Het maagdarmkanaal is een van de meest gevoelige organen voor letsel bij radiotherapeutische kankerbehandelingen. Het is tegelijkertijd een orgaansysteem met een van de hoogste regeneratieve capaciteiten na dergelijke beledigingen. Het gepresenteerde protocol beschrijft een efficiënte methode om het regeneratieve vermogen van het darmepitheel te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Intestinale epitheelregeneratie als reactie op ioniserende bestraling
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het darmepitheel bestaat uit een enkele laag cellen, maar bevat meerdere soorten terminaal gedifferentieerde cellen, die worden gegenereerd door de actieve proliferatie van darmstamcellen op de bodem van darmcrypten. Tijdens gebeurtenissen van acuut darmletsel ondergaan deze actieve darmstamcellen echter celdood. Gammabestraling is een veel gebruikte colorectale kankerbehandeling, die, hoewel therapeutisch effectief, de bijwerking heeft van het uitputten van de actieve stamcelpool. Inderdaad, patiënten ervaren vaak gastro-intestinaal stralingssyndroom tijdens het ondergaan van radiotherapie, deels als gevolg van actieve stamceluitputting. Het verlies van actieve intestinale stamcellen in darmcrypten activeert een pool van typisch rustige reserve darmstamcellen en induceert dedifferentiatie van secretoire en enterocytvoorlopercellen. Zonder deze cellen zou het darmepitheel niet in staat zijn om te herstellen van radiotherapie en andere dergelijke belangrijke weefselbeledigingen. Nieuwe ontwikkelingen in lineage-tracing-technologieën maken het mogelijk om de activering, differentiatie en migratie van cellen tijdens regeneratie te volgen en zijn met succes gebruikt om dit in de darm te bestuderen. Deze studie heeft tot doel een methode weer te geven voor de analyse van cellen in het darmepitheel van de muis na stralingsletsel.
Inleiding
Het menselijke darmepitheel zou ongeveer het oppervlak van een half badmintonveld bedekken als hetvolledig vlak 1 zou worden geplaatst. In plaats daarvan wordt deze enkele cellaag die mensen scheidt van de inhoud van hun darmen samengeperst in een reeks vingerachtige projecties, villi en inkepingen, crypten die het oppervlak van de darmen maximaliseren. De cellen van het epitheel differentiëren langs een crypte-villusas. De villus bestaat voornamelijk uit voedingsabsorberende enterocyten, slijmafscheidende bokaalcellen en de hormoonproducerende entero-endocriene cellen, terwijl de crypten voornamelijk bestaan uit defensine-producerende Paneth-c....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle muizen werden ondergebracht in de Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) aan de Stony Brook University. De Stony Brook University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) keurde alle studies en procedures met dieren goed. Experimenten met proefdieren werden strikt uitgevoerd in overeenstemming met het goedgekeurde protocol voor het hanteren van dieren (IACUC #245094).
OPMERKING: Muisstammen B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) en B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26eYFP) werden commercieel verkregen (zie materiaaltabel) en gekruist om
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het gebruik van 12 Gy total-body bestraling (TBI) in combinatie met murine genetische afstamming tracing maakt een grondige analyse van de gevolgen van stralingsletsel in de darm mogelijk. Om te beginnen, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-muizen kregen een enkele tamoxifeninjectie, die een verbeterde gele fluorescerende eiwit (EYFP) expressie induceert binnen een Bmi1 + reservestamcelpopulatie. Twee dagen na de tamoxifeninjectie ondergingen de muizen bestraling of schijnbestraling. Drie uur.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft een robuust en reproduceerbaar stralingsschademodel. Het maakt de nauwkeurige analyse mogelijk van de veranderingen in het darmepitheel in de loop van 7 dagen na het letsel. Belangrijk is dat de geselecteerde tijdstippen cruciale stadia van letsel weerspiegelen en worden gekenmerkt door duidelijke veranderingen in de darm (letsel, apoptose, regeneratie en normalisatiefasen)60. Dit bestralingsmodel is vastgesteld en zorgvuldig beoordeeld, wat een geschikte manifestatie van l.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
De auteurs willen de Stony Brook Cancer Center Histology Research Core erkennen voor deskundige hulp bij de voorbereiding van weefselmonsters en de afdeling Laboratory Animal Resources aan de Stony Brook University voor hulp bij de verzorging en behandeling van dieren. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health DK124342 toegekend aan Agnieszka B. Bialkowska en DK052230 aan Dr. Vincent W. Yang.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 mL spuit | BD | 309659 | - |
| 16G Herbruikbare voedingsnaalden voor kleine dieren: recht | VWR | 20068-630 | - |
| 27G x 1/2" naald | BD | 305109 | - |
| 28G x 1/2" Monoject 1mL insulinespuit | Covidien | 1188128012 | - |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) | Santa Cruz Biotechnology | sc284628A | 10 mg/mL in steriele DMSO:water (1:4 v/v), aliquoteer en bewaar in -20°C |
| Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | - |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | The Jackson Laboratory | Strain #:006148 | |
| B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J | The Jackson Laboratory | Strain #:010531 | |
| Bovine Serum Albumine Fractie V, heat shock | Millipore-Sigma | 3116956001 | |
| Kip anti-GFP | Aves | GFP-1020 | |
| Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 beeldvormingskit, Invitrogen | Thermo Fisher Scientific | C10638 | - |
| Kikkerolie | Millipore-Sigma | C8267 | - |
| Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | - |
| Dimethyl sulfaat (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-100 | lichtgevoelig |
| DNase-vrije proteinase K | Invitrogen | C10618H | 25x verdund in DPBS |
| Ezel anti-kip AF647 | Jackson ImmunoResearch | 703-605-155 | |
| DPBS | Fisher Scientific | 21-031-CV | - |
| Eosine | Fisher Scientific | S176 | |
| Fluorescentiemicroscoop Nikon Eclipse 90i Helder en fluorescent licht, met objectieven: 10X, 20X | Nikon | ||
| Fluoromount Aqueous Montage Medium | Millipore-Sigma | F4680-25ML | |
| Gamma Cell 40 Exactor | Best Theratronics Ltd. | - | 0,759 Gy min-1 |
| Geit anti-konijn AF488 | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| Hematoxyline Oplossing, Gill No. 3 | Millipore-Sigma | GHS332 | |
| HM 325 Rotary Microtome van Thermo Scientific | Fisher Scientific | 23-900-668 | |
| Hoechst 33258, Pentahydraat (bis-Benzimide) | Thermo Fisher Scientific | H3569 | verdunning 1:1000 |
| Waterstofperoxide Oplossing, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical | Fisher Scientific | 18-603-252 | - |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche) | Millipore-Sigma | 11684795910 | |
| Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Lithium Carbonaat (Poeder/Gecertificeerd ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | L119-500 | 0,5g/1L dH2O |
| Luer-Lok Spuit steriele, eenmalig gebruik, 10 mL | VWR | 89215-218 | - |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF | Fisher Scientific | NC1675398 | - |
| Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Azijnzuur ACS Grade | Capitol Scientific | AAP-281000ACSCSLT | - |
| Konijn anti-Ki67 | BioCare Medical | CRM325 | |
| Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Montage Medium | Fisher Scientific | 22-050-262 | |
| Scientific Industries Incubator-Genie voor het bakken van slides op 65 graden | Fisher Scientific | 50-728-103 | |
| Natriumcitraat Dihydraat | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Roestvrijstalen Dissectieset | VWR | 25640-002 | |
| Superfrost Plus micro slides [maat: 25 x 75 x 1 mm] | VWR | 48311-703 | |
| Tamoxifen | Millipore-Sigma | T5648 | 30 mg/mL in steriele kikkerolie, bij voorkeur vers of kortdurende opslag in -20°C, lichtgevoelig |
| Tissue-Tek 24-Slide Houders met Afneembare Handgreep | Sakura | 4465 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades | Sakura | 4689 | |
| Tissue-Tek Handmatige Slide Kleuring Set | Sakura | 4451 | |
| Tissue-Tek Kleuring Schaal, Groen met Deksel | Sakura | 4456 | |
| Tissue-Tek Kleuring Schaal, Wit met Deksel | Sakura | 4457 | |
| Tween 20 | Millipore-Sigma | P7949 | |
| Unisette Verwerking Cassettes | VWR | 87002-292 | - |
| VWR Micro Dekglazen | VWR | 48393-081 | |
| Xyleen | Fisher Scientific | X5P-1GAL |
Referenties
- Helander, H. F., Fandriks, L. Surface area of the digestive tract - Revisited. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 49 (6), 681-689 (2014).
- vander Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithel....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
