Method Article

Een eenvoudig pittestprotocol om osteoclastische resorptie in vitro te visualiseren en te kwantificeren

DOI:

10.3791/64016

⸱

June 16th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Hospital Tübingen, 3Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro
Posted by JoVE Editors on 6/10/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/64016

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een eenvoudige en effectieve testprocedure voor resorptieputtests met behulp van met calciumfosfaat gecoate celkweekplaten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volwassen osteoclasten zijn multinucleaire cellen die bot kunnen afbreken door de afscheiding van zuren en enzymen. Ze spelen een cruciale rol bij verschillende ziekten (bijv. Osteoporose en botkanker) en zijn daarom belangrijke onderzoeksobjecten. In vitro kan hun activiteit worden geanalyseerd door de vorming van resorptieputten. In dit protocol beschrijven we een eenvoudige pit assay methode met behulp van calciumfosfaat (CaP) gecoate celkweekplaten, die gemakkelijk kunnen worden gevisualiseerd en gekwantificeerd. Osteoclastenprecursoren afgeleid van menselijke perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) werden gekweekt op de gecoate platen in aanwezigheid van osteoclastogene stimuli. Na 9 dagen incubatie werden osteoclasten gefixeerd en gekleurd voor fluorescentiebeeldvorming, terwijl de CaP-coating werd tegengekleurd door calceïne. Om het geresorbeerde gebied te kwantificeren, werd de CaP-coating op platen gekleurd met 5% AgNO3 en gevisualiseerd door brightfield-beeldvorming. Het resorptieputgebied werd gekwantificeerd met behulp van ImageJ.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osteoclasten (OC's) zijn weefselspecifieke macrofagen afgeleid van hematopoëtische stamcellen (HSC's), die een cruciale rol spelen bij botremodellering samen met osteoblasten1. Door geslachtshormonen geïnduceerde, immunologische en kwaadaardige botaandoeningen die bot systemisch of lokaal vernietigen, zijn te wijten aan overmatige osteoclastische activiteit, waaronder menopauze-gerelateerde osteoporose2, reumatoïde artritis3, parodontitis4, myeloom botziekte5 en osteolytische botmetastase6. Daarentegen kunnen defecten in OC-vo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol werd beoordeeld en goedgekeurd door de lokale ethische commissie (goedkeuringsnummer 287/2020B02).

1. Bereiding van met calciumfosfaat beklede celkweekplaten

  1. Bereiding van calciumvoorraadoplossing (25 mM CaCl2·2H2O, 1,37 mM NaCl, 15 mM MgCl2·6H2O in Tris-buffer)
    1. Bereid 1,0 M Tris buffer en stel de pH in op 7,4 met behulp van 1 M HCl.
    2. Plaats een glazen bekerglas op een magneetroerder en voeg 100 ml 1,0 M Tris-buffer toe.
    3. Weeg 0,368 g CaCl2·2H 2O, 8,0 g NaCl en 0,305 g MgCl2·6H2O af en l....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De calciumfosfaatcoating op de bodem van celkweekplaten werd uitgevoerd in twee coatingstappen bestaande uit een 3-daagse pre-calcificatie en een 1-daagse verkalkingsstap. Zoals te zien is in figuur 1, werd uniform verdeeld calciumfosfaat verkregen op de bodem van de 96-putplaten. De coating hechtte zeer goed aan de bodem na de uitgevoerde wasstappen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een eenvoudige en betrouwbare methode voor een osteoclastische resorptietest met behulp van OC's afgeleid en uitgebreid in vitro van PBMC's. De gebruikte CaP-gecoate celkweekplaten kunnen eenvoudig worden voorbereid en gevisualiseerd met behulp van in het laboratorium beschikbare materialen. Naast ongesorteerde PBMC's die in dit protocol zijn aangenomen, zijn OC's gegenereerd uit muizenmonocytencellen21 en beenmergmacrofaagcellen17 ook gekweekt .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de China Scholarship Council [CSC Nr. 201808440394]. W.C. werd gefinancierd door CSC.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgNO3SERVA Electrophoresis GmbH35110Silver nitrate
a-MEMGibco32561-029MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides
amphotericin BBiochrom03-028-1BAmphotericin B Solution
CaCl2Sigma-Aldrich21097-50GCalcium chloride Dihydrate
CalceinSigma-AldrichC0875Calcein
FBSSigma-AldrichF7524fetal bovine serum
FicollCytiva17144002Ficoll Paque Plus
Fixation bufferBiolegend420801Paraformaldehyde
HClMerk1.09057.1000Hydrochloric acid
Hoechst 33342PromokinePK-CA707-40046Hoechst 33342
M-CSFPeproTech300-25Recombinant Human M-CSF
MgCl2Sigma-Aldrich7791-18-6Magnesium chloride
Na2HPO4AppliChem GmbHA2943,0250di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous
NaClMerkS7653-250GSodium chloride
NaHCO3MerkK15322429Bicarbonate of Soda
PBSLonza17-512FDulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium
Pen-StrepLonzaDE17-602EPenicillin-Streptomycin Mixture
Phalloidin-Alexa Fluor 546InvitrogenA22283Alexa Fluor 546 Phalloidin
RANKLPeproTech310-01Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived)
TrisSigma-Aldrich93362Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol
TrypLE ExpressGibco12605010Recombinant cell-dissociation enzymes

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
  2. Moller, A. M. J., et al. Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pit AssayOsteoclastic ResorptionCalcium Phosphate CoatingOsteoclast DifferentiationPBMC IsolationResorption Pit QuantificationVon Kossa StainingFluorescence ImagingM CSF RANKLImageJ Analysis

Related Articles