Methodenartikel

Gebruik van dual optische pincet en microfluïdica voor single-molecule studies

DOI:

10.3791/64023

⸱

18 november 2022

1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Nebraska Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Visuele, single-molecule biochemie bestudeerd door microfluïdische kamers wordt aanzienlijk vergemakkelijkt met behulp van glazen vaten, gasdichte spuiten, stabiele verbindingen van slangen met stroomcellen en eliminatie van bellen door schakelkleppen tussen de spuiten en slangen te plaatsen. Het protocol beschrijft dubbele optische vallen die visualisatie van DNA-transacties en intermoleculaire interacties mogelijk maken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Visuele biochemie is een krachtige techniek voor het observeren van de stochastische eigenschappen van afzonderlijke enzymen of enzymcomplexen die worden verduisterd in de middeling die plaatsvindt in bulkfasestudies. Om visualisatie te bereiken, worden dubbele optische pincetten, waarbij de ene val vast is en de andere mobiel is, gericht in één kanaal van een multi-stream microfluïdische kamer die op het podium van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop is geplaatst. Het optische pincet vangt enkele moleculen van fluorescerend gelabeld DNA en vloeistof stroomt door de kamer en langs de gevangen kralen, rekt het DNA uit tot B-vorm (onder minimale kracht, d.w.z. 0 pN) waarbij het nucleïnezuur wordt waargenomen als een witte string tegen een zwarte achtergrond. DNA-moleculen worden van de ene stroom naar de andere verplaatst, door het stadium loodrecht op de stroom te vertalen om het initiëren van reacties op een gecontroleerde manier mogelijk te maken. Om succes te behalen, worden microfluïdische apparaten met optisch heldere kanalen gekoppeld aan glazen spuiten die op hun plaats worden gehouden in een spuitpomp. Optimale resultaten maken gebruik van connectoren die permanent aan de stroomcel zijn bevestigd, buizen die mechanisch stijf en chemisch resistent zijn en die zijn verbonden met schakelkleppen die bellen elimineren die laminaire stroming belemmeren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De mogelijkheid om eiwit-DNA-interacties op het niveau van één molecuul en in realtime te visualiseren, heeft een significant inzicht gegeven in de genoomstabiliteit 1,2. Naast het één voor één werken met enkele DNA-moleculen, biedt de mogelijkheid om transacties tussen individuele moleculen in de buurt te bekijken extra inzicht 3,4,5. De manipulatie van extra DNA-moleculen vereist zowel extra optische vallen als hoogwaardige, meerkanaals, microfluïdische stromingscellen6.

Er zijn verschillende methoden beschikbaar om meer dan één optische val te genereren. Deze omvatten galvanometerscanspiegels, akoestische optische modulatoren en diffractieve optica, die holografische optische pincetten genereren 4,7,8,9. Vaak produceren scanspiegels en akoestische optische modulatoren vallen die timeshare zijn. In de hier beschreven opstelling wordt de straal van een enkele Nd:YAG-laser gesplitst op polarisatie en vervolgens bepalen galvanometerlaserscanspiegels de positie van wat de mobiele val wordt genoemd (figuur 1)4. Om de positionering van spiegels en filters te vergemakkelijken om de vangstraal naar de achterste opening van het microscoopobjectief te richten, wordt een HeNe-laser gebruikt. Dit maakt de algehele uitlijning gemakkelijker omdat de HeNe-straal zichtbaar is voor het blote oog, terwijl infraroodstralen dat niet zijn. De HeNe-straal is ook veiliger om mee te werken, waardoor de positionering van spiegels en andere componenten minder stressvol is. Aanvankelijk is het straalpad voor deze laser gescheiden van de 1064 nm-straal, maar wordt in hetzelfde straalpad en vervolgens in het microscoopobjectief geïntroduceerd. Zodra fysieke uitlijning is bereikt, wordt de 1064 nm-straal bovenop de HeNe-straal geplaatst en dit wordt vergemakkelijkt door het gebruik van een infraroodviewer en verschillende straalbeeldvormingstools om de positie en kwaliteit van de bundel te visualiseren. Vervolgens wordt de bundelexpander geïntroduceerd en wordt de resulterende uitgebreide infraroodstraal uitgelijnd op de achterste opening van het objectief. Ten slotte wordt het doel verwijderd en wordt het vermogen in elke gepolariseerde bundel gemeten en aangepast met behulp van λ/2 golfplaten om gelijk te zijn (figuur 1C). Vermogensmetingen worden ook gedaan zodra het doel is geretourneerd en meestal is er een vermogensverlies van 53%. Er is echter voldoende vermogen om stabiele vaste en bewegende optische vallen in het brandpuntsvlak te vormen (figuur 1D).

Om DNA-transacties in beeld te brengen, spelen microfluïdische stromingscellen een sleutelrol omdat ze gecontroleerde metingen op het niveau van één molecuul met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie mogelijk maken (figuur 2). De term microfluïdisch verwijst naar het vermogen om vloeistoffen te manipuleren in een of meer kanalen met afmetingen variërend van 5-500 μm10,11. De term stroom verwijst naar de werkelijke vloeistof in een kanaal en het kanaal verwijst naar het fysieke kanaal waarin een vloeistofstroom of stromen bewegen. Single-channel flow cell design heeft een gemeenschappelijk, fysiek kanaal waar reacties worden waargenomen en er is meestal slechts één vloeistofstroom aanwezig. Deze ontwerpen staan dus bekend als single-stream flow cellen. Multi-stream flowcellen daarentegen worden gedefinieerd als een microfluïdisch apparaat waarin twee of meer toegangskanalen samenkomen in een enkel, gemeenschappelijk, fysiek kanaal (figuur 2A). Binnen het gemeenschappelijke kanaal stromen de vloeistofstromen die afkomstig zijn van de afzonderlijke kanalen parallel aan elkaar en blijven gescheiden met slechts minimale vermenging tussen hen als gevolg van diffusie (figuur 2B). In de meeste experimentele opstellingen duwt een enkele pomp vloeistoffen met dezelfde snelheid in elk kanaal. Wanneer daarentegen grensbesturing wordt gebruikt, duwen drie of meer onafhankelijk geregelde pompen vloeistoffen door de kanalen. Elke pomp werkt echter met een ander toerental, maar het nettodebiet in het gemeenschappelijke kanaal is constant12. Dit maakt de snelle uitwisseling van hoofdkanaalcomponenten mogelijk door simpelweg de pompsnelheid te wijzigen.

Naast laminaire stroming is een andere kritische factor het parabolische snelheidsprofiel in de laminaire vloeistofstroom. De hoogste stroomsnelheid vindt plaats in het midden van de stroom en de langzaamste vindt plaats naast de oppervlakken (figuur 2C)13. Dit profiel moet worden beschouwd als een volledig uitrekken van een DNA-molecuul dat is bevestigd aan een kraal die in de stroom wordt gehouden voor nauwkeurige visualisatie van fluorescerend DNA en nauwkeurige analyses van één molecuul. Hier wordt het DNA uitgerekt tot B-vorm en op zijn plaats gehouden onder 0 pN kracht. Om dit te bereiken, moet de focus van de optische valpositie op een positie zijn die 10-20 μm van het onderste coverslipoppervlak ligt (figuur 2D). Er moet voor worden gezorgd dat het DNA-molecuul niet verder wordt uitgerekt dan B-vorm, omdat dit enzymreacties kan remmen. Onder typische bufferomstandigheden is 1 μm = 3.000 bp DNA14. Bovendien wordt het DNA-complex, door 10-20 μm van de coverslip te vangen, ver van het oppervlak geplaatst, waardoor oppervlakte-interacties worden geminimaliseerd.

Veel methoden zijn gebruikt om microfluïdische apparaatkanalen te creëren en deze kunnen in het laboratorium worden gedaan of stroomcellen kunnen worden gekocht bij commerciële bronnen 6,15,16,17. De optimale materialen die worden gebruikt om de stromingscellen te construeren, moeten mechanisch stijf, optisch transparant met een lage fluorescentie en ongevoelig voor organische oplosmiddelenzijn 6. Vaak worden borosilicaat floatglas of gesmolten silica gebruikt om gedurende langere tijd een stabiele stroomomgeving te bieden die geschikt is voor optische vangmethoden, visualisatie en krachtdetectie. Deze materialen maken ook het gebruik van niet-waterige oplosmiddelen (bijv. methanol van spectrofotometrische kwaliteit) mogelijk om oppervlaktebevochtiging en verwijdering van luchtbellen te vereenvoudigen, en denaturanten (bijv. 6M guanidiniumhydrochloride) of detergentia om de stroomcel te reinigen. Ten slotte variëren de methoden die worden gebruikt om vloeistoffen in stroomcellen te introduceren van complexe vacuümpompsystemen tot pompen met één spuit 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. In de hier beschreven aanpak wordt een spuitpomp gebruikt die plaats biedt aan maximaal 10 spuiten (figuur 3A). Dit biedt flexibiliteit om eenkanaalsstroomcellen of stroomcellen met meerdere inlaatkanalen te gebruiken. Hier wordt een driekanaals flowcel gebruikt en gekoppeld aan spuiten die op hun plaats worden gehouden op de spuitpomp met behulp van poly-ether-ether-keton (PEEK) -slang (figuur 3A-C). De vloeistofstroom wordt geregeld door vierweg schakelkleppen en dient zo om de introductie van bellen in de stroomcel te minimaliseren (figuur 3A, D). Bovendien worden Hamilton gastdichte spuiten met stijve glazen wanden en polytetrafluorethyleen (PTFE)-gecoate plunjers aanbevolen omdat ze een uitzonderlijk soepele zuigerbeweging bieden die essentieel is voor het verkrijgen van een soepele stroom14,27.

In het beschreven experimentele systeem zijn flowcellen met twee tot vijf inlaatkanalen gebruikt. Het aantal inlaatkanalen wordt bepaald door het experiment dat wordt uitgevoerd. Voor het onderzoek van RecBCD en Hop2-Mnd1 waren twee stroomkanalen voldoende14,28. Voor de helicase werd het enzym gebonden aan het vrije uiteinde van het DNA en vertaald in een stroom met magnesium en ATP om translocatie en afwikkeling te initiëren. Voor Hop2-Mnd1 werd optisch gevangen DNA vertaald in de aangrenzende vloeistofstroom met eiwitten en buffer ± tweewaardige metaalionen. Het gebruik van driekanaals flowcellen stelt iemand in staat om DNA in stroom 1 te vangen, het DNA te vertalen naar stroom 2 om eiwitbinding mogelijk te maken en vervolgens 3 te streamen waar ATP aanwezig is, bijvoorbeeld om reacties te initiëren. Een variatie op het bovenstaande is om fluorescerend getagd eiwit in kanaal 2 te gebruiken, wat resulteert in een volledig witte vloeistofstroom en visualisatie van het DNA uitsluit. Wanneer dit molecuul wordt vertaald in stroom 3, zijn zowel eiwitten als DNA nu zichtbaar wanneer reacties worden geïnitieerd.

Het gebruik van vierweg schakelkleppen om de vloeistofstroom te regelen is een cruciaal onderdeel van het systeem om bellen in de stroomcellen te elimineren. Bellen zijn schadelijk voor een stabiele vloeistofstroom omdat ze samentrekken en op onvoorspelbare manieren uitzetten, wat resulteert in snelle veranderingen in stroomsnelheid en de introductie van turbulentie. Wanneer de kleppen tussen spuiten en inlaatslangen zijn geplaatst, wordt het stroompad losgekoppeld door de kleppositie te wijzigen wanneer spuiten worden vervangen. Wanneer de nieuwe spuit op zijn plaats wordt gezet, kan de zuiger handmatig worden ingedrukt, zodat >6 μL wordt uitgeworpen (het dode volume van de klep) en dit elimineert bijna volledig bubbels.

De bevestiging van connectoren aan stroomcellen is vaak de snelheidsbeperkende stap in het gebruik van stroomcellen. We beschrijven het gebruik van twee soorten connectoren: verwijderbaar bekend als press-fit en permanente connectoren (nanopoortassemblages). De verwijderbare connectoren zijn eenvoudig te hechten aan een flowcel en verschillende soorten flexibele buizen naast de aanbevolen PTFE kunnen met deze connectoren worden getest. Dit is een snelle en kosteneffectieve manier om slangen en connectoren te testen zonder duurdere glazen stromingscellen op te offeren. Nanopoortassemblages daarentegen worden permanent bevestigd, zijn bestand tegen drukken tot 1.000 psi en in onze handen is het gebruik ervan beperkt tot PEEK-buizen van verschillende diameters. Dit is geen nadeel aangezien peek buizen bij voorkeur worden gebruikt. Een enkele glazen flowcel met permanente assemblages kan bij zorgvuldig gebruik meer dan 1 jaar worden hergebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Laserval uitlijning en testen met polystyreen kralen

OPMERKING: Voor de installatie raadpleegt u Figuur 1A,B.

LET OP: De experimentalist moet geschikte beschermende brillen of laserveiligheidsbrillen dragen tijdens het uitlijnen van laserstralen. Aangezien het hierin beschreven optische pincetsysteem zowel HeNe- als IR-stralen gebruikt, zijn twee afzonderlijke sets laserveiligheidsglaswerk vereist.

  1. HeNe Beam uitlijning
    1. Plaats alle optische componenten op het breadboard. Lijn het breadboard zo uit dat het zo dicht mogelijk bij een hoek van 90° ligt ten opzichte van de microscoop.
    2. Bevestig de paringsbuis met daarin de objectief- en telanlens aan de microscoop (figuur 1A-11,12).
      OPMERKING: De telanlens is een lenssysteem dat wordt gebruikt om het beeld scherp te stellen op het tussenliggende beeldvlak in de oculairs.
    3. Schakel de HeNe-laser in en open de sluiter (figuur 1A-18). De bundel moet het filter raken (figuur 1A-3) op een hoogte van 54 mm die 50% van het licht reflecteert op spiegel 5 (figuur 1A-5). De overige 50% van de bundel raakt spiegel 4 (figuur 1A-4) op dezelfde hoogte als spiegel 3.
    4. Stel spiegel 4 (figuur 1A-4) zo in dat de bundel spiegel 6 (figuur 1A-6) op een hoogte van 51 mm raakt.
    5. Stel spiegel 6 (figuur 1A-6) zo in dat de bundel op een hoogte van 51 mm naar de onderste galvanische spiegel wordt gericht. De balk die uit de bovenste Galvanische spiegel komt, komt op 57,5 mm.
    6. Stel spiegel 3 (figuur 1A-3) zo in dat deze bundel spiegel 5 (figuur 1A-5) op een hoogte van 57,5 mm raakt. Eenmaal gereflecteerd door spiegel 5, moet de straal spiegel 9 (figuur 1A-9) op dezelfde hoogte raken. De bundel wordt effectief gerecombineerd bij spiegel 9, gaat door het objectief en het telan-lenssysteem naar spiegel 21 (figuur 1A-21), die het in het objectief reflecteert.
    7. Plaats een schone microscoopglaasje op het podium van de microscoop. Schakel de camera in en beeld de bundels van de vaste en scanstralen afzonderlijk op het scherm. Begin met spiegel 3, dan 5 en 9, ten slotte 21, voer kleine aanpassingen uit om de vaste straal in het midden van het scherm te plaatsen.
    8. Om ervoor te zorgen dat de hoek van de straal uit de spiegel 21 90° is, wijzigt u de Z-hoogte van de microscoop en plaatst u de afgebeelde bundel op de bovenste en onderste oppervlakken van de dia. Wanneer ze identiek zijn, bevindt de bundel zich in de juiste positie, die loodrecht op het podium staat. Sluit deze bundel met sluiter 19 (figuur 1A-19).
    9. Begin met spiegels 4 en 6 en voer kleine aanpassingen uit om de vaste straal in het midden van het scherm te plaatsen. Sluit deze balk.
  2. Infrarood (IR) Beam uitlijning
    LET OP: Voer alle stappen uit bij een laag laservermogen om veiligheidsredenen.
    1. Stel golfplaat 14 (figuur 1A-14) in om de verhouding aan te passen van de verzonden en gereflecteerde bundels die worden gesplitst bij de bundelsplitser 2 (figuur 1A-2). Beam splitter 2 reflecteert de s-component van de laserstraal en zendt de p-component uit.
    2. De straal die door 2 gaat, raakt spiegel 7 (figuur 1A-7), die de straal afbuigt naar de onderste galvanische spiegel. Het moet het pad van de HeNe-straal volgen op spiegel 21. Voer kleine bewegingen van spiegel 7 uit om deze positionering te bereiken.
    3. Stel spiegel 2 zo in dat de straal die wordt gereflecteerd door spiegel 2, spiegel 10 (figuur 1A-10) raakt op een hoogte van 57,5 mm.
    4. De bundel wordt gereflecteerd van spiegel 10 naar spiegel 8 (figuur 1A-8) op een hoogte van 57,5 mm. De volgende balk moet spiegel 9 op dezelfde hoogte raken. Zo niet, maak dan kleine aanpassingen aan spiegels 10 en 8 als dat nodig is.
    5. Verwijder het objectief en plaats de kop van de vermogensmeter over de poort in de objectiefkoepel.
    6. Gebruik platen 14, 15 en 16 (figuur 1A-14,15,16) om het vermogen van elke laserstraal aan te passen zodat ze gelijk zijn aan zoals weergegeven in figuur 1C.
    7. Zet beam expander 1 (Figuur 1A-1) op zijn plaats. Pas de uitgebreide laserstraal aan om cirkelvormig te zijn zonder coma of astigmatisme.
    8. Om de optische vallen te testen, maakt u een oplossing van 1 μm polystyreenparels gesuspendeerd in water. Leg vervolgens 10 μL van deze oplossing op een microscoopglaasje, leg er een deklip op en sluit af met nagellak. Plaats de dia op het microscoopstadium en test de optische vallen door deze kralen van 1 μm te vangen. Zorg ervoor dat de kralen in de vallen worden gezogen en stabiel worden vastgehouden wanneer het podium wordt verplaatst. Het vangen moet van alle kanten van de val even efficiënt plaatsvinden.

2. Microfluïdische kamervoorbereiding

  1. Als de stroomcel een commercieel geconstrueerd apparaat is dat is gemaakt van polydimethylsiloxaan (PDMS) op een coverslip, gaat u verder met stap 3. Als het een glazen apparaat is waaraan connectoren zijn bevestigd, gaat u verder met stap 4.
  2. Als de stroomcel geen connectoren heeft bevestigd, bevestigt u deze eerst aan de ingangsgaten op de microscoopglaasje. Zie stap 3 voor de stappen om connectoren te bevestigen.

3. Stroomcelverbindingen met behulp van een PDMS-stroomcel

OPMERKING: Voor de installatie raadpleegt u Figuur 2D.

  1. Plaats de flowcel op een schoon vlak oppervlak. Houd de PTFE-buis 3 mm van het vrije uiteinde met een tang. Duw de buis in de voorgevormde poort (de poort kan 2 bar lijndruk ondersteunen).
  2. Herhaal deze procedure voor elk van de resterende poorten. Sluit de inlaatpoorten aan op de spuitpomp en de uitlaat op een afvalfles (figuur 4A,B).
  3. Vul elke glazen spuit met 1 ml spectrofotometrische methanol. Bevestig elke spuit aan een schakelklep. Zorg ervoor dat de uitlaat op afval is gericht op de klep en spoel elke lijn met 50 μL methanol (figuur 4C, gesloten positie).
  4. Schakel de uitlaatpositie naar de stroomcel (figuur 4C, open positie). Pomp 800 μL methanol door de stroomcel met een debiet van 100 μL/h om de oppervlakken nat te maken en bellen te elimineren.
  5. Herhaal dit proces de volgende dag met 800 μL ultrapuur water. De flowcel is nu klaar voor gebruik.

4. Bevestiging van persfitbuisconnectoren

OPMERKING: Voor de installatie raadpleegt u Figuur 2F.

  1. Als u buisconnectoren voor persfitting wilt gebruiken, verwijdert u de plakband voorzichtig van één kant van de connector en plaatst u deze over het gat in de microscoopglaas. Druk een paar seconden naar beneden. Herhaal het proces voor de resterende connectoren.
  2. Plaats de flowcel op een schoon vlak oppervlak. Houd de PTFE-buis 3 mm van het vrije uiteinde met een tang. Duw de buis in het voorgevormde gat in de poort en herhaal deze procedure voor elk van de resterende poorten.
  3. Bevestig slangen van de inlaten aan de schakelkleppen. Ga verder met stap 7.

5. Bevestiging van permanente assemblages

OPMERKING: Voor de installatie raadpleegt u Figuur 2A-C.

  1. Voer de bevestiging uit op een schoon, vlak oppervlak of op een op maat gemaakt spruitstuk om de stroomcel en connectoren op hun plaats te houden terwijl het verlijmen plaatsvindt.
  2. Plaats de flowcel op een schoon vlak oppervlak of in het verzonken gedeelte van het spruitstuk (figuur 2B). Plaats een kleine hoeveelheid glaslijm op de bodem van de assemblage en plaats de afdichting.
  3. Plaats de nanopoort boven een van de ingangsgaten op de microscoopglaasjes. Duw zachtjes naar beneden en houd op zijn plaats zonder zijdelingse beweging. Herhaal het proces voor de resterende poorten.
  4. Laat drogen of klem op zijn plaats in het spruitstuk. Verwijder de stroomcel voorzichtig uit het spruitstuk en zorg ervoor dat de assemblages goed zijn uitgelijnd met de ingangspoorten in de stroomcel. Ga verder met stap 7 wanneer u klaar bent.

6. Flow cel verbindingen en voorbereiding

OPMERKING: Voor de installatie raadpleegt u Figuur 4A,B.

  1. Plaats een stroomcel op het microscoopstadium. Bevestig de slang met behulp van de vingervaste connectoren.
  2. Vul elke glazen spuit met 1 ml spectrofotometrische methanol. Bevestig elke spuit aan een schakelklep. Zorg ervoor dat de uitlaat op afval is gericht op de klep en spoel elke lijn met 50 μL methanol (figuur 4C, gesloten positie).
  3. Schakel de uitlaatpositie naar de stroomcel (figuur 4C, open positie). Pomp 800 μL methanol door de stroomcel met een debiet van 100 μL/h om de oppervlakken nat te maken en bellen te elimineren.
  4. Herhaal dit proces de volgende dag met 800 μL ultrapuur water. De flowcel is nu klaar voor gebruik.

7. Controle van de vloeistofstroom

  1. Draai de schakelkleppen in de gesloten stand (figuur 4C). Verwijder de spuiten, gooi het resterende water weg en vul de spuiten met experimentele oplossingen, bijvoorbeeld DNA-kralen; enzym; en ATP. Breng spuiten terug naar de pomp en sluit ze aan op de schakelkleppen.
  2. Dwing in deze positie de plunjers handmatig 5-10 μL naar beneden om eventuele bellen te verwijderen. Wijzig de positie van de schakelklep in Open.
  3. Gebruik het debietschema om een vloeistofstroomsnelheid te bereiken die optimaal is voor overvullen en visualiseren, zoals beschreven in tabel 1. De optimale vloeistofstroom voor optische vangwerking moet stabiele vangst van kralen mogelijk maken en zodra het DNA is uitgerekt, moet het B-vorm zijn (~ 3.000 bp / μm).

8. Vangen van polystyreenparels met enkele DNA-moleculen eraan vast

  1. Zoek bij 10x vergroting de grens tussen vloeistofstromen dicht bij de toegangspunten van het kanaal. Voeg olie toe aan het 100x-objectief en schakel over naar de hogere vergroting.
  2. Open de luiken voor de optische vallen (beide of één voor één). De gefocusseerde laserstralen moeten kralen vangen en DNA moet zich onmiddellijk uitstrekken.
  3. Zodra een complex is gevangen, vertaalt u het stadium loodrecht op de stroom (figuur 3A, C, inzet). Hierdoor wordt het gevangen complex verplaatst van de DNA-kraaloplossing naar stroom 2. Verdere vertaling zal het complex verplaatsen naar stream 3.

9. Flow cel reiniging

OPMERKING: Voer dit dagelijks uit.

  1. Schakel de pomp uit wanneer het experiment is voltooid. Draai de schakelkleppen in de gesloten stand (figuur 4C).
  2. Verwijder spuiten en leeg ze. Spoel drie keer met gefilterd gedestilleerd water.
  3. Vul de spuiten met een reinigingsoplossing. Plaats spuiten in de pomp en sluit deze aan op schakelkleppen.
  4. Spoel schakelkleppen en verander de positie om te openen. Pomp 800 μL reinigingsoplossing bij een debiet van 100 μL/h, doorgaans 's nachts.
  5. Sluit de volgende dag de schakelkleppen en verwijder en spoel spuiten vervolgens met water. Spoel de stroomcel en leidingen met 4-800 μL water bij een debiet van 400-800 μL/h. Als een inspannender reiniging van de stromingscellen nodig is, vervangt u de reinigingsoplossing door 6 M guanidiumhydrochloride.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De eerste tests van de uitlijning en sterkte van de val worden uitgevoerd met 1 μm, niet-fluorescerende polystyreenparels. Omdat het grootste deel van het onderzoek dat in het laboratorium wordt gedaan fluorescentie gebruikt, testen we de valsterkte verder met behulp van 1 μm, Dragon groene polystyreen kralen (figuur 1D, E). Daarna verandert het werk in optische vangst van DNA-kraalcomplexen waarbij het DNA wordt gekleurd met de bis-intercalerende kleurstof YOYO-1

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De zorgvuldige assemblage van het stroomsysteem is van cruciaal belang voor het succesvolle resultaat van experimenten 4,6. Een van de meest uitdagende aspecten van het protocol is de bevestiging van connectoren aan het glasoppervlak. Hiervoor gebruiken we de volgende twee benaderingen: press-fit tubing connectoren en nanoport assemblies. Press-fit connectoren hechten zich gemakkelijk aan glas, gevolgd door het duwen van PTFE-buizen in de voorgevormde gaten met b...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteur verklaart geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onderzoek in het Bianco-laboratorium wordt ondersteund door NIH-subsidies GM100156 en GM144414 aan P.R.B.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100x objectiefLeica506318 of 506038Olie-immersielenzen; Alleen voor beeldvorming en optische vangsten; Plan APO-objectieven geoptimaliseerd voor fluorescentiebeeldvorming
10X ObjectiefLeica506263Wordt gebruikt om laserstroomplekken te lokaliseren tijdens uitlijning; om focus en X-Y-positie in flowcell te vinden
1 mm fluorescente kralenBangs LabsFSDG004Wordt gebruikt voor tap-prestaties, bepaling van de focale positie
1 mm polystyreenkralenBangs LabsCPO1004Wordt gebruikt voor evaluatie van trapprestaties en binding aan gebiotinyleerde moleculen
63x objectiefLeica506081Wordt gebruikt om laserstroomplekken te lokaliseren tijdens uitlijning en om focus en X-y-positie in flowcell te vinden; kan worden gebruikt voor optische vangsten omdat het een identieke achterapertuurdiameter heeft als de 100X; olië-immersielens
UitlijnlaserLumentum1100-serie10mW HeNe-laser die zichtbaar is voor het blote oog en die wordt gebruikt om de optica te positioneren
Beam uitlijningscameraAmscopeMU303Een eenvoudige, goedkope en door software bestuurde camera voor het beeldvormen van de straalpositie
Camera besturing en Image capture softwareHamamatsuHCImageCoördineert de activiteiten van de Lambda DG4 met de camera om snelle golflengtewisseling mogelijk te maken
Camera; Orca flash 4Hamamatsuc13440-20cuCCD-camera voor het beeldvormen van single-molecule experimenten
C-mount voor de beam uitlijningscameraSpot imaging solutionsDE50CMTBiedt optimale positionering van de camera voor het beeldvormen van laserstralen tijdens uitlijning
C-mount voor de Orca Flash 4 cameraHeeft een vasthoudring om een IR-blokkerende filter op zijn plaats te houden. Dit elimineert gereflecteerde IR-stralen van de optische traps en vergemakkelijkt duidelijker beeldvorming van opgevangen objecten.
Cy5  fluorescentiefilterkubusSemrockcy5-404a-lsc-zeroWordt gebruikt in combinatie met Lambda DG4 om Cy5 alleen af te beelden
Fitc-Txred  fluorescentiefilterkubusSemrockfitc/txred-2x-b-000Wordt gebruikt in combinatie met Lambda DG4 om FITC en TXRed af te beelden
FluidicsbuisGrace Bio46004PTFE-buis als alternatief voor PEEK; werkt goed op sommige flow cells. Kan worden gebruikt met PDMS flow cells of glazen flow cells wanneer Grace Bio fitbuiskoppelingen worden gebruikt
GFP fluorescentiefilterkubusSemrockgfp-3035b-lsc-zeroWordt gebruikt in combinatie met Lambda DG4 om GFP alleen af te beelden
Glazen flow cellsTranslumeOp maatDuidelijke flowkanalen voor beeldvorming (Fig. 2E)
GlijmiddelLoctite233841Verbindt Nanoport-assemblages veilig en eenvoudig aan glazen flow cells
Glas/PDMS sandwich flow cellsCIDRA Precision servicesOp maat ontworpenFlow cells gebouwd volgens uw specificaties; beeldvormingskanalen zijn duidelijk (Fig. 2C)
Hamilton ReinigingsoplossingHamilton18311Zachte maar efficiënte reinigingsoplossing voor glazen flow cells; vormt geen bubbels bij zorgvuldig gebruik
VerlichtingssysteemSutter InstrumentLamda DG4Niet meer verkrijgbaar, dus Lambda 721 wordt aanbevolen
VerlichtingssysteemSutter InstrumentLamda DG4Niet meer verkrijgbaar, dus Lambda 721 wordt aanbevolen
BeeldanalysesoftwareMedia cyberneticsImage Pro PremiereAnalyse van afbeeldingen en single molecule tracking
BeeldanalysesoftwareFiji/NIH Image/Image JSharewareAnalyse van afbeeldingen en single molecule tracking
BeeldweergavekaartMelles Griot06 DLA 001Alternatief product van Thorlabs: VRC5
ImmersieolieZeiss444960Immersol 518 F fluorescentievrij
LaserstraaluitlijningstoolsThor labsFMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1 Wordt gebruikt om ervoor te zorgen dat de stralen horizontaal en op de juiste hoogte staan
LaserstraalviewerCanadian Photonics labsIR 3150Wordt gebruikt om IR-straalplekken op spiegels en  doelen te beeldvormen
LaservermogenmeterThor labsMeting van laseruitvoer en ook van trapkracht
Laserveiligheidsbril (HeNe)Thor labsLG7 of 8Blokkeert >3 OD-eenheden licht met golflengten >600 nm
Laserveiligheidsbril (IR)Thor labsLG11Blokkeert >7 OD-eenheden licht met golflengten ³1000 nm
Mcherry  fluorescentiefilterkubusSemrockmcherry-a-lsc-zeroWordt gebruikt in combinatie met Lambda DG4 om mcherry alleen af te beelden
MicroscoopLeicaDMIRE2DIC-poort verwijderd om plaats te maken voor dichroitische vang-/uitlijnspiegel
Microscoopbesturingssoftware UCSF/sharewareuManagerBestuurt de microscoop, maakt focale uitlijning van objectieven mogelijk en ook stagesturing
Nanoport-assemblageIDEXN333Aansluitingen die zijn gebonden aan flow cells
Optische tafelondersteuningThor LabsPA52502Actieve isolatietafelondersteuning
Optica en lenzenSolar TIIVerschillendeInterferentiespiegels, telescopen en lenzen op maat ontworpen voor het systeem
PDMS flow cellsufluidixOp maatFlow cells gebouwd volgens uw specificaties; beeldvormingskanalen zijn duidelijk (Figs. 2B en D)
PEEK-buisIDEX1532Biedt uitstekende verbinding met flow cells en schakelventielen
Pinkel fluorescentiefilterkubusS

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bianco, P. R., Lu, Y. Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).
  2. Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. 491(2019).
  3. Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation. Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).
  4. Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
  5. Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. Watching individual proteins acting on single molecules of DNA. Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).
  6. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
  7. Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope. Cytometry. 14, 105-114 (1993).
  8. Vermeulen, K. C., Mameren, J. v Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors. Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704(2006).
  9. Dufresne, E. R. Computer-generated holographic optical tweezers arrays. Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810(2001).
  10. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).
  11. Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Applications of microfluidics in chemical biology. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (6), 584-591 (2006).
  12. Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).
  13. Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles. Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).
  14. Bianco, P. R., et al. Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules. Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).
  15. Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy. Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).
  16. Streets, A. M., Huang, Y. Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution. Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).
  17. Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies. Scientific Reports. 10 (1), 18069(2020).
  18. Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).
  19. Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).
  20. Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
  21. Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).
  22. Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA. Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).
  23. Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament. Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).
  24. Merenda, F., et al. Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics. Proceeding of SPIE. Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G. , 6483(2007).
  25. Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule. Science. 286 (5437), 120-123 (1999).
  26. Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions. Science Progress. 84, 267-290 (2001).
  27. Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
  28. Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange. Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).
  29. Rye, H. S., et al. Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Microflu dische apparatenvisuele biochemiefluorescentiemicroscopielaminaire stromingpreparatie van stroomcellenspuitenpompDNA strekkingoptische trapping

Gerelateerde artikelen