Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In vitro Apiical-Out Enteroid Model van Necrotiserende Enterocolitis

2.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64003

⸱

8 juni 2022

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Neonatal-Perinatal Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center and Center for Pregnancy and Newborn Health

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een apicale necrotiserende enterocolitis (NEC)-in-een-schotelmodel met behulp van enteroïden in de dunne darm met omgekeerde polariteit, waardoor toegang tot het apicale oppervlak mogelijk is. We bieden een immunofluorescentiekleuringsprotocol om NEC-gerelateerde epitheliale verstoring te detecteren en een methode om de levensvatbaarheid te bepalen van apicale enteroïden die zijn onderworpen aan het NEC-in-a-dish-protocol.

Samenvatting

Necrotiserende enterocolitis (NEC) is een verwoestende ziekte die premature baby's treft, gekenmerkt door darmontsteking en necrose. Enteroïden zijn onlangs naar voren gekomen als een veelbelovend systeem om gastro-intestinale pathologieën te modelleren. Momenteel gebruikte methoden voor enteroïde manipulatie hebben echter geen toegang tot het apicale oppervlak van het epitheel (driedimensionaal [3D]) of zijn tijdrovend en resource-intensief (tweedimensionale [2D] monolagen). Deze methoden vereisen vaak extra stappen, zoals micro-injectie, om het model fysiologisch vertaalbaar te maken. Hier beschrijven we een fysiologisch relevant en goedkoop protocol voor het bestuderen van NEC in vitro door enteroïde polariteit om te keren, wat resulteert in het apicale oppervlak naar buiten gericht (apiical-out). Een immunofluorescentiekleuringsprotocol om de integriteit van de enteroïde barrière en junctionele eiwitexpressie na blootstelling aan tumornecrosefactor-alfa (TNF-α) of lipopolysaccharide (LPS) onder normoxische of hypoxische omstandigheden te onderzoeken, wordt ook verstrekt. De levensvatbaarheid van 3D apiical-out enteroïden blootgesteld aan normoxische of hypoxische LPS of TNF-α gedurende 24 uur wordt ook geëvalueerd. Enteroïden blootgesteld aan LPS of TNF-α vertoonden, in combinatie met hypoxie, verstoring van de epitheliale architectuur, een verlies van adherens junction eiwitexpressie en een vermindering van de levensvatbaarheid van cellen. Dit protocol beschrijft een nieuw apicale NEC-in-een-schotelmodel dat een fysiologisch relevant en kosteneffectief platform presenteert om potentiële epitheliale doelen voor NEC-therapieën te identificeren en de premature intestinale respons op therapeutica te bestuderen.

Inleiding

Necrotiserende enterocolitis (NEC), een ernstige ontstekingsziekte van de dunne darm die voorkomt bij maximaal 10% van de te vroeg geboren baby's, wordt vaak geassocieerd met hoge morbiditeit en mortaliteit 1,2. Sterftecijfers van bijna 50% bij baby's met een zeer laag geboortegewicht (<1500 g), die chirurgische ingrepen vereisen, zijn niet ongewoon3. Hoewel de exacte etiologie van NEC momenteel niet wordt begrepen, wordt gedacht dat risicofactoren, zoals kunstvoeding, zich vermengen met fysiologische anomalieën, zoals dysbiose, een onrijp darmepitheel en een disfunctionele darmbarrière, bij de ontwikkeling van de ziekte 2,4. Ondanks aanzienlijke inspanningen is er de afgelopen tien jaar weinig vooruitgang geboekt in de preventie of behandeling van NEC5. Een nieuwe in vitro methode om NEC en geassocieerde intestinale epitheliale barrièredisfunctie te bestuderen, is vereist om het begrip van de pathogenese van de ziekte te bevorderen, omdat bevindingen van diermodellen tot nu toe slecht zijn vertaald naar het bed6.

Een aantal in vitro modellen zijn gebruikt om de mechanismen die spelen tijdens NEC te onderzoeken. De menselijke intestinale epitheelcellijn, Caco-2, is een van de meest gebruikte in vitro modellen van NEC 7,8. Caco-2-cellen emuleren morfologische kenmerken van de dunne darm, maar differentiëren als cellijn niet in de grote verscheidenheid aan in vivo celtypen, waaronder slijmproducerende bokaalcellen, die nodig zijn voor een zeer vertaalbaar model. HT-29-MTX, menselijke colon adenocarcinoom cellen, omvatten een gemengd enterocyten- en bokaalcelfenotype, maar missen nog steeds op crypten gebaseerde celtypen van het darmepitheel9. IEC-6 en IEC-18 zijn niet-getransformeerde cellijnen met een onrijpe ileale crypte-achtige morfologie, maar zijn niet afgeleid van menselijk weefsel, waardoor hun translationele capaciteit wordt beperkt. FHs 74-Int en H4 darmcellijnen zijn afgeleid van menselijk foetaal weefsel en vormen geen tight junctions of gepolariseerde monolagen 10,11, en zijn dus onvolgroeid in vergelijking met zelfs de meest premature baby's die vatbaar zijn voor NEC. Meestal gebruiken NEC in vitro modellen lipopolysaccharide (LPS) behandelingen om toll-like receptor 4 (TLR4) te induceren, een belangrijke receptor die darmontsteking in NEC12 initieert. Schade gemedieerd door reactieve zuurstofsoorten (ROS) behandeling, meestal via waterstofperoxide, wordt vaak gebruikt om NEC-achtige oxidatieve schade en apoptose 13,14 te induceren. Als de belangrijkste aanjager van darmontsteking wordt tumornecrosefactor-alfa (TNF-α), een stroomafwaartse component van de inflammatoire TLR4-signalering, ook vaak gebruikt in deze in vitro modellen om in vivo pathogenese na te bootsen15.

Organoïden, gegenereerd uit induceerbare pluripotente stamcellen (iPSC's), zijn in populariteit gegroeid als een in vitro model van de darm vanwege hun vermogen om de complexe in vivo architectuur en celachtige samenstelling van het weefsel waaruit ze zijn afgeleid te recapituleren16,17. Een verwant in vitro systeem, enteroïden, zijn organoïden afgeleid van gereseceerde darmcrypten die gemakkelijker kunnen worden vastgesteld en onderhouden dan van iPSC afgeleide organoïden. Enteroïden worden meestal gekweekt in een driedimensionale (3D) extracellulaire matrix (ECM) met experimentele toegang beperkt tot het basolaterale celoppervlak. Methoden, zoals micro-injectie18,19, zijn ontwikkeld om deze barrière naar het apicale oppervlak te overwinnen, maar de opbouw van afgesleten cellulair puin en slijm in het lumen maakt micro-injectie zowel technisch moeilijk als inconsistent. Aangezien aangepaste robotische micro-injectieplatforms niet breed toegankelijk zijn20, worden lab-to-lab variabiliteit in technische vaardigheden en algemene techniek belangrijke variabelen die moeten worden overwonnen met micro-injectieprotocollen. Tweedimensionale (2D) monolagen afgeleid van gedissocieerde 3D-enteroïden, die nog steeds alle belangrijke celtypen van het darmepitheel omvatten, bieden toegang tot het apicale oppervlak, maar zijn traditioneel moeilijk te onderhouden zonder een feederlaag van mesenchymale myofibroblasten21. Hoewel celkweekdoorlatende steunen kunnen worden gebruikt om toegang te krijgen tot zowel de apicale als de basolaterale zijden van enteroïde monolagen zonder het gebruik van onderliggende myofibroblasten, vereisen deze inserts excisie en montage van het membraan voor gebruik met modaliteiten zoals confocale microscopie, wat resulteert in een technisch veeleisender en moeilijker proces bij gebruik van traditionele microscopiemethoden22. NEC is in vitro gemodelleerd met behulp van traditionele 3D-enteroïden 23,24,25 en permeabele ondersteunt26,27, en darmontsteking is onlangs gerepliceerd met darm-op-een-chip modellen28,29. Hoewel gut-on-a-chip-modellen met microfluïdica verreweg de meest geavanceerde en vertaalbare modellen zijn, is deze technologie duur, complex en ontoegankelijk voor de meeste onderzoekers30.

Recente ontwikkelingen in apiical-out enteroïde technieken hebben gemakkelijker toegang tot het apicale oppervlak van 3D-enteroïden mogelijk gemaakt zonder het risico te lopen de structurele integriteit van het in vitro epitheel te beschadigen 31,32,33. Apicale enteroïden delen de celtypesamenstelling en barrièrefunctie van in vivo darmepitheel, maar, in tegenstelling tot typische 3D-enteroïden, worden de apicale oppervlakken van deze cellen geconfronteerd met het kweekmedium, waardoor meer fysiologisch relevante studies mogelijk zijn over de absorptie van voedingsstoffen, microbiële infectie en luminale secretie31. Een bijkomend voordeel van apicale enteroïden is het vermogen om experimentele middelen homogeen te verdelen over enteroïden. Het variëren van behandelingsvolumes op basis van enteroïde grootte is niet vereist, zoals bij micro-injectie, en het vermogen om deze enteroïden in suspensiecultuur te houden, ontkent elke ECM-interferentie op experimentele agentdiffusie32.

Necrotiserende enterocolitis is een multifactoriële ziekte waarbij meerdere intestinale epitheelceltypen en een verscheidenheid aan omgevings- en pathofysiologische factorenbetrokken zijn 34. De gevarieerde celsamenstelling van intestinale enteroïden is een duidelijke verbetering ten opzichte van monoculturen bij het modelleren van een complexe ziekte zoals NEC. Interessant is dat, terwijl een enkele inflammatoire blootstelling vaak voldoende is om schade te veroorzaken in in vitro monoculturen, enteroïden, zoals bij muismodellen23, minimaal twee ontstekingscomponenten nodig lijken te hebben om NEC-achtige schade te induceren6. Hier presenteren we een apicale NEC-in-een-schotelmodel, met behulp van apicale enteroïden in combinatie met hypoxie (een belangrijk klinisch kenmerk van NEC6) en LPS- of TNF-α, als een verbeterd en meer fysiologisch relevant in vitro model om epitheliale reacties op NEC-achtige ontsteking te bestuderen en mogelijk therapeutische doelen te identificeren. We beschrijven een protocol voor het omkeren van de polariteit van dunne darm 3D-enteroïden, evenals een immunofluorescent kleuringsprotocol om epitheliale barrièreverstoring en junctionele eiwitexpressieveranderingen te identificeren. Ten slotte demonstreren we verder een eenvoudige enteroïde levensvatbaarheidstest om de impact van ons dual-hit, apiical-out NEC-in-a-dish-model te bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures in deze studie werden goedgekeurd door het University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee. Dunne darm gemaksmonsters van een premature niet-menselijke primaat (NHP, 90% dracht, olijfbaviaan, Papio anubis) werden verkregen na euthanasie voor een afzonderlijke studie (Protocol #101523-16-039-I).

1. Opstelling van het apicale-uit enteroïde NEC-in-een-schotelmodel

  1. Voorbereiding van media- en enteroïde behandelingen
    OPMERKING: Eenmaal bereid volgens de standaard aseptische techniek, kunnen de media maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard.
    1. Bereid antibioticavrije media (AFM) door 50 ml menselijke organoïde groeimedia te mengen met 50 ml organoïde supplement (zie materiaaltabel). Bereid 5 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur/1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (EDTA/PBS) door 100 μL van 0,5 M EDTA toe te voegen aan 9.900 μL PBS.
    2. Koel Dulbecco's gemodificeerde eagle's medium/nutriënt Ham's mengsel F12 + 15 mM HEPES Buffer (DMEM/F12) bij 2-8 °C.
    3. Bereid TNF-α stamoplossing door 100 μg TNF-α poeder in 1 ml 1x PBS te suspenseren. Verdun de TNF-α voorraad verder tot concentraties van 20 ng/ml en 50 ng/ml met AFM als oplosmiddel. Bereid LPS-stamoplossing door 2 mg LPS in 1 ml 1x PBS te suspenseren. Verdun de voorraad LPS verder tot 100 μg/ml en 200 μg/ml met AFM als oplosmiddel.
  2. De polariteit van 3D-enteroïden omkeren
    OPMERKING: De volgende procedure is bedoeld voor het omkeren van een enkele 24-well flat-bottom weefselkweekplaat in twee 24-well ultra-low attachment weefselkweekplaten. De weefselkweekplaten moeten gedurende ten minste 30 minuten vóór gebruik worden opgewarmd tot 37 °C. De afleiding van basolaterale 3D-enteroïden werd bereikt zoals eerder beschreven door vele groepen35,36, met kleine aanpassingen voor media (hierboven beschreven). De algemene enteroïde afleidingsprocedure verschilt niet van die van mensen. Kortom, weggesneden weefsel wordt gewassen, in kleine fragmenten gesneden en geïncubeerd in celverstoringsbuffer. De celoplossing wordt vervolgens door een celzeef van 70 μM geleid, wat resulteert in crypten die met een hoge dichtheid worden verguld.
    1. Aspirate media uit elke put van een 24-well plaat van gevestigde 3D basolaterale enteroïden.
    2. Voeg 500 μL 5 mM ijskoude EDTA/PBS toe aan elke put van de 24-well plaat en verstoor voorzichtig mechanisch het keldermembraanextract/ECM dome door minimaal 5x-6x op en neer te pipetteren met een p200 pipet.
    3. Breng de inhoud van vier putten over in een conische buis van 15 ml en voeg 8 ml ijskoude EDTA / PBS toe aan de conische buis. Breng de resterende 20 putten op dezelfde manier over.
    4. Incubeer 15 ml conische buizen bij 4 °C gedurende 1 uur op een roterend platform of schudder bij 330 tpm. Na de incubatie van 1 uur centrifugeert u de conische buizen bij 300 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant uit elke buis en gooi het weg.
    5. Combineer en was de celpellets met 5 ml DMEM/F12 en verdeel de celsuspensie in twee conische buizen van 15 ml.
    6. Pelleteer de cellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant en voeg 12 ml AFM toe aan elke buis, zodat de celpellets worden geresuspendeerd.
    7. Pipetteer 500 μL van de enteroïde suspensie in elk putje van twee 24-well ultralage bevestigingsplaten.
    8. Incubeer de platen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 2-5 dagen of totdat enteroïden de polariteit hebben omgekeerd.
    9. Om enteroïde omkering te controleren, stelt u eerst de bevestigende immunofluorescente kleuring en de gemiddelde tijd tot omkering (~ 3 dagen) vast en bevestigt u vervolgens de omkering van de polariteit met behulp van een eenvoudige lichtmicroscoopvisualisatie. Apicale enteroïden zien er zeer cellulair uit, terwijl basolaterale enteroïden vaak worden gedomineerd door de aanwezigheid van een groot centraal lumen of ontluikende (zie aanvullende figuur 1).
      OPMERKING: Zodra de procedure is gestandaardiseerd, is de conversieratio naar apiical-out meestal hoger dan 95%. Het gebruik van apiical-out enteroïden is bedoeld als een terminaal experiment, hoewel het theoretisch mogelijk is om apiical-out enteroïden door te geven aan een klein aantal basolaterale enteroïden.
  3. Apicale-uit NEC-in-een-gerecht
    OPMERKING: Zodra de enteroïden de polariteit hebben omgekeerd, gebruikt u de culturen snel in volgende experimenten, omdat hun levensduur in apicale conformatie niet langer dan 3-4 dagen is bevestigd. Voor het volgende NEC-in-a-dish-model werden de enteroïden gedurende 24 uur behandeld, onmiddellijk daarna verzameld en bewaard voor downstream-experimenten.
    1. Zodra de enteroïden de polariteit visueel hebben omgekeerd met ten minste 95% efficiëntie, verwijdert u de platen uit de incubator en verzamelt u acht putten van een 24-well plaat in een conische buis van 15 ml. Omdat de apicale enteroïden in suspensie zijn, pipetteer u eenvoudig de enteroïde / media-oplossing. Centrifugeer de buis van 15 ml bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    2. Zodra de cellen zijn gepelletiseerd, verwijdert u het supernatant en resuspendeert u de celpellet in 4 ml AFM gemengd met het gewenste volume (10 μL hier om overeen te komen met het hoogste toegevoegde behandelingsvolume) van 1x PBS (controle).
    3. Pipetteer 500 μL enteroïde/PBS/AFM-suspensie in acht putjes van een 24-well ultralage bevestigingsplaat en incubeer de plaat bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
    4. Herhaal stap 1.3.1.-1.3.3. voor TNF-α (20 ng/ml en 50 ng/ml) en LPS (100 μg/ml en 200 μg/ml) behandelingen bij normoxie. Herhaal voor alle hypoxiebehandelingen stap 1.3.1.-1.3.3., maar plaats de plaat in een aparte couveuse bij 37 °C, 5% CO2 en 1% O2 gedurende 24 uur.
      OPMERKING: Stap 1.3.4. kan gelijktijdig met stap 1.3.1.-1.3.3 worden uitgevoerd, maar voor de duidelijkheid werd de bovenstaande procedure gescheiden door behandeling om de complexiteit te verminderen.

2. Immunofluorescente kleuring en confocale microscopie

  1. Bereiding van kleuringsoplossingen
    1. Bereid 0,1% Triton X-100 door 7 μL Triton X-100 in 1x PBS te mengen tot een eindvolume van 7 ml. Bereid PBST (PBS-Tween) voor door 30 μL Tween-20 tot 1x PBS toe te voegen aan een eindvolume van 30 ml.
    2. Bereid 10% normaal ezelsserum (NDS)/PBST door 700 μL NDS toe te voegen aan 6,3 ml PBST. Bereid 1% NDS/PBST door 70 μL NDS toe te voegen aan PBST aan een eindvolume van 7 ml.
      OPMERKING: Donkey serum werd hier gebruikt om te correleren met de secundaire antilichaamgastheer. De blokkerende serumsoorten moeten echter overeenkomen met de secundaire antilichaamsoorten om niet-specifieke binding goed te blokkeren.
  2. Kleuring (Dag 1)
    1. Breng de inhoud van vier putten van een 24-wells plaat over naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Herhaal dit voor alle gewenste putten/behandelingen, met elke behandeling in een aparte tube. Centrifugeer de buizen bij 300 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C. Zodra de enteroïden zijn gepelleteerd, verwijdert u het supernatant.
    2. Resuspendeer de celpellets in 300 μL van 4% formaldehydefixatiemiddel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT). Na 30 minuten centrifugeer je de buizen bij 300 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C, verwijder je het supernatant en was je de pellet met 500 μL steriel, RT 1x PBS.
    3. Centrifugeer de buizen bij 300 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant en voeg 500 μL van 0,1% Triton X-100 toe en laat 1 uur op RT zitten.
    4. Na 1 uur centrifugeer je de buizen bij 300 x g gedurende 4 min bij 4 °C en verwijder je het supernatant. Wassen met 500 μL 1x PBS en plaats de buizen op een rotator of shaker bij 200 rpm gedurende 15 min bij 2-8 °C. Herhaal dit in totaal 4x.
    5. Centrifugeer de buizen bij 300 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Voeg 500 μL 10% NDS/PBST toe en incubeer bij RT gedurende 45 min. Bereid tijdens de incubatie primaire antilichaamoplossingen door 20 μL recombinant anti-villine-antilichaam, 10 μL E-cadherine-antilichaam en 1970 μL van 1% NDS / PBST te combineren voor acht putten van een 24-wellsplaat.
    6. Na de incubatie van 45 minuten centrifugeert u de buizen bij 300 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C. Plaats de buisjes op ijs. Verwijder het supernatant en vervang door 250 μL primaire antilichaamoplossing. Incubeer de buizen een nacht bij 2-8 °C.
  3. Kleuring (Dag 2)
    1. Centrifugeer de buizen bij 300 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Voeg 250-500 μL PBST toe aan elke buis, afhankelijk van de grootte van de pellet, en plaats op de rotator of shaker bij 200 tpm gedurende 1 uur bij 2-8 °C. Herhaal de PBST was 4x.
    2. Bereid secundaire antilichaamoplossing door 52 μL Cy3 ezel anti-konijn IgG (H + L) toe te voegen aan 50% glycerol en 5,2 μL ezel anti-muis fluorescerend groen 488 secundaire antilichamen tegen 5142,8 μL van 1% NDS/PBST.
    3. Na de laatste PBST-wasbeurt en centrifugatie verwijdert u het supernatant uit de buizen. Doseer 200 μL secundaire antilichaamoplossing aan elke buis en incubeer in het donker een nacht bij 2-8 °C.
  4. Montage van bevlekte apicale enteroïden (dag 1)
    1. Breng mountant op basis van glycerol met blauwe kernkleurstof gedurende 1 uur aan op RT.
    2. Centrifugeer de buizen bij 300 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C. Verwijder 100 μL van het supernatant en resuspensieer de cellen in de resterende ~100 μL supernatant. Breng de celsuspensie over op buizen van 0,5 ml.
    3. Centrifugeer de buizen in een minicentrifuge gedurende 20 s om de cellen te pelleteren. Verwijder het supernatant en resuspenseer de celkorrels in 100 μL verrode nucleïnezuurvlek. Incubeer de buizen bij RT gedurende 10 min.
    4. Centrifugeer de buizen in een minicentrifuge gedurende 20 s om de cellen te pelleteren. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellets in 100 μL 1x PBS. Herhaal dit voor een tweede wasbeurt.
    5. Centrifugeer de buizen in een minicentrifuge gedurende 20 s om de cellen te pelleteren en verwijder 70 μL van het supernatant. Resuspendeer de cellen in het resterende volume PBS en breng de inhoud over naar een gelabelde coverslip (24 mm x 60 mm).
    6. Breng 75 μL mountant rechtstreeks op het monster aan en verwijder eventuele bubbels met een pipetpunt. Laat de coverslips 's nachts (18-24 uur) bij RT in het donker uitharden.
  5. Montage van bevlekte apicale enteroïden (dag 2)
    1. Breng na een nacht uitharden een dunne laag (~ 15 μL) glycerol aan op de coverslips. Monteer de coverslip op de glasschuif en druk zachtjes op zijn plaats. Tik om eventuele luchtbellen tussen de coverslip en de dia te verwijderen.
    2. Laat de coverslip minimaal 2 uur in het donker op RT zetten, voordat u met een confocale microscoop bij 20x vergroting beeld krijgt. Voor microscopische visualisatie van enteroïden met behulp van verschillende confocale acquisitiemethoden, zie Lallemant et al.37.
  6. Immunofluorescente kwantificering
    OPMERKING: Deze methode bepaalt de gecorrigeerde totale fluorescentie door het achtergrondsignaal te verwijderen met behulp van ImageJ-software (https://imagej.nih.gov/ij/).
    1. Open de confocale afbeeldingen in ImageJ en schets het gewenste gebied met de tool region of interest (ROI).
    2. Stel door de gebruiker gedefinieerde parameters in door te navigeren naar Analyseren > Metingen instellen. Selecteer Gebied > Geïntegreerde dichtheid > Gemiddelde grijze waarde onder het tabblad Instellingen.
    3. Navigeer naar Analyseren > Meten. Er verschijnt een pop-upvenster met de metingen. Kopieer en plak deze metingen in een spreadsheet.
    4. Als u het achtergrondsignaal wilt aftrekken, selecteert u een klein niet-fluorescerend gebied van de afbeelding. Navigeer naar Analyseren > Meten voor die regio. Er verschijnt een pop-upvenster met de metingen. Kopieer en plak de uitvoer in een spreadsheet.
    5. Vermenigvuldig de oppervlakte van de geselecteerde cel met de gemiddelde fluorescentie van achtergrondmetingen en trek de som af van de geïntegreerde dichtheid om de gecorrigeerde totale celfluorescentie (CTCF) te berekenen. Herhaal de bovenstaande stappen voor alle interessante afbeeldingen, terwijl u records bijhoudt in een spreadsheet of statistisch softwarepakket (zie Materiaaltabel).

3. Apicale-out NEC-in-een-schotelcel levensvatbaarheid

  1. Enteroïde behandelingen
    1. Stel een apical-out NEC-in-a-dish-model vast gedurende 24 uur, zoals in stap 1.
    2. Ontdooi de levensvatbaarheid van het reagens van de cel gedurende een nacht bij 4 °C. Breng het reagens op de dag van de test 30 minuten voor gebruik op RT. Keer het reagens om om te mengen.
    3. Verwijder voordat u de test uitvoert 100 μL media uit elke put en laat de resterende 400 μL over. Voeg 400 μL cel levensvatbaarheidstestreagens toe aan elke put.
    4. Meng de inhoud krachtig goed op een platenschudder op RT gedurende 5 minuten bij 200 tpm om cellyse te induceren. Na het schudden incubeer je de plaat bij RT nog eens 25 minuten.
    5. Meng na 25 minuten incubatie de inhoud van een put via pipetteren en breng 200 μL van de 800 μL over naar een enkele put van een 96-well, ondoorzichtige, polystyreen, heldere bodemplaat. Herhaal dit voor de resterende 600 μL en maak vier technische replicaties per put. Breng de resterende inhoud van elke put van de 24-well plaat op deze manier over in een 96-well plaat.
    6. Met behulp van een plaatlezer die in staat is tot luminescentie, registreer waarden bij 0,25 ms integratie en vergelijk de relatieve waarden tussen behandelingen. U kunt ook de luminescentie van de behandeling vergelijken met een adenosinetrifosfaat (ATP) -standaard.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het gebruik van enteroïden om darmontsteking te modelleren, zelfs binnen de context van necrotiserende enterocolitis, is nu gebruikelijk. De meeste methoden die momenteel worden gebruikt, hebben echter geen toegang tot het apicale oppervlak van enteroïden, waardoor de fysiologische relevantie van verbindingen die bedoeld zijn voor uiteindelijk gebruik als orale therapieën wordt ontkend, of zijn technisch moeilijk en tijdrovend, zoals bij enteroïde-afgeleide monolagen. Om het nut van de huidige in vitro enteroïde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De recente ontwikkeling van enteroïde modellen afgeleid van intestinale epitheliale crypten zorgt voor een meer fysiologisch relevant in vitro weefsel om necrotiserende enterocolitis pathogenese te bestuderen. Ondanks het feit dat alle belangrijke gedifferentieerde celtypen van het darmepitheel zijn opgenomen, zijn 3D-enteroïden nog steeds onderhevig aan verschillende significante beperkingen. De conventionele, basolaterale enteroïden worden gesuspendeerd in 3D ECM-hydrogelkoepels, waarvan de samenstelling en di...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen en hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Deze inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. HC wordt ondersteund door subsidie P20GM134973 van de National Institutes of Health. KB wordt ondersteund door een Children's Hospital Foundation (CHF) en Presbyterian Health Foundation (PHF) subsidie. We bedanken het Laboratorium voor Moleculaire Biologie en Cytometrie onderzoek van OUHSC voor het gebruik van de Core Facility, die confocale beeldvorming leverde.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 M EDTA, pH 8.0Fisher Scientific15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubesFisher Scientific05-408-129
15 mL Conical tubeVWR89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability AssayPromegaG9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well MicroplatesFisher Scientific07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mmThermo Scientific102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo ScientificA-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugateSigma-AldrichAP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES bufferSTEMCELL Technologies36254
E-cadherin antibody (7H12)Novus BiologicalsNBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9Millipore Sigma1004960700
GlycerolSigma-Aldrich56-81-5
ImageJFijiN/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)STEMCELL Technologies06010
Leica SP8 Confocal MicroscopeLeica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatographyMillipore SigmaL3012-10MG
Microscope SlidesFisher Scientific12-544-7
Normal Donkey SerumSigma-Aldrich566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom MicroplateThermo Scientific136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4Corning21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlueFisher ScientificP36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]Abcamab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µgBio-Techne210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate ReaderMolecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184LFisher Scientific3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661)Thermo ScientificT3605
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat capThermo ScientificAB0350
Tween-20Sigma-Aldrich9005-64-5

Referenties

  1. Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: an immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776(2011).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  3. Bazacliu, C., Neu, J. Necrotizing enterocolitis: long term complications. Current Pediatric Reviews. 15 (2), 115-124 (2019).
  4. Lim, J. C., Golden, J. M., Ford, H. R. Pathogenesis of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatric Surgery International. 31 (6), 509-518 (2015).
  5. Neu, J. Necrotizing enterocolitis: the future. Neonatology. 117 (2), 240-244 (2020).
  6. Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
  7. Emami, C. N., Mittal, R., Wang, L., Ford, H. R., Prasadarao, N. V. Recruitment of dendritic cells is responsible for intestinal epithelial damage in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by Cronobacter sakazakii. Journal of Immunology. 186 (12), Baltimore, Md. 7067-7079 (2011).
  8. Chen, L., et al. Human β-defensin-3 reduces excessive autophagy in intestinal epithelial cells and in experimental necrotizing enterocolitis. Scientific Reports. 9 (1), 19890(2019).
  9. De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761(2021).
  10. Gimeno-Alcañiz, J. V., Collado, M. C. Impact of human milk on the transcriptomic response of fetal intestinal epithelial cells reveals expression changes of immune-related genes. Food & Function. 10 (1), 140-150 (2019).
  11. Claud, E. C., Savidge, T., Walker, W. A. Modulation of human intestinal epithelial cell IL-8 secretion by human milk factors. Pediatric Research. 53 (3), 419-425 (2003).
  12. De Plaen, I. G. Inflammatory signaling in necrotizing enterocolitis. Clinics in Perinatology. 40 (1), 109-124 (2013).
  13. Subramanian, S., Geng, H., Tan, X. D. Cell death of intestinal epithelial cells in intestinal diseases. Sheng Li Xue Ba : [Acta Physiologica Sinica]. 72 (3), 308-324 (2020).
  14. Li, B., et al. Intestinal epithelial cell injury is rescued by hydrogen sulfide. Journal of Pediatric Surgery. 51 (5), 775-778 (2016).
  15. Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum reduces apoptosis in the intestinal epithelium in necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (5), 1118-1127 (2010).
  16. Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology - a review of methods. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
  17. Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (12), 1359-1363 (2012).
  18. Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of helicobacter pylori. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (105), e53359(2015).
  19. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  20. Williamson, I. A., et al. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
  21. Moorefield, E. C., Blue, R. E., Quinney, N. L., Gentzsch, M., Ding, S. Generation of renewable mouse intestinal epithelial cell monolayers and organoids for functional analyses. BMC Cell Biology. 19 (1), 15(2018).
  22. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  23. Werts, A. D., et al. A novel role for necroptosis in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 403-423 (2020).
  24. Li, B., et al. Intestinal epithelial tight junctions and permeability can be rescued through the regulation of endoplasmic reticulum stress by amniotic fluid stem cells during necrotizing enterocolitis. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 35 (1), 21265(2021).
  25. Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. JoVE:Journal of Visualized Experiments. (146), e59194(2019).
  26. Senger, S., et al. Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
  27. Li, B., et al. Activation of Wnt signaling by amniotic fluid stem cell-derived extracellular vesicles attenuates intestinal injury in experimental necrotizing enterocolitis. Cell Death & Disease. 11 (9), 750(2020).
  28. Beaurivage, C., et al. Development of a human primary gut-on-a-chip to model inflammatory processes. Scientific Reports. 10 (1), 21475(2020).
  29. Jeon, M. S., et al. Contributions of the microbiome to intestinal inflammation in a gut-on-a-chip. Nano Convergence. 9 (1), 8(2022).
  30. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
  31. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  32. Co, J. Y., Margalef-Català, M., Monack, D. M., Amieva, M. R. Controlling the polarity of human gastrointestinal organoids to investigate epithelial biology and infectious diseases. Nature Protocols. 16 (11), 5171-5192 (2021).
  33. Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).
  34. Li, B., et al. Neonatal intestinal organoids as an ex vivo approach to study early intestinal epithelial disorders. Pediatric Surgery International. 35 (1), 3-7 (2019).
  35. Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue. Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).
  36. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (97), e52483(2015).
  37. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141(2020).
  38. Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
  39. Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372(2020).
  40. Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
  41. Schneider, M. R., et al. A key role for E-cadherin in intestinal homeostasis and Paneth cell maturation. PLoS One. 5 (12), 14325(2010).
  42. Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum improves intestinal integrity in a rat model of necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (5), 940-949 (2009).
  43. Khailova, L., et al. Changes in hepatic cell junctions structure during experimental necrotizing enterocolitis: effect of EGF treatment. Pediatric Research. 66 (2), 140-144 (2009).
  44. Ravisankar, S., et al. Necrotizing enterocolitis leads to disruption of tight junctions and increase in gut permeability in a mouse model. BMC Pediatrics. 18 (1), 372(2018).
  45. Han, X., et al. Creating a more perfect union: modeling intestinal bacteria-epithelial interactions using organoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 769-782 (2021).
  46. Joo, S. S., et al. Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study. Animals: An Open Access Journal from MDPI. 12 (3), 372(2022).
  47. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocols. 2 (4), 100951(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Apicaal uitwaartse enteroidenpolariteitsomkering van enteroidenintestinale inflammatiein vitro modelbarri reintegriteitimmunofluorescente kleuringcelviabiliteitsassayhypoxiebehandelingconfocale microscopie
In vitro Apiical-Out Enteroid Model van Necrotiserende Enterocolitis
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.