GCODE-bestanden.
    5. Kies een geschikt 3D-printerfilament, zoals polymelkzuur (PLA) 1,75 mm 1 kg/spoel, grijs (zie Materiaaltabel).
  3. Monteer het DART-apparaat volgens de onderstaande stappen.
    1. Plaats een 608 wrijvingsarme wiellager (8 mm boringsdiameter, 22 mm buitendiameter, zoals een met siliciumnitride keramische kogels in 420 roestvrij staal, zie materiaaltabel) in het wiellagerhuis (figuur 1).
    2. Steek de as in de boring van het wiellager (figuur 1).
    3. Plak de voetplaat op de as met lijm (zie Materiaaltabel) die geschikt is om PLA te verlijmen (figuur 1).
    4. Plaats het wiellagerhuis boven de wiellagerhuistoren en bevestig het geheel aan een acrylbasis met schroefbevestigingen (figuur 1).
      OPMERKING: Er zijn geen specifieke maatvereisten voor de acrylbasis - deze hoeft alleen groot genoeg te zijn voor het dier en DART-apparaat en klein genoeg om op een werkoppervlak te passen. De acrylbasis die voor deze studie is gebruikt, is ongeveer 30 cm breed, 45 cm lang en 0,5 cm dik.

3. Voorbereiding van muizen op DART of ISOM

  1. Plaats elke muis onder algemene anesthesie met geïnhaleerd isofluraan toegediend via een geschikt anesthesiesysteem (zie materiaaltabel, 2% -5% voor inductie; 1% -4% voor onderhoud; effect) om stress en pijn te verminderen.
    1. Induceer anesthesie in de inductiekamer van het anesthesiesysteem (2% -5% isofluraan).
    2. Breng de muis over naar een neuskegel om de anesthesie te behouden tijdens het uitvoeren van procedures op het dier (1% -4% isofluraan). Bevestig de effectiviteit van anesthesie op basis van het ontbreken van terugtrekking van de achterste poten tot een teenknijper van een pincet.
    3. Zorg voor thermische ondersteuning - bijvoorbeeld met een isothermische gelverwarmingspad en een warmtelamp die ~ 1 m boven de muis is geplaatst. Controleer met een thermometer of de temperatuur op en rond de acrylbasis op ~ 38 ° C wordt gehouden, zodat de muis niet oververhit raakt.
  2. Bereid de huid voor op de linker tibialis anterieure (TA) spier van de muis en over de gehele voorste en laterale aspecten van de linker achtervel op DART of ISOM.
    1. Verwijder de vacht van de muis met een ontharingscrème (ontharingscrème, zie Materiaaltafel). Breng ontharingscrème aan en laat het ~2 min werken.
    2. Reinig het been met doekjes gedrenkt in gedestilleerd water om de vacht en alle resterende crème van de huid te verwijderen. Ontharingscrèmes kunnen de huid irriteren en/of beschadigen als ze lange tijd op de huid van de muis blijven zitten en daarom volledig worden verwijderd.
    3. Desinfecteer na het verwijderen van de vacht de huid met een goedgekeurde scrubmethode, zoals met een povidon-jodium schroboplossing en 70% ethanol.
  3. Breng een beschermmiddel (bijv. vaseline) aan op de ogen en ontharen van de huid met een schoon wattenstaafje om de ogen en de ontharende huid te beschermen tegen uitdroging.
  4. Plaats een stabiliserende pin door de tibiale metafyse.
    1. Breng 5% lidocaïnecrème aan op het scheenbeen om het gebied te verdoven.
    2. Passeer een 26 G, halve inch, steriele, hypodermische naald door het breedste deel van het proximale deel van het tibiale bot (d.w.z. de tibiale metafyse, ook bekend als de tibiale kop). Zodra de stabiliserende pin is bevestigd, verwijdert u het plastic gedeelte van de hypodermische naald door de naald met een steriele hemostat vast te houden en het plastic gedeelte te buigen totdat het afbreekt.
  5. Plaats de muis voor DART- of ISOM-training.
    1. Leg de muis in rugligging. Zorg ervoor dat de muis nog steeds stevig is aangesloten op de neuskegel om de anesthesie te behouden.
    2. Voer met een pincet met steriele punt de tibiale pin in een metalen alligatorclip (zie Materiaaltabel), zodat de uiteinden van de tibiale pin worden vastgehouden door de alligatorklem. Beweeg de verstelbare arm van de alligatorklem om ervoor te zorgen dat de voet van de muis op de voetplaat van het DART-apparaat wordt geplaatst.
    3. Bevestig de voet van de muis op de voetplaat van het DART-apparaat met zelfklevende laboratoriumtape.
    4. Plaats de voet van de muis in een hoek van 90° ten opzichte van de lange as van het scheenbeen van de muis. Indien correct geplaatst, zal de voetplaat loodrecht op de acrylbasis staan (d.w.z. de vloer of wat als het horizontale vlak wordt beschouwd).
    5. Plaats de voetplaat op de plantarflexiestop die ontstaat door een 18 G, 1,5 lange hypodermische naald door de voorgeboorde gaten op de gradenboog van het DART-apparaat te plaatsen (figuur 1).

4. DART of ISOM training

  1. Optimaliseer de plaatsing van de elektrode door een bipolaire, transcutane, neuromusculaire elektrode (NMES, zie Materiaaltabel) te plaatsen op het inferolaterale aspect van het kniegewricht van de muis (figuur 1B).
    1. Met enkele pulsen (1 Hz) van een laboratorium elektrische stimulator (zie Tabel van materialen), stimuleer de fibulaire tak van de heupzenuw, die motorische innervatie levert aan de enkel dorsiflexor spieren (figuur 1B).
    2. Aangezien de tibialis anterieure (TA) spier goed is voor meer dan 90% van de totale contractiele kracht geproduceerd door de enkel dorsiflexor spieren31, observeer de TA spierbuik en pees voor bewijs van elektrisch opgewekte twitch contracties.
      OPMERKING: Een lichte benige prominentie die overeenkomt met het kuitbeen kan helpen bij het plaatsen van de elektrode als de tester het door de elektrode kan voelen. Dit vereist enige oefening en leren van de kant van de tester om een gevoel te krijgen voor een optimale elektrodeplaatsing.
    3. Verplaats de plantarflexiestop naar het gat op de gradenboog dat overeenkomt met 20° plantarflexie van de positie waarin de voet orthogonaal (90°) is naar het scheenbeen - dit is de positie waarop het maximale contractiele koppel van de TA-spier doorgaans wordt waargenomen op basis van eerdere rapporten21. Dit moet mogelijk door de gebruiker worden aangepast op basis van factoren die specifiek zijn voor de muizen die worden bestudeerd.
    4. Visualiseer het twitch-koppel met een muisdynamometer door de voetplaat van het DART-apparaat te koppelen aan de voetplaat van de rollenbank - koppel bijvoorbeeld de voetplaat van het DART-apparaat aan een op maat gemaakte robotische enkeldynamometervoetplaat met een niet-elastische zijden hechtdraad (vergelijkbaar met figuur 1A) en bevestig de hechtdraad aan de voetplaat van de rollenbank (zie Materiaaltabel).
      OPMERKING: De voetplaat heeft gaten ingebouwd in het 3D-printontwerp. Door de hechting door het paar gaten in de tweede rij van het teeneinde van de voetplaat te plaatsen, wordt de hechting op ~ 20 mm van de as dorsiflexie / plantarflexie geplaatst (figuur 1A, B). De rollenbank is beschreven in eerdere rapporten 19,20,21,22.
  2. Optimaliseer de spanningsuitgang van de NMES-stimulator.
    1. Na het optimaliseren van de plaatsing van de elektrode, optimaliseert u de amplitude van de spanningsuitgang van de elektrische stimulator - dit is nodig om NMES te beperken tot de gemeenschappelijke fibulaire zenuw en TA-spier en het risico op het opwekken van co-contracties in de plantarflexors te verminderen.
      OPMERKING: Als co-contracties worden uitgelokt, kunnen ze worden gevisualiseerd door het koppel van de rollenbank en ook worden gezien in de plantarflexing van de tenen.
  3. Stel de NMES-stimulator in voor DART- of ISOM-training.
    OPMERKING: De volgende instellingen moeten mogelijk door de gebruiker worden aangepast op basis van factoren die specifiek zijn voor de muizen die worden bestudeerd en het doel van de onderzoeken.
    1. Stel de stimulator in om herhaalde pulstreinen te produceren die 125 Hz in frequentie zijn - deze frequentie produceert maximale gefuseerde tetanische contracties zonder overloop van NMES in andere spiergroepen bij BLAJ-muizen21. Voer dit uit door de draaiknoppen aan te passen voor pulsfrequentie (125 Hz), treinduur (500 ms) en treinen per seconde (1 trein / s) en de tuimelschakelaar in te schakelen voor herhalende pulstreinen.
    2. Stel de stimulator in om pulstreinen te produceren die 500 ms in duur zijn, afgewisseld met 500 ms rust tussen pulstreinen.
    3. Verplaats de plantarflexiestop naar het gat op de gradenboog dat overeenkomt met 160° met de lange as van het scheenbeen (70° plantarflexie van voet orthogonaal naar het scheenbeen). Dit is de positie waarnaar de voet van de BLAJ-muis passief kan worden bewogen zonder weerstand tegen zacht weefsel21.
    4. Breng voor DART een geschikte weerstand aan waartegen de TA-spier concentrisch moet werken - bijvoorbeeld 5 g zoals weergegeven in figuur 1A, B; zie de kalibratiecurve van gewicht tot koppel in aanvullend dossier 1.
    5. Breng weerstand aan door het gewicht op te hangen met een niet-elastische zijden hechtdraad die is vastgemaakt aan de voetplaat van het DART-apparaat (figuur 1A, B).
    6. Pas de weerstand aan - d.w.z. breng ~50% van het maximum van één herhaling (1RM) aan (bijv. 5 g als de muis een maximaal gewicht van 10 g kan tillen met een enkele samentrekking), waardoor de voet door ten minste de helft van het beschikbare actieve bereik van dorsiflexie wordt getrokken.
    7. Voer geschikte DART-training uit bij muizen die zijn toegewezen aan de DART-groep - voer bijvoorbeeld een enkele periode van DART-training uit, waarbij vier sets van 10 herhalingen van concentrische contracties met 2 minuten rust tussen sets worden gebruikt, vergelijkbaar met progressieve weerstandstrainingsprogramma's die worden gebruikt bij mensen32 (zie aanvullende video 1).
    8. Voer geschikte ISOM-training uit bij muizen die zijn toegewezen aan de ISOM-groep - voer bijvoorbeeld een enkele aanval van ISOM-training uit, waarbij vier sets van 10 herhalingen van isometrische contracties met 2 minuten rust tussen sets worden uitgevoerd, vergelijkbaar met DART (zie aanvullende video 2).
    9. Plaats voor ISOM-training de voet van de muis op 160 ° naar de lange as van het scheenbeen (70 ° plantarflexie van voet orthogonaal naar het scheenbeen) en handhaaf deze statische positie door de zijden hechtdraad op de voetplaat van de robotdynamometer te plakken.
      OPMERKING: Omdat de hechting niet kan schuiven, kan de voetplaat van het DART-apparaat niet in dorsiflexie bewegen, waardoor de dorsiflexoren isometrisch kunnen samentrekken.

5. Post-procedurele zorg voor muizen

  1. Neem voorzorgsmaatregelen om de juiste hygiëne van de geoefende achtervel te handhaven en de pijn op de naaldplaats te verminderen.
    1. Na de DART- of ISOM-training bedekt u het zichtbare deel van de tibiale pin met Triple-antibiotische zalf (400 U / g bacitracine, 3,5 mg / g neomycine en 5000 U / g polymixine-B, zie Materiaaltabel) en trek u de pin voorzichtig terug van de mediale kant van het scheenbeen. Spoel de huid over de laterale dij en het bovenbeen met povidon-jodium en steriel water. Breng 5% lidocaïnecrème aan op het scheenbeen om de pijn op de naaldplaats onder controle te houden.
  2. Laat de muizen herstellen van de anesthesie.
    1. Verwijder de muis uit de neuskegel en laat hem herstellen van de anesthesie in een herstelkooi die vrij is van beddengoed. Geef thermische ondersteuning aan de muis terwijl deze herstelt van anesthesie, bijvoorbeeld met een isothermische gelverwarmingspad.
  3. Breng de muis terug naar zijn oorspronkelijke kooi nadat hij volledig is hersteld van de anesthesie. Breng vervolgens de kooi terug naar de dierenfaciliteit, waar studiemuizen worden gehuisvest totdat vervolgexperimenten zijn uitgevoerd. Controleer de muizen dagelijks.

6. Weefselverzameling

  1. Oogst de TA-spier van de muis in zijn geheel en klik in te vriezen voor cryopreservatie volgens de onderstaande stappen.
    1. Op basis van de onderzoeksvraag(en), op een geschikt moment na de training (bijv. 3 dagen na DART of ISOM), euthanaseer de muizen volgens goedgekeurde protocollen.
      OPMERKING: Voor de huidige studie werden muizen geëuthanaseerd door cervicale dislocatie onder algemene anesthesie (geïnhaleerd isofluraan, 2% -5% tot effect). Bilaterale thoracotomie zorgde voor de dood.
    2. Ontleed de achterpoten van de muis om de getrainde TA-spier (links) en de niet-uitgeoefende TA-spier (rechts) te verwijderen. Weeg de geoogste spieren. Dompel vervolgens elke spier in minerale olie voor cryoprotectie en plaats de spier op een schoon laboratoriumdoekje om de overtollige olie te deppen21.
  2. Plaats de spier op een stuk aluminiumfolie. Houd de rand van de folie vast met een lange hemostat en dompel de folie en spier snel onder in vloeibare stikstof in een geschikte plastic container om de spier te bevriezen.
    1. Breng na ongeveer 2 minuten onderdompeling in vloeibare stikstof de bevroren spier over naar gelabelde cryogene injectieflacons. Bewaar injectieflacons in een -80 °C vriezer totdat dit nodig is voor verder onderzoek.

7. Histologisch onderzoek naar spierweefsel

  1. Bereid cryostaatsecties van TA-spieren voor die 5 μm dik zijn. Verzamel cryostaatsecties op geladen microscoopglaasjes. Bevestig de secties met aceton dat koud wordt gehouden bij −30 °C en laat de secties aan de lucht drogen.
  2. Kleur de spierweefselsecties met hematoxyline gevolgd door eosine (H&E-kleuring, zie Materiaaltabel).
    1. Dompel de secties gedurende 5 minuten onder in hematoxyline (donkerblauwe kernvlek) in een glazen pot. Verwijder overtollig hematoxyline door de secties af te spoelen met kraanwater totdat er geen verdere blus van water wordt gezien.
    2. Dompel de secties gedurende 5 minuten onder in bluingsreagens in een glazen pot. Aspirateer overtollig bluingsreagens uit de secties met een glazen zuigpipet.
    3. Dompel de secties gedurende 5 minuten onder in eosine (roze cytoplasmatische vlek) in een glasvlekkenpot. Verwijder overtollig eosine door de secties snel en herhaaldelijk (~ 10 keer) in 95% ethanol in een glasbeitspot te dopen.
    4. Laat de secties aan de lucht drogen en ga verder met visualiseren onder een lichtmicroscoop.
  3. Bereid betegelde beelden met hoge resolutie voor van volledige TA-spierdoorsneden door middel van microscoopbeeldvorming.
    OPMERKING: De gebruiker moet mogelijk de stappen voor beeldvorming en beeldanalyse aanpassen die volgen op basis van hun microscoop en beeldacquisitie- en analysesoftware.
    1. Leg digitale beelden vast met de 10x objectieflens van een lichtmicroscoop en een digitale camera gemonteerd op de microscoop.
    2. Leg ongeveer 15-20 afbeeldingen vast en beweeg langs de doorsnede van elke spier op een rasterachtige manier, zodat elke nieuwe afbeelding ~ 25% overlapt met de vorige afbeelding.
      OPMERKING: Dit proces helpt bij het vastleggen van een reeks afbeeldingen die digitaal kunnen worden betegeld (ook bekend als image stitching) om een samengesteld beeld met hoge resolutie te maken van de volledige TA-spierdoorsnede (figuur 2).
    3. Sla digitale afbeeldingen op in . TIFF-formaat.
    4. Open digitale beelden met geschikte beeldverwerkings- en analysesoftware (zie Materiaaltabel).
    5. Tegel of steek individuele afbeeldingen in een samengestelde afbeelding van de hele TA-spier door de volgende stappen: met alle individuele overlappende afbeeldingen van elke TA-spier geopend in software, klikt u op Bestand > Selecteer Automatiseren > Selecteer Photomerge > Selecteer Collage > Selecteer Open bestanden toevoegen > Klik op OK.
    6. Wanneer een nieuwe betegelde/gestikte afbeelding van de TA-spier wordt voorbereid en weergegeven, slaat u de afbeelding op in . TIFF-formaat voor verdere analyses.
  4. Kwantificeer spierschade door visuele analyse in de betegelde beelden van de gehele TA-spier met geschikte beeldanalysesoftware.
    1. Selecteer in de beeldanalysesoftware de functie Meten in het menu Analyseren om het gebied van de gehele TA-spierdoorsnede te schetsen en te meten (figuur 2).
    2. Selecteer in de beeldanalysesoftware de functie Meten in het menu Analyseren om de gebieden van elke TA-spier die beschadigd zijn te schetsen en te meten , d.w.z. gebieden die cytoplasmatische verstoring van spiervezels, afwezige spiervezels en ontstekingscelinfiltratie vertonen22 (figuur 2).
    3. Druk de som van het totale schadegebied uit als percentage van het gehele dwarsdoorsnedegebied van de TA-spier (figuur 2, tabel 2).

8. Statistische analyses

  1. Organiseer gegevens zoals weergegeven in de tabellen 1-3 en voer niet-gepaarde T-tests uit (als tests van normaliteit en homogene varianties worden doorstaan)33 of Mann-Whitney Rank Sum-tests (als tests van normaliteit en homogene varianties niet worden doorstaan)21 met geschikte software (zie Materiaaltabel).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

BLAJ mannelijke muizen, die ~ 1,5 jaar oud waren, werden bestudeerd. BLAJ-muizen modelleren de menselijke spierziekte LGMD2B / R2. Deze muizen zijn bijzonder gevoelig voor vertraagde spierschade door een enkele aanval van excentrische spiercontracties22,29. BLAJ-muizen werden daarom gekozen voor deze studies om te leren of DART op een niet-schadelijke manier kon worden uitgevoerd door de weerstand waartegen de TA-spier moet werken op een concentrisch bevooroordee...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit artikel bevat stapsgewijze instructies voor het bouwen van een apparaat om een soort precisierevalidatietraining uit te voeren die doseringsgecorrigeerde weerstandstraining (DART) wordt genoemd. Het werk beschrijft ook de toepassing van het DART-apparaat en de methodologie in een trainingsstudie om spierschade 3 dagen na een enkele aanval van DART (DART-groep) te vergelijken met schade 3 dagen na een vergelijkbare periode van isometrische training (ISOM-groep).

De kritieke stappen in het p...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd gefinancierd door subsidies van de Jain Foundation Inc., R03HD091648 van NICHD, een Pilot Grant van AR3T onder NIH P2CHD086843, een FRAP Award van EACPHS aan de Wayne State University, een Faculty Startup Package van Wayne State University en een subcontract van 1R01AR079884-01 (Peter L. Jones PI) aan JAR. Deze studie werd ook gefinancierd door een onderzoekssubsidie van de American Physical Therapy Association - Michigan (APTA-MI) aan JMB, MEP en JAR. De auteurs erkennen Dr. Renuka Roche (universitair hoofddocent, Eastern Michigan University, MI) voor het kritisch lezen van het manuscript en het geven van feedback. De auteurs erkennen de heer Anselm D. Motha voor advies over 3D-printen. De auteurs bedanken de patiënten met dysferlinopathieën die hun verhalen hebben gedeeld op de website van de Jain Foundation op https://www.jain-foundation.org/patient-physician-resources/patient-stories, met name hun ervaringen met lichaamsbeweging.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AnMiao Star 608 keramische kogellagerAnmiao Star (N/A)AMS127Hoge precisie, lage wrijvingswiellager.  Als het merk en model niet commercieel verkrijgbaar is, zou een alternatieve versie van een 608 lager met lage wrijving, 8 mm boringsdiameter,  22 mm buitendiameter, met silicon nitride keramische kogels in 420 roestvrijstalen behuizing voldoende moeten zijn.  Overmatige wrijving in het wiellager heeft een nadelige invloed op de prestaties van het DART-apparaat en verhoogt de algehele weerstand tegen spiercontracties.
Axio Scope.A1 microscoopCarl Zeiss (Peabody, MA)Product #Axio Scope.A1Licht- en fluorescentiemicroscoop
B6.A-Dysfprmd/GeneJ (a.k.a. BLAJ muizen)The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).  Speciale kolonie onderhouden door The Jain Foundation Inc. voor medewerkers die dysferline bestuderen.Stock #012767Dysferline-deficiënte muizen die humane musculaire dystrofie van het type 2B/R2 modelleren.
Bipolare, transcutane, neuromusculaire elektrische stimulatie (NMES) elektrodeHarvard Apparatus, Holliston, MABS4 50–6824Elektrode voor NMES.  Als deze elektrode niet commercieel verkrijgbaar is, neem dan contact op met de corresponderende auteur voor alternatieven.
Coplin kleuringlootsThermoFisher (Waltham, MA)Catalogusnr. S17495Kleuringsloots/pot voor hematoxyline en eosine (H&E) kleuring van secties
Cura 4.4.1. SoftwareUltimaker, Utrecht, NederlandUltimaker Cura 4.4.1.Slicing software om stereolithography bestanden om te zetten in G-CODE bestanden
Deltaphase isotherme gel verwarmingskussenBraintree Scientific (Braintree, MA)Artikelnr. 39DPVerwarmingskussen om warmteondersteuning te bieden aan dieren tijdens anesthesie
Eosine YMillipore Sigma (Burlington, MA)HT110132-1LRoze cytoplasmatische kleuring
Gorilla SuperlijmThe Gorilla Glue Company (Cincinnati, OH)Gorilla Super Glue Micro PreciseCyanoacrylaatlijm om PLA-componenten te verbinden
Hematoxyline oplossing, Gill No.3Millipore Sigma (Burlington, MA)GHS332-1LDonkerblauwe kleuring voor kernen
HM525NX cryostatThermoFisher (Waltham, MA)Catalogusnr. HM525NXCryostat om bevroren secties van spier te maken
Labdoekjes.  Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-PlyThermoFisher (Waltham, MA)Catalogusnr. 06-666.  Fabrikant #34120Laboratoriumdoekjes om mineraaloliën uit spierweefsel te blotten voordat het snel wordt bevroren en voor andere doeleinden.
Labview 2014National Instruments, Austin, Texas, USALabview 2014Software voor op maat geschreven programma's/routines die de dynamometer bedienen en de NMES-stimulator activeren.
Vloeibare stikstof HDPE Dewar kolvenThermoFisher (Waltham, MA)S34074B.  Thermo Scientific 41502000/EMDKolf om vloeibare stikstof te bevatten voor het snel bevriezen van spier of ander weefsel
Magische ontharingscremeSoftsheen Carson (New York, NY)N/ARazelloze haarverwijderingscrème
Metaal alligator clipJINSHANGTOPK (web-based business)24Pcs 51mm Metal Alligator Clip Spring ClampsSpringklem om tibiale pin vast te houden
MicroscoopglazenGlobe Scientific (Mahwah, NJ)1354W. Diamond White Glass SlidesGelaaide microscoopglazen
Minerale olieThermoFisher (Waltham, MA)BP26291Minerale olie om spierweefsel te cryoprotecteren voordat het snel wordt bevroren
Monoprice Premium 3D Printer Filament PLAMonoprice (Rancho Cucamonga, CA)#11778Premium 3D Printer Filament PLA 1.75mm 1 kg/spoel, Grijs.  Dit is het materiaal dat wordt gebruikt om apparaatcomponenten 3D te printen.
Monoprice Select Mini V2 3D printerMonoprice (Rancho Cucamonga, CA)Mini V2 3D3D-printer voor computerondersteunde fabricage van apparaatcomponenten.
NIH Image softwareNational Instritues of Health (NIH, Bethesda, MD)NIH Image voor WindowsBeeldverwerkings- en analysesoftware die wordt gebruikt om het gebied van spierbeschadiging te kwantificeren.  NIH Image staat ook bekend als Image J.
Photoshop CS4Adobe (San Jose, CA)Creative Suite (CS4). 64 bit versie voor WindowsBeeldverwerkings- en analysesoftware die wordt gebruikt om tegel/gestikte afbeeldingen van de volledige spierdoorsnede te genereren uit afbeeldingen van individuele overlappende velden
PSIU6 stimulatie-isolatie-eenheidGrass Instruments (West Warwick, RI)PSIU6 isolatie-eenheidIsolatie-eenheid voor NMES.  Stimulators, zoals Model 4100 van A-M, worden geleverd met een ingebouwde stimulatie-isolatie-eenheid
Roboz 4-0 zwart gevlochten zijden hechtmateriaalRoboz Surgical (Gaithersburg, MD)Roboz Surgical SUT152Hechtmateriaal om de DART-apparaatvoetplaat te verbinden met de dynamometervoetplaat of weerstand voor weerstandstraining
S48 vierkante pulsstimulatorGrass Instruments (West Warwick, RI)S48 StimulatorLaboratorium elektrische stimulator voor NMES.  Als deze stimulator niet commercieel verkrijgbaar is, kan Model 4100 Isolated High Power Stimulator van A-M systemen een alternatief zijn.  Neem contact op met co-auteur Jones voor meer informatie.
Scott’s blauwmakend reagensRicca Chemical Company (Arlington, TX)6697-32Blauwingsoplossing die hematoxyline nucleaire kleuring intensiveert
SigmaStat versie 3.5Systat Software (San Jose, CA)SigmaStat versie 3.5Statistisch softwarepakket voor statistische analyses
Tafelblad isofluraan verdamperVetEquip (Livermore, CA)

Referenties

  1. Vina, J., Sanchis-Gomar, F., Martinez-Bello, V., Gomez-Cabrera, M. C. Exercise acts as a drug; The pharmacological benefits of exercise. British Journal of Pharmacology. 167 (1), 1-12 (2012).
  2. Murton, A. J., Greenhaff, P. L. Resistance exercise and the mechanisms of muscle mass regulation in humans: Acute effects on muscle protein turnover and the gaps in our understanding of chronic resistance exercise training adaptation. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (10), 2209-2214 (2013).
  3. Pepin, M. E., Roche, J. A., Malek, M. H. Strength Training for Special Populations. Conditioning for Strength and Human Performance. Chandler, T. J., Brown, L. E. , Routledge. Oxfordshire, UK. Chapter 20 547-570 (2019).
  4. Helland, C., et al. Training strategies to improve muscle power: Is Olympic-style weightlifting relevant. Medicine and Science in Sports and Exercise. 49 (4), 736-745 (2017).
  5. Souza, M. K., et al. l-Arginine supplementation blunts resistance exercise improvement in rats with chronic kidney disease. Life Sciences. 232, 116604(2019).
  6. Schmoll, M., et al. SpillOver stimulation: A novel hypertrophy model using co-contraction of the plantar-flexors to load the tibial anterior muscle in rats. PloS One. 13 (11), 0207886(2018).
  7. Adams, G. R., Haddad, F., Bodell, P. W., Tran, P. D., Baldwin, K. M. Combined isometric, concentric, and eccentric resistance exercise prevents unloading-induced muscle atrophy in rats. Journal of Applied Physiology. 103 (5), 1644-1654 (2007).
  8. Guedes, J. M., et al. Muscular resistance, hypertrophy and strength training equally reduce adiposity, inflammation and insulin resistance in mice with diet-induced obesity. Einstein. 18, (2019).
  9. Zhu, W. G., et al. Weight pulling: A novel mouse model of human progressive resistance exercise. Cells. 10 (9), 2459(2021).
  10. Call, J. A., McKeehen, J. N., Novotny, S. A., Lowe, D. A. Progressive resistance voluntary wheel running in the mdx mouse. Muscle & Nerve. 42 (6), 871-880 (2010).
  11. Strickland, J. C., Smith, M. A. Animal models of resistance exercise and their application to neuroscience research. Journal of Neuroscience Methods. 273, 191-200 (2016).
  12. Greising, S. M., Basten, A. M., Schifino, A. G., Call, J. A. Considerations for Small Animal Physical Rehabilitation. Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. Greising, S. M., Call, J. A. , Springer International Publishing. New York, NY. 39-59 (2022).
  13. Roche, J. A. Regenerative Rehabilitation for Nonlethal Muscular Dystrophies. Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. Greising, S. M., Call, J. A. , Springer International Publishing. New York, NY. 61-84 (2022).
  14. Schott, N., Johnen, B., Holfelder, B. Effects of free weights and machine training on muscular strength in high-functioning older adults. Experimental Gerontology. 122, 15-24 (2019).
  15. Naples, R. Dr. Gustav Zander's Victorian-Era Exercise Machines Made the Bowflex Look Like Child's Play. , Smithsonian. Washington, D.C. Available from: https://www.smithsonianmag.com/smithsonian-institution/gustav-zander-victorian-era-exercise-machines-bowflex-180957758/ (2016).
  16. Hansson, N., Ottosson, A. Nobel prize for physical therapy? Rise, fall, and revival of medico-mechanical institutes. Physical Therapy. 95 (8), 1184-1194 (2015).
  17. ACSM. American College of Sports Medicine position stand. Progression models in resistance training for healthy adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 41 (3), 687-708 (2009).
  18. Suchomel, T. J., Nimphius, S., Bellon, C. R., Hornsby, W. G., Stone, M. H. Training for muscular strength: Methods for monitoring and adjusting training intensity. Sports Medicine. 51 (10), 2051-2066 (2021).
  19. Bloch, R. J., et al. Small-Animal Unit for Muscle Injury, Muscle Testing and Muscle Training in Vivo. US Patent. , CA2745550A1 patents.google.com/patent/CA2745550A1/en (2012).
  20. Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., McMillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e2782(2011).
  21. Begam, M., et al. Diltiazem improves contractile properties of skeletal muscle in dysferlin-deficient BLAJ mice, but does not reduce contraction-induced muscle damage. Physiological Reports. 6 (11), 13727(2018).
  22. Begam, M., et al. The effects of concentric and eccentric training in murine models of dysferlin-associated muscular dystrophy. Muscle and Nerve. 62 (3), 393-403 (2020).
  23. Straub, V., Murphy, A., Udd, B. 229th ENMC international workshop: Limb girdle muscular dystrophies - Nomenclature and reformed classification Naarden, the Netherlands. Neuromuscular Disorders. 28 (8), 702-710 (2018).
  24. Kniffin, C. L. DYSFERLIN. , OMIM. Available from: https://www.omim.org/entry/603009 (2021).
  25. Millay, D. P., et al. Genetic manipulation of dysferlin expression in skeletal muscle: Novel insights into muscular dystrophy. American Journal of Pathology. 175 (5), 1817-1823 (2009).
  26. Nagy, N., et al. Hip region muscular dystrophy and emergence of motor deficits in dysferlin-deficient Bla/J mice. Physiological Reports. 5 (6), 13173(2017).
  27. Roche, J. A., Lovering, R. M., Bloch, R. J. Impaired recovery of dysferlin-null skeletal muscle after contraction-induced injury in vivo. Neuroreport. 19 (16), 1579-1584 (2008).
  28. Roche, J. A., et al. Extensive mononuclear infiltration and myogenesis characterize recovery of dysferlin-null skeletal muscle from contraction-induced injuries. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 298 (2), 298-312 (2010).
  29. Roche, J. A., Ru, L. W., Bloch, R. J. Distinct effects of contraction-induced injury in vivo on four different murine models of dysferlinopathy. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 134031(2012).
  30. Roche, J. A., et al. Myofiber damage precedes macrophage infiltration after in vivo injury in dysferlin-deficient A/J mouse skeletal muscle. American Journal of Pathology. 185 (6), 1686-1698 (2015).
  31. Ingalls, C. P., Warren, G. L., Zhang, J. Z., Hamilton, S. L., Armstrong, R. B. Dihydropyridine and ryanodine receptor binding after eccentric contractions in mouse skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 96 (5), 1619-1625 (2004).
  32. Dutton, M. Orthopaedics for the Physical Therapist Assistant. , Jones & Bartlett Publishers. Burlington, MA. 238(2011).
  33. Begam, M., Abro, V. M., Mueller, A. L., Roche, J. A. Sodium 4-phenylbutyrate reduces myofiber damage in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. Physiologie Appliquée, Nutrition et Métabolisme. 41 (10), 1108-1111 (2016).
  34. Tully, J. J., Meloni, G. N. A scientist's guide to buying a 3D printer: How to choose the right printer for your laboratory. Analytical Chemistry. 92 (22), 14853-14860 (2020).
  35. Schwiening, C. 3D printing primer for physiologists. Physiology News. (101), (2015).
  36. Begam, M., Roche, J. A. Damaged muscle fibers might masquerade as hybrid fibers - A cautionary note on immunophenotyping mouse muscle with mouse monoclonal antibodies. European Journal of Histochemistry. 62 (3), 2896(2018).
  37. Lott, D. J., et al. Safety, feasibility, and efficacy of strengthening exercise in Duchenne muscular dystrophy. Muscle & Nerve. 63 (3), 320-326 (2021).
  38. Lindsay, A., Larson, A. A., Verma, M., Ervasti, J. M., Lowe, D. A. Isometric resistance training increases strength and alters histopathology of dystrophin-deficient mouse skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 126 (2), 363-375 (2019).
  39. Dalkin, W., Taetzsch, T., Valdez, G. The fibular nerve Injury method: A reliable assay to identify and test factors that repair neuromuscular junctions. Journal of Visualized Experiments. (114), e54186(2016).
  40. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936(2016).
  41. Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696(2019).
  42. Brightwell, C. R., et al. In vivo measurement of knee extensor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (169), e62211(2021).
  43. Pratt, S. J. P., Lawlor, M. W., Shah, S. B., Lovering, R. M. An in vivo rodent model of contraction-induced injury in the quadriceps muscle. Injury. 43 (6), 788-793 (2012).
  44. Shields, R. K. Precision rehabilitation: How lifelong healthy behaviors modulate biology, determine health, and affect populations. Physical Therapy. 102 (1), 248(2022).
  45. Medical Rehabilitation Research Resource Network (MR3N). Precision Rehabilitation - Inaugural Scientific Retreat. , Available from: https://ncmrr.org/education-training/archived-presentations/precision-rehab-archive (2021).
  46. Roche, J. A., et al. Minimally invasive muscle embedding generates donor-cell-derived muscle fibers that express desmin and dystrophin. Military Medicine. 185, 423-429 (2020).
  47. Roche, J. A., et al. Minimally invasive muscle embedding (MIME), facilitates the development of functional muscle fibers of human cadaveric origin, in host mice. The FASEB Journal. 33, 602(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Progressieve WeerstandstrainingMuismodelMusculus Tibialis AnteriorIsometrische ContractiesConcentrische ContractiesNeuromusculaire AandoeningDynamometrie beoordelingElektrische Stimulatie
Doseringsgecorrigeerde weerstandstraining bij muizen met een verminderd risico op spierschade
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.