Dit protocol beschrijft een apicale necrotiserende enterocolitis (NEC)-in-een-schotelmodel met behulp van enteroïden in de dunne darm met omgekeerde polariteit, waardoor toegang tot het apicale oppervlak mogelijk is. We bieden een immunofluorescentiekleuringsprotocol om NEC-gerelateerde epitheliale verstoring te detecteren en een methode om de levensvatbaarheid te bepalen van apicale enteroïden die zijn onderworpen aan het NEC-in-a-dish-protocol.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In vitro Apiical-Out Enteroid Model van Necrotiserende Enterocolitis
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Necrotiserende enterocolitis (NEC) is een verwoestende ziekte die premature baby's treft, gekenmerkt door darmontsteking en necrose. Enteroïden zijn onlangs naar voren gekomen als een veelbelovend systeem om gastro-intestinale pathologieën te modelleren. Momenteel gebruikte methoden voor enteroïde manipulatie hebben echter geen toegang tot het apicale oppervlak van het epitheel (driedimensionaal [3D]) of zijn tijdrovend en resource-intensief (tweedimensionale [2D] monolagen). Deze methoden vereisen vaak extra stappen, zoals micro-injectie, om het model fysiologisch vertaalbaar te maken. Hier beschrijven we een fysiologisch relevant en goedkoop protocol voor het bestuderen van NEC in vitro door enteroïde polariteit om te keren, wat resulteert in het apicale oppervlak naar buiten gericht (apiical-out). Een immunofluorescentiekleuringsprotocol om de integriteit van de enteroïde barrière en junctionele eiwitexpressie na blootstelling aan tumornecrosefactor-alfa (TNF-α) of lipopolysaccharide (LPS) onder normoxische of hypoxische omstandigheden te onderzoeken, wordt ook verstrekt. De levensvatbaarheid van 3D apiical-out enteroïden blootgesteld aan normoxische of hypoxische LPS of TNF-α gedurende 24 uur wordt ook geëvalueerd. Enteroïden blootgesteld aan LPS of TNF-α vertoonden, in combinatie met hypoxie, verstoring van de epitheliale architectuur, een verlies van adherens junction eiwitexpressie en een vermindering van de levensvatbaarheid van cellen. Dit protocol beschrijft een nieuw apicale NEC-in-een-schotelmodel dat een fysiologisch relevant en kosteneffectief platform presenteert om potentiële epitheliale doelen voor NEC-therapieën te identificeren en de premature intestinale respons op therapeutica te bestuderen.
Inleiding
Necrotiserende enterocolitis (NEC), een ernstige ontstekingsziekte van de dunne darm die voorkomt bij maximaal 10% van de te vroeg geboren baby's, wordt vaak geassocieerd met hoge morbiditeit en mortaliteit 1,2. Sterftecijfers van bijna 50% bij baby's met een zeer laag geboortegewicht (<1500 g), die chirurgische ingrepen vereisen, zijn niet ongewoon3. Hoewel de exacte etiologie van NEC momenteel niet wordt begrepen, wordt gedacht dat risicofactoren, zoals kunstvoeding, zich vermengen met fysiologische anomalieën, zoals dysbiose, een onrijp darmepitheel en een disfunctionele darmbarrière....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierprocedures in deze studie werden goedgekeurd door het University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee. Dunne darm gemaksmonsters van een premature niet-menselijke primaat (NHP, 90% dracht, olijfbaviaan, Papio anubis) werden verkregen na euthanasie voor een afzonderlijke studie (Protocol #101523-16-039-I).
1. Opstelling van het apicale-uit enteroïde NEC-in-een-schotelmodel
- Voorbereiding van media- en enteroïde behandelingen
OPMERKING: Eenmaal bereid volgens de standaard aseptische techniek, kunnen de media maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het gebruik van enteroïden om darmontsteking te modelleren, zelfs binnen de context van necrotiserende enterocolitis, is nu gebruikelijk. De meeste methoden die momenteel worden gebruikt, hebben echter geen toegang tot het apicale oppervlak van enteroïden, waardoor de fysiologische relevantie van verbindingen die bedoeld zijn voor uiteindelijk gebruik als orale therapieën wordt ontkend, of zijn technisch moeilijk en tijdrovend, zoals bij enteroïde-afgeleide monolagen. Om het nut van de huidige in vitro enteroïde.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De recente ontwikkeling van enteroïde modellen afgeleid van intestinale epitheliale crypten zorgt voor een meer fysiologisch relevant in vitro weefsel om necrotiserende enterocolitis pathogenese te bestuderen. Ondanks het feit dat alle belangrijke gedifferentieerde celtypen van het darmepitheel zijn opgenomen, zijn 3D-enteroïden nog steeds onderhevig aan verschillende significante beperkingen. De conventionele, basolaterale enteroïden worden gesuspendeerd in 3D ECM-hydrogelkoepels, waarvan de samenstelling en di.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen en hebben geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Deze inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. HC wordt ondersteund door subsidie P20GM134973 van de National Institutes of Health. KB wordt ondersteund door een Children's Hospital Foundation (CHF) en Presbyterian Health Foundation (PHF) subsidie. We bedanken het Laboratorium voor Moleculaire Biologie en Cytometrie onderzoek van OUHSC voor het gebruik van de Core Facility, die confocale beeldvorming leverde.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Fisher Scientific | 15575-020 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates | Fisher Scientific | 07-200-602 | |
| Cover Glass 24 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 102460 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A-21202 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate | Sigma-Aldrich | AP182C | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| E-cadherin antibody (7H12) | Novus Biologicals | NBP2-19051 | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Millipore Sigma | 1004960700 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| ImageJ | Fiji | N/A | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | |
| Leica SP8 Confocal Microscope | Leica Biosystems | ||
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | 566460 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 136101 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue | Fisher Scientific | P36983 | |
| Recombinant Anti-Villin antibody [SP145] | Abcam | ab130751 | |
| Recombinant Human TNF-α protein 100 µg | Bio-Techne | 210-TA-100/CF | |
| SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L | Fisher Scientific | 3140 | |
| TO-PRO-3 Iodide (642/661) | Thermo Scientific | T3605 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Tubes, 0.5 mL, flat cap | Thermo Scientific | AB0350 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 |
Referenties
- Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: an immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776(2011).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Jo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
