Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Constructie van adenovirale vectoren met behulp van DNA-assemblagetechnologie

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64033

⸱

16 juni 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NHC Key Laboratory of Medical Virology and Viral Diseases, State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 2Laboratory of Infection and Virology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University, Key Laboratory of Major Diseases in Children, Ministry of Education, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, National Center for Children’s Health, 3Henan Chemical Technician College, 4Research Unit of Critical Infection in Childre, Chinese Academy of Medical Sciences, 5Chinese Academy of Sciences Joint Research Center for Emerging Infectious Diseases and Biosafety, Chinese Center for Disease Control and Prevention-Wuhan Institute of Virology

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

In deze studie werd een infectieuze kloon van humaan adenovirus type 7 (HAdV-7) geconstrueerd en werd een E3-gedeleteerd HAdV-7-vectorsysteem tot stand gebracht door de infectieuze kloon te wijzigen. Deze strategie die hier wordt gebruikt, kan worden gegeneraliseerd om genoverdrachtsvectoren te maken van andere wildtype adenovirussen.

Samenvatting

Adenovirale vectoren worden al meer dan drie decennia gebruikt als hulpmiddel voor genoverdracht in gentherapie. Hier introduceren we een protocol om een adenovirale vector te construeren door het genomische DNA van wildtype HAdV-7 te manipuleren met behulp van een DNA-assemblagemethode. Eerst werd een infectieuze kloon van HAdV-7, pKan-Ad7, gegenereerd door het virale genomische DNA te fuseren met een PCR-product uit de plasmide-ruggengraat, bestaande uit het kanamycine-resistente gen en de oorsprong van replicatie (Kan-Ori), door middel van DNA-assemblage. Dit werd gedaan door een paar PCR-primers te ontwerpen, die ~25 nucleotiden bevatten van de terminale sequentie van HAdV-7 omgekeerde terminale herhaling (ITR) aan het 5'-uiteinde, een niet-cutter-restrictie-enzymplaats voor HAdV-7-genoom in het midden, en een sjabloonspecifieke sequentie voor PCR-priming aan het 3'-uiteinde. Ten tweede werd een intermediaire op plasmide gebaseerde strategie gebruikt om de E3-regio te vervangen door transgen-expressieve elementen in de infectieuze kloon om een adenovirale vector te genereren. In het kort werd pKan-Ad7 verteerd met het restrictie-enzym Hpa I met dubbele snijder, en het fragment dat het E3-gebied bevatte, werd door Gibson-assemblage geligeerd aan een ander PCR-product van de plasmide-ruggengraat om een intermediair plasmide pKan-Ad7HpaI te construeren. Voor het gemak werd beperkingsassemblage gebruikt om de plasmide-kloneringsmethode van gecombineerde restrictievertering en assemblage aan te duiden. Met behulp van restrictie-assemblage werden de E3-genen in pKan-Ad7HpaI vervangen door een expressiecassette van een groen fluorescerend eiwit (GFP), en het gemodificeerde E3-gebied werd vrijgegeven uit het intermediaire plasmide en hersteld naar de infectieuze kloon om een adenoviraal plasmide pKAd7-E3GFP te genereren. Ten slotte werd pKAd7-E3GFP gelineariseerd door Pme I-digestie en gebruikt om HEK293-verpakkingscellen te transfecteren om het recombinante HAdV-7-virus te redden. Concluderend werd hier een op DNA-assemblage gebaseerde strategie geïntroduceerd voor het construeren van adenovirale vectoren in algemene laboratoria van de moleculaire biologie zonder de noodzaak van gespecialiseerde materialen en instrumenten.

Inleiding

In de afgelopen drie decennia zijn recombinante adenovirale vectoren op grote schaal gebruikt in de ontwikkeling van vaccins en gentherapie 1,2,3,4 en in fundamenteel onderzoek vanwege hun uitstekende biologische eigenschappen, zoals een hoge gentransductie-efficiëntie, niet-integratie in het gastheergenoom, het manipulatieve virale genoom en het gemak van grootschalige productie.

Momenteel zijn de meest gebruikte adenovirale vectoren geconstrueerd op basis van humaan adenovirus 5 (HAdV-5)5,6. Hoewel HAdV-5 vectorgemedieerde transductie bemoedigende resultaten oplevert, hebben preklinische en klinische toepassingen verschillende nadelen aan het licht gebracht (bijv. hoge reeds bestaande antivectorimmuniteit binnen de menselijke populatie en lage transductie-efficiëntie in cellen zonder het coxsackievirus en adenovirusreceptor (CAR)). Om deze problemen te omzeilen, is er grote belangstelling geweest om vectoren te construeren op basis van andere adenovirustypen van mensen of zoogdieren 3,7,8.

Tot nu toe is homologe recombinatie in bacteriën5 de meest populaire methode om een adenovirale vector te construeren. Dergelijke bacteriestammen moeten recombinasen tot expressie brengen, die de stabiliteit of amplificatie van de plasmiden die ze dragen kunnen beïnvloeden. Sommige soorten zijn zelfs niet in de handel verkrijgbaar. Onlangs zijn methoden op basis van andere principes, waaronder bacteriële kunstmatige chromosomen, direct klonen of directe DNA-assemblage, gebruikt om infectieuze klonen van adenovirus of recombinante adenovirale vectoren te genereren 9,10,11,12. Deze methoden zijn echter enigszins onvriendelijk voor onderzoekers met weinig ervaring op dit gebied.

In 2018 wordt het proces van het construeren van een adenovirus-infectieuze kloon in het laboratorium vereenvoudigd door het virusgenoom rechtstreeks af te ligen met een PCR-product dat de plasmide-ruggengraat door Gibson-assemblage13 voert. Daarna worden de methoden van restrictievertering en Gibson-assemblage gecombineerd om transgenen naar bestaande adenovirale plasmiden te laden 14,15,16,17,18. Gemakshalve wordt hierna restrictie-assemblage gebruikt om te verwijzen naar de methode van gecombineerde restrictie-enzymvertering en Gibson-assemblage. Strategieën werden verder ontwikkeld om adenovirale vectoren te construeren uit infectieuze klonen met behulp van restrictie-assemblage19. De essentie van restrictie-assemblage is om fragmenten die uit plasmiden zijn uitgesneden zoveel mogelijk op te nemen in een DNA-assemblagereactie, terwijl korte PCR-producten dienen als linkers of pleisters voor plasmidemodificatie. Tegelijkertijd wordt het aantal opgenomen fragmenten zo laag mogelijk gehouden. Dergelijke inspanningen weerspiegelen de uitbetaling; de mogelijkheid van ongewenste mutaties veroorzaakt door PCR- of DNA-assemblage kan worden geminimaliseerd en het slagingspercentage kan worden verbeterd. Concluderend is in het laboratorium 13,14,15,16,17,18,19 een pijplijn opgezet van een wildtype adenovirus naar een adenovirale vector.

Hier proberen we deze methoden te introduceren door voorbeelden te geven van het construeren van een HAdV-7 infectieuze kloon en een E3-gedeleteerde replicatie-competente HAdV-7 vector.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Adenovirussen zijn geclassificeerd als bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2); Alle stappen om de virussen te gebruiken werden uitgevoerd in een laboratorium van bioveiligheidsniveau 2. Het wildtype HAdV-7 werd in 2017 geïsoleerd uit het nasofaryngeale aspiraatmonster van een 10 maanden oude baby die in het ziekenhuis was opgenomen met een acute luchtweginfectie in het Beijing Children's Hospital20. De virusvoorraden werden bewaard bij -80 °C.

1. Extractie van HAdV-7 genomisch DNA

  1. Zaai 2,0 x 106 van de HEK293-cellen in één T-25-kolf met 5 ml gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) plus 10% foetaal runderserum (FBS) van Dulbecco en kweek bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer aangevuld met 5% CO2. Cellen moeten voor 80%-90% samenvloeiend zijn en klaar voor infectie in 18-24 uur.
  2. Inoculeer de cellen met wildtype HAdV-7 gedurende 2 uur. Verwijder het virushoudende medium door aspiratie en voeg 5 ml verse DMEM met 2% FBS toe aan de cellen.
  3. Extraheer het virale genomische DNA met de gemodificeerde Hirt's methode21
    1. In 2 of 3 dagen na infectie, wanneer een cytopathisch effect (CPE) wordt waargenomen op 50%-90% van de cellen, gooi het kweeksupernatans weg en spoel de cellen eenmaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
      OPMERKING: Cytopathisch effect (CPE) wordt gedefinieerd als een fenomeen waarbij de met virus geïnfecteerde cellen zich verzamelen, opzwellen en losjes hechten of loskomen van de kweekkolf in druifachtige trossen22.
    2. Lyseer de cellen in de kolf in 1,0 ml lysisbuffer met 25 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, 50 μg/ml protease K en 0,8% SDS (pH7,6) gedurende 5 minuten op ijs. Breng het lysaat over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en incubeer de buis gedurende 30 minuten in een waterbad bij 50 °C.
    3. Voeg 120 μL neerslagbuffer toe aan de buis. Plaats de tube nog 30 minuten op ijs nadat je voorzichtig hebt gemengd.
      OPMERKING: De neerslagbuffer is samengesteld uit 3 M CsCl, 1 M kaliumacetaat en 0,67 M azijnzuur. Het helpt bij het neerslaan van het cellulaire puin en het cellulaire chromosoom-DNA na centrifugatie, terwijl het virusgenoom in het supernatant blijft.
    4. Centrifugeer de buis gedurende 25 minuten bij 15.000 x g bij 4 °C en breng vervolgens het bovenstaande (ongeveer 1,1 ml) over in een polypropyleen buis van 15 ml.
    5. Voeg 2,2 ml ijskoude absolute ethanol toe aan de buis. Meng voorzichtig en laat de tube 15 minuten op ijs staan. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 2000 x g bij kamertemperatuur.
    6. Zuig het bovenstaande zorgvuldig op en was het neerslag (virusgenomisch DNA) eenmaal met 800 μL 70% ethanol. Centrifugeer de buis gedurende 6 minuten bij 15.000 x g bij kamertemperatuur. Gooi het bovenstaande weg en laat de DNA-pellet aan de onderkant aan de lucht drogen. Droog de DNA-pellet niet te droog, omdat dit problemen kan veroorzaken bij het oplossen.
    7. Los de pellet op in 200 μL TE-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM EDTA), voeg 1 μL RNase A (10 mg/ml) toe en incubeer de buis gedurende 15 minuten bij 37 °C. Zuiver het opgeloste DNA met behulp van een in de handel verkrijgbare genomische DNA-reinigings- en concentratorkit (zie materiaaltabel).
      OPMERKING: Kwantificeer het virale genomische DNA met de veelgebruikte methode in het laboratorium. Over het algemeen kan 1-5 μg genomisch DNA worden verkregen in een T-25-kolf van HEK293-cellen die zijn geïnfecteerd met adenovirus.

2. Constructie van een infectieuze kloon van HAdV-7 door DNA-assemblage

  1. Ontwerp PCR-primers om de plasmide-ruggengraat te versterken (Figuur 1). Voeg de overlappende sequenties die nodig zijn voor DNA-assemblage toe aan de 5'-uiteinden van PCR-primers. Neem daarnaast niet-cutter-restrictieplaatsen op (bijv. Pme I-site) aan beide uiteinden van het HAdV-7-genoom om het virale genoom van de infectieuze kloon te helpen vrijmaken.
    OPMERKING: De plasmideruggengraat die het antibioticaresistente gen en de replicatieoorsprong bevat, wordt geamplificeerd door PCR en gefuseerd met het HAdV-7-genoom. Adenovirussen kunnen met een hogere efficiëntie uit verpakkingscellen worden gered wanneer een gelineariseerd virusgenoom wordt gebruikt in plaats van een circulair adenoviraal plasmide. Na rekening te hebben gehouden met de bovengenoemde factoren, worden primers ontworpen zoals weergegeven in figuur 1.
  2. Voer PCR uit om een fragment (Kan-Ori) dat kanamycine-resistentiegen (Kan) en pBR322-oorsprong (Ori) bevat, te amplificeren met behulp van pShuttle-CMV als sjabloon met primers van Ad7KanF1 en Ad7KanR1 (Tabel S1). Stel de PCR-reactie als volgt in: één cyclus bij 98 °C gedurende 30 s, vervolgens vijf cycli denatureren bij 98 °C gedurende 8 s, gloeien bij 68 °C gedurende 30 s, verlenging bij 72 °C gedurende 90 s, en ten slotte 25 cycli denatureren bij 98 °C gedurende 8 s, gloeien en verlengen bij 72 °C gedurende 2 min.
  3. Laat het PCR-product in een 1% agarosegel lopen door middel van elektroforese en zuiver het fragment met behulp van een in de handel verkrijgbare DNA-gelherstelkit.
  4. Voeg het herstelde Kan-Ori en virale genomische DNA van HAdV-7 toe aan de commerciële DNA Assembly Master Mix. Zet de assemblagereactie op in een totaal volume van 20 μL en een molaire verhouding van vector tot viraal genomisch DNA van 1:2. Incubeer gedurende 1 uur bij 50 °C.
    OPMERKING: Stel de reactie in op een totaal volume van 20 μL met 1-3 μL vector, 7-9 μL viraal genomisch DNA en 10 μL DNA Assembly Master Mix.
  5. Transformeer de chemisch competente E. coli stam TOP10-cellen met 10 μL van het assemblageproduct met behulp van een hitteschok. Verdeel het transformatiemengsel over kanamycinehoudende (50 μg/ml) Luria-Bertani (LB-Kan) platen. Incubeer de platen gedurende ten minste 12 uur bij 37 °C.
  6. Inoculeer ten minste drie klonen in 5 ml LB-Kan medium bij 37 °C gedurende 12 uur onder voorzichtig schudden (200-250 tpm). Extraheer plasmide-DNA met behulp van een commerciële Plasmid Miniprep Kit.
  7. Verteer het plasmide met behulp van restrictie-endonuclease en controleer vervolgens de grootte van DNA-fragmenten met agarosegelelektroforese (Figuur 2A). Bevestig bovendien de fusieplaatsen door middel van sequentiebepaling. Het juiste assemblageplasmide wordt pKan-Ad7 genoemd.
  8. Kweek een bacteriecultuur van 100 ml uit de juiste kloon. Extraheer een maxi-plasmidepreparaat met behulp van een in de handel verkrijgbare Plasmid Maxprep Kit.

3. In silico constructie en modificatie van een tussenliggend plasmide

OPMERKING: Over het algemeen moet een tussenliggend plasmide worden geconstrueerd, en het construeren van een ideaal tussenliggend plasmide is de belangrijkste stap. DNA-analysesoftware met een restrictie-enzymmodule, zoals pDRAW32 (een gratis software, beschikbaar op www.acaclone.com), is nodig voor het ontwerp van een intermediair plasmide.

  1. Importeer de DNA-sequentie van pKan-Ad7 naar pDRAW32 om een plasmidekaart te tekenen. Annoteer de interessegebieden op de kaart. Voor pKan-Ad7 werden de E1-, E3-regio's en de plasmide-backbone (Kan-Ori) geannoteerd.
  2. Voer het pDRAW32-programma uit. Klik eerst op Instellingen > Enzymselectie en klik vervolgens op Min/Max-cuts. Voer 1 in het vak Min en voer 2 in het vak Max in en vink het vakje voor in de hele reeks aan. Klik ten slotte op OK om de unieke en dubbele snijbeperkingsenzymplaatsen op de kaart weer te geven.
    OPMERKING: Over het algemeen worden alleen de restrictie-enzymen geselecteerd die een sequentie van 6 bp of langer herkennen. Zoals te zien is in figuur 3A, voldoen 17 enzymen aan de enzymselectiecriteria.
  3. Beschouw de eerste beperkingslocatie die de E3-regio flankeert, aangezien de E3 gepland is om te worden gewijzigd. Hpa I, Sal I, Avr II-Mlu I en Spe I voldeden aan de eis.
    OPMERKING: Voor dit experiment is Hpa I geselecteerd omdat vertering van pKan-Ad7 ermee het kortste fragment zou genereren dat het E3-gebied draagt, en een kleiner tussenliggend plasmide zou toekomstige modificatie gemakkelijker maken. De selectie van Sal I-sites heeft ook voordelen: zo'n intermediair plasmide is geschikt voor de modificatie van zowel E1- als E3-regio's (Figuur S1).
  4. Maak een definitief sequentiebestand met beide DNA-strengen van het intermediaire plasmide pKan-Ad7HpaI. Deze virtuele sequentie kan worden gebruikt als sjabloon om overlappende primers te ontwerpen.
    1. Kopieer de sequentie tussen de twee Hpa I-beperkingssites, inclusief de E3-regio. Voor de daaropvolgende assemblage is het noodzakelijk om elke ~20 bp-sequentie (Tm gelijk aan of groter dan 48°C) buiten de Hpa I-restrictieplaats te kopiëren (Figuur 3C, overlap-Final 1 en overlap-Final2).
    2. Voeg de herkenningsvolgorde van Pme I (Figuur 3C, gtttaaac) toe aan beide uiteinden van de bovenstaande reeks.
    3. Voeg de sequentie van het ruggengraatplasmide met antibioticaresistent gen en replicatieoorsprong toe (Figuur 3C, Kan-Ori) buiten de Pme I-restrictieplaats.
    4. Importeer de uiteindelijke reeks naar pDRAW32 om een plasmidekaart te tekenen. Annoteer de E3-regio op de kaart.
    5. Voer het pDRAW32-programma uit. Klik eerst op Instellingen > Enzymselectie en klik vervolgens op Min/Max-verlagingen. Voer 1 in zowel het vakje Min als Max in en vink het vakje ervoor in de hele reeks aan. Klik ten slotte op OK om de unieke restrictie-enzymplaatsen op de kaart weer te geven. Het is te zien dat er veel unieke snijders beschikbaar zijn voor E3-modificatie.
      OPMERKING: Voor dit experiment zijn BstZ17 I en Mlu I geselecteerd voor de vervanging van gedeeltelijke E3. Een dubbele snijder kan ook handig zijn. Zo kan bijvoorbeeld de dubbele snijder Ssp I samen met de unieke snijder BssH II worden geselecteerd voor de vervanging van het hele E3-gebied door gebruik te maken van overlappende extensie-PCR.
  5. Ontwerp primers met behulp van de virtuele sequentie als sjabloon voor de constructie van intermediair plasmide (Figuur 3C).
    OPMERKING: Om de lengte van elke primer in te korten, zijn vier primers ontworpen. Het PCR-product, dat wordt geamplificeerd met primers van Ad7HpaIF1 en Ad7HpaIR1, zou worden gebruikt als sjabloon om het uiteindelijke PCR-fragment te verkrijgen met primers van Ad7HpaIF2 en Ad7HpaIR2 (Figuur 3C).

4. Redding van infectieus recombinant adenovirus in HEK293-cellen

OPMERKING: De drie adenovirussen die in dit artikel worden gegenereerd, worden allemaal gered volgens het volgende protocol.

  1. Vereer 10 μg recombinant adenoviraal plasmide met 2 μl Pme I gedurende 5 uur bij 37 °C in een totaal volume van 100 μl om het plasmide te lineariseren. Controleer 1 μL van het verteerde DNA op een 0,8% agarose gel. Spijsvertering zou een ~34 kb fragment van het adenovirale genoom en een ~2,5 kb plasmide-ruggengraat van Kan-Ori moeten opleveren.
  2. Zuiver het resterende gelineariseerde adenovirale plasmide met behulp van de genomische DNA Clean and Concentrator-kit.
  3. Kweek HEK293-cellen in DMEM plus 10% FBS. Zaad HEK293-cellen (2 x 106 cellen) in een T-25-kolf 1 dag vóór transfectie, zodat ze de volgende dag 70%-80% samenvloeiing bereiken. Gebruik 5 μg Pme I verteerd adenoviraal plasmide om HEK293-cellen te transfecteren met behulp van in de handel verkrijgbare transfectiereagentia.
    OPMERKING: Het medium van de getransfecteerde cellen moet om de 3 dagen worden vervangen.
  4. Controleer de cellen elke dag, verzamel de cellen en kweek het medium in een polypropyleen buis van 15 ml wanneer de komeethaarden zich vormen (Figuur 2B, die de virusreplicatie aangeeft).
  5. Lyseer de cellen via drie vries-dooicycli. Na centrifugeren gedurende 12 minuten bij 1200 x g bij kamertemperatuur het bovenstaande opvangen en bewaren bij -80 °C voor de verdere verspreiding van het virus.
    OPMERKING: Wanneer het recombinante adenovirus GFP of andere fluorescerende eiwitten tot expressie brengt, is het gemakkelijker om vast te stellen of het virus met succes is gered, omdat de brandpunten gevormd door fluorescerende eiwitpositieve cellen intuïtief onder een fluorescentiemicroscoop kunnen worden waargenomen.

5. Constructie van E3-gedeleteerd HAdV-7 genoomplasmide

OPMERKING: Het genoom van HAdV-7 is 35.239 bp lang en het E3-gebied bevindt zich tussen 27.354 bp en 31.057 bp van het genoom. Om een intermediair plasmide te construeren, zoekt u een endonuclease met twee snijplaatsen op het infectieuze kloonplasmide, of twee endonucleasen met een enkele snijplaats op het plasmide. Er zijn Hpa I, Sal I of Avr II en Mlu I beschikbaar. De volgorde tussen BstZ17 I (28.312 bp) en Mlu I (30.757 bp) moet worden geschrapt en vervangen door de CMV-GFP-PA-cassette of CMV-mCherry-PA-cassette.

  1. Verteer 600 ng pKan-Ad7 met Hpa I. Zuiver respectievelijk het grote fragment pKAd7-HpaI-FL (~30 kb) en het kleine fragment pKAd7-HpaI-FS (~7 kb) met behulp van een DNA-gelherstelkit na gelelektroforese. Bewaar de pKAd7-HpaI-FL bij -20 °C.
  2. Versterk het fragment dat Kan en Ori bevat met behulp van pShuttle-CMV als sjabloon met primers van Ad7HpaIF1 en Ad7HpaIR1 (Tabel S1) door PCR. Herstel en verdun het PCR-product (2541 bp) dat moet worden gebruikt als sjabloon voor de tweede PCR-reactieronde om Kan-Ori2 te amplificeren met primers van Ad7HpaIF2 en Ad7HpaIR2.
    1. Zuiver het PCR-product (2584 bp) na oplossing in een 1% agarosegel door elektroforese. Stel de PCR-reactie als volgt in: één cyclus bij 98 °C gedurende 30 s, vervolgens 30 cycli denaturering bij 98 °C gedurende 8 s, gloeien en verlengen bij 72 °C gedurende 2 min.
      OPMERKING: Het centrale deel van Kan-Ori2 is het fragment dat Kan en Ori bevat, gevolgd door de sequenties van een unieke restrictie-endonuclease die niet bestaat in het kleine fragment pKAd7-HpaI-FS (bijv. Pme I), en het overlappende gebied met het grote fragment pKAd7-HpaI-FL; de buitenste sequentie is het overlappende gebied met een klein fragment pKAd7-HpaI-FS.
  3. Voeg het PCR-product Kan-Ori2 en het herstelde pKAd7-HpaI-FS in stap 5.1 toe aan DNA Assembly Master Mix. Incubeer gedurende 1 uur bij 50 °C. Volg stap 2.4-2.6. Het juiste plasmide wordt pKan-Ad7HpaI (~10 kb) genoemd.
  4. Versterk het CMV-GFP-PA-fragment (~1,7 kb) dat CMV-promotor, GFP CDS en SV40 polyA-signaal (PA) bevat met behulp van pShuttle-GFP23 als sjabloon met primers van Ad7E3GFPF1 en Ad7E3GFPR1 (Tabel S1). Zuiver het PCR-product (1650 bp) na oplossing in een 1% agarosegel door elektroforese.
    OPMERKING: Overlappende regio's die kunnen worden geassembleerd met BstZ17 I en Mlu I verteerd pKan-Ad7HpaI moeten in de primers worden opgenomen, en een unieke beperkingsplaats (bijv. Sbf I) die niet bestaat in het plasmide pKan-Ad7 wordt toegevoegd aan de primers voor verdere beperkingsassemblage.
  5. Verteer 300 ng pKan-Ad7HpaI met BstZ17 I en Mlu I. Zuiver het fragment van 7,3 kb (de meeste E3-regio's worden verwijderd) na oplossing in een 1% agarosegel door elektroforese. Voeg het herstelde 7,3 kb-fragment en het herstelde CMV-GFP-PA-fragment (~1,6 kb) toe aan DNA Assembly Master Mix. Volg stap 2.4-2.6. Het juiste plasmide wordt pKAd7-E3GFP (~9 kb) genoemd.
    OPMERKING: Alle sequenties tussen BstZ17 I en Mlu I behoren tot de E3-regio.
  6. Verteer 300 ng pKAd7-HE3GFP met Pme I. Zuiver het grote fragment (~6,4 kb) met behulp van een DNA-gelherstelkit na gelelektroforese. Voeg het gezuiverde fragment en pKAd7-HpaI-FL, teruggevonden in stap 5.1, toe aan DNA Assembly Master Mix. Incubeer gedurende 1 uur bij 50 °C. Volg stap 2.4-2.6. Het juiste plasmide wordt pKAd7-E3GFP genoemd.
  7. Transfect HEK293-cellen met Pme I-gelineariseerde pKAd7-E3GFP zoals beschreven in sectie 3. Het geredde adenovirus wordt Ad7-E3GFP genoemd.
  8. Versterk het CMV-mCherry-PA-fragment (~1,6 kb) dat CMV-promotor, mCherry CDS en SV40 polyA-signaal bevat met behulp van pKFAV4-CX19A als sjabloon met de primers van Ad7E3CHEF1 en Ad7E3CHER1. Zuiver het PCR-product na oplossing in een 1% agarosegel door elektroforese.
  9. Verteer 600 ng pKAd7-E3GFP met Sbf I en zuiver het fragment van ~35 kb. Voeg het 35 kb-fragment en het herstelde CMV-mCherry-PA-fragment toe aan DNA Assembly Master Mix. Incubeer gedurende 1 uur bij 50 °C. Volg stap 2.4-2.6. Het juiste plasmide wordt pKAd7-E3CHE genoemd.
  10. Transfect HEK293-cellen met Pme I-gelineariseerde pKAd7-E3CHE zoals beschreven in sectie 3. Het geredde adenovirus krijgt de naam Ad7-E3CHE.

6. Amplificatie en zuivering van het recombinant adenovirus in HEK293-cellen

  1. Inoculeer een 80%-90% confluente monolaag van HEK293-cellen gekweekt in acht met 150 mm diameter TC-behandelde kweekschaaltjes met adenovirus. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C onder lichte agitatie. Vervang het bovenstaande door 25 ml DMEM met 2% FBS.
  2. Incubeer de cellen gedurende 2-3 dagen bij 37 °C.
    1. Gooi het grootste deel van het bovenstaande van de acht schaaltjes met een diameter van 150 mm weg wanneer een CPE de meeste cellen aantast. Oogst geïnfecteerde cellen met behulp van cellifters met een eindelutievolume van ~6,0 ml in polypropyleen buisjes van 15 ml.
    2. Verstoor de cellen door drie vries-dooicycli om het virus vrij te geven. Klar het lysaat door centrifugeren gedurende 12 minuten bij 1200 x g bij kamertemperatuur. Verzamel de virusbevattende supernatant.
  3. Voeg MgCl2 (0,1 mM) en benzonasenuclease (50 E/ml) toe aan het supernatant. Draai zachtjes gedurende 40 minuten bij 37 °C. Voeg NaCl (600 mM) toe aan het bovenstaande en draai voorzichtig gedurende nog 40 minuten bij 37 °C. Centrifugeer gedurende 12 minuten bij 1200 x g bij kamertemperatuur. Verzamel het virusbevattende bovenstaande middel voor zuivering.
  4. Bereid cesiumchloride (CsCl) met verschillende concentraties van 1,35 g/ml, 1,30 g/ml en 1,25 g/ml met 10 mM Tris-HCl.
    1. Voeg 0,8 ml 1,35 g/ml CsCl-oplossing toe aan de bodem van een Ultra-Clear tube van 5,1 ml met behulp van een pipet en voeg vervolgens langzaam 0,8 ml 1,30 g/ml CsCl-oplossing en 0,8 ml 1,25 g/ml CsCl-oplossing achtereenvolgens toe aan de bovenkant van de eerste oplossing.
    2. Leg ten slotte voorzichtig ~2,5 ml van het in stap 6.3 verzamelde bovenstaande middel op de bovenkant van de 1,25 g/ml CsCl-oplossing en vul de buis tot 2-3 mm vanaf de bovenkant met 10 mM Tris-HCl.
  5. Centrifugeer gedurende 2 uur bij 200.000 x g en 8 °C in een rotor met draaiende emmer met langzame acceleratie en vertraging om de intacte virusdeeltjes van de defecte virusdeeltjes te scheiden.
    OPMERKING: Na centrifugatie zijn er duidelijk verschillende witte banden te zien in de CsCl-oplossing.
  6. Verwijder voorzichtig de banden van de lege deeltjes en de laag celresten met behulp van de pipet en verzamel de onderste band met rijp virus met behulp van een spuit van 2 ml.
  7. Breng de verzamelde virussuspensie over naar een dialysecassette van 20 K MWCO en dialyseer in dialysebuffer met 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2 en 2% glycerol (pH 8,0) 's nachts bij 4 °C.
    1. Vervang de dialysebuffer met 10 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2 en 5% glycerol (pH 8,0) de volgende dag en dialyseer 5 uur bij 4 °C.
    2. Verzamel de gedialyseerde virusdeeltjes met behulp van een spuit van 2 ml. Bereid meerdere hoeveelheden van de gewenste kleine hoeveelheden (20-200 μL) voor en bewaar het gezuiverde virus bij -80 °C.
      OPMERKING: De deeltjestiter van het gezuiverde virus kan worden bepaald door het gehalte aan genomisch DNA te meten, en de infectiviteitstiter kan worden bepaald op HEK293-cellen door GFP-positieve cellen te tellen met de beperkende verdunningstest.

7. Identificatie van het genoom van het recombinant adenovirus door restrictie-enzymvertering

  1. Infecteer een 80%-90% confluente monolaag van HEK293-cellen gekweekt in één T-25-kolf met recombinant adenovirus. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C. Vervang de voedingsbodem door verse DMEM met 2% FBS.
  2. Verwijder het kweeksupernatans en extraheer het virale genomische DNA met de gewijzigde Hirt-methode beschreven in stap 1.3 wanneer CPE binnen 2-3 dagen optreedt.
  3. Verteer het genomische DNA van het recombinante adenovirus met geïndiceerde enzymen en analyseer op agarosegelelektroforese. Het recombinante adenovirale plasmide diende als controle.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De strategie voor de constructie van een infectieuze kloon van HAdV-7 wordt weergegeven in Figuur 1 en Figuur 2. Twee infectieuze kloonplasmiden werden willekeurig geselecteerd en geïdentificeerd door respectievelijk BstZ17 I, BamH I en EcoR V. De resultaten toonden aan dat de fragmenten consistent waren met de verwachte grootte (Figuur 2A), wat aangeeft dat de plasmiden correct waren geconstrueerd....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Verschillende adenovirussen hebben verschillende weefseltropismen en de prevalentie van reeds bestaande immuniteit van de gastheer tegen verschillende adenovirussen kan bij mensen intensief fluctueren24, wat de interesse wekt in het construeren van nieuwe adenovirale vectoren voor gentherapie of de ontwikkeling van vaccins. Het opzetten van een nieuw adenoviraal vectorsysteem blijft echter omslachtig voor generieke laboratoria voor moleculaire biologie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door Beijing Natural Science Foundation (7204258), National Natural Science Foundation of China (82161138001, 82072266), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026), en het onderzoek en de toepassing op moleculaire tracering van essentiële respiratoire pathogenen in Beijing, door de Capital Health Development and Research of Special (2021-1G-3012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL polypropyleen microcentrifugebuisjesAxygenMCT-150-COpslag van virus
15 mL polypropyleen centrifugeerbuizenCorning430790Opslag van virus
150 mm TC-behandelde kweekschalenCorning430599Groei van HEK29E cellen
20 K MWCO dialysecassetteThermoFisher Scientific66005Dialyse van virus
AzijnzuurAmresco714Extractie van DNA
Afl IINEBR0520Digestie
AgaroseTakara5260Elekforese
Age INEBR0552Digestie
Asc INEBR0558Digestie
BamH INEBR0136Digestie
Benzonase NucleaseSigmaE8263-25KUZuivering van virus
BsrG INEBR0575Digestie
Cell lifterCorning3008Verwijder de cellen
CsClSigmaC3032Zuivering van virus
DNA gel herstel kitZymoD4045Herstel van DNA
Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM)CytivaSH30022.01HEK293 cellen medium
E.coli TOP10 competente cellenTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.CB-104Transformatie van samenstellingsproduct
EcoR VNEBR3195Digestie
EDTAThermo Fisher ScientificR3104Extractie van DNA
Fetaal bovien serum (FBS)CytivaSV30208.02HEK293 cellen kweek
Genoom DNA schoon en concentrator kitZymoD4065Zuivering van DNA
GlycerolShanghai Macklin Biochemical Co., LtdG810575Dialyse van virus
HEK293 cellenATCCCRL-1573Amplificatie van virus
High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0491PCR
Hind IIINEBR3104Digestie
Kanamycin sulfaatAmresco408Selectie van plasmide
Kpn INEBR3142Digestie
Lambda/HindIII DNA markerTakara3403Elekforese
LB bouillonBD240230LB plaat voor bacteriën
LB mediumSolarbio Life ScienceL1010Medium voor bacteriën
MgCl2Sigma63068Dialyse van virus
MicrocentrifugeThermo Fisher ScientificSorvall Legend Micro 21RExtractie van DNA
NaClSigmaS5886Dialyse van virus
Nde INEBR0111Digestie
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621DNA samenstelling
Nhe INEBR0131Digestie
Fosfaat gebufferd zoutwaterCytivaSH30256.01Wassen van cellen
PipetThermo Fisher ScientificMatrixZuigen van medium
Plasmid Maxprep KitVigorous Biotechnology Beijing Co., Ltd.N001Extractie van DNA
Plasmid Miniprep KitTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.DP103Extractie van DNA
Pme INEBR0560Digestie
KaliumacetaatAmresco698Extractie van DNA
Protease KThermo Fisher ScientificAM2542Extractie van DNA
pShuttle-CMVStratagene240007PCR template
RNaseBeyotimeD7089Extractie van DNA
Sal INEBR0138Digestie
Sbf INEBR3642Digestie
SDSAmresco227Extractie van DNA
Swinging-bucket rotorHITACHIS52STZuivering van virus
T-25 cellenflaconCorning430639Groei van HEK29E cellen
T-75 cellenflaconCorning430641Groei van HEK29E cellen
Transfectie reagensPolyplus-transfectie114-15Transfectie
Transmissie elektronenmicroscoopFEITECNAI 12Observatie van virus
Tris-HClAmresco234Dialyse van virus
UltracentrifugeHITACHIHimac CS120GXIIZuivering van virus
```

Referenties

  1. Lasaro, M. O., Ertl, H. C. New insights on adenovirus as vaccine vectors. Molecular Therapy. 17 (8), 1333-1339 (2009).
  2. Fuchs, J. D., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant adenovirus serotype 35-Vectored HIV-1 vaccine in adenovirus serotype 5 seronegative and seropositive individuals. Journal of AIDS & Clinical Research. 6 (5), (2015).
  3. Milligan, I. D., et al. Safety and immunogenicity of novel adenovirus type 26- and modified vaccinia ankara-vectored ebola vaccines: a randomized clinical trial. JAMA. 315 (15), 1610-1623 (2016).
  4. Zhu, F. C., et al. Safety, tolerability, and immunogenicity of a recombinant adenovirus type-5 vectored COVID-19 vaccine: a dose-escalation, open-label, non-randomised, first-in-human trial. Lancet. 395 (10240), 1845-1854 (2020).
  5. He, T. C., et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2509-2514 (1998).
  6. Danthinne, X., Imperiale, M. J. Production of first generation adenovirus vectors: a review. Gene Therapy. 7 (20), 1707-1714 (2000).
  7. Guo, X., et al. Systemic and mucosal immunity in mice elicited by a single immunization with human adenovirus type 5 or 41 vector-based vaccines carrying the spike protein of Middle East respiratory syndrome coronavirus. Immunology. 145 (4), 476-484 (2015).
  8. Folegatti, P. M., et al. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).
  9. Jang, Y., Bunz, F. AdenoBuilder: A platform for the modular assembly of recombinant adenoviruses. STAR Protocols. 3 (1), 101123(2022).
  10. Zhou, X., Sena-Esteves, M., Gao, G. Construction of recombinant adenovirus genomes by direct cloning. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (5), (2019).
  11. Ruzsics, Z., Lemnitzer, F., Thirion, C. Engineering adenovirus genome by bacterial artificial chromosome (BAC) technology. Methods in Molecular Biology. 1089, 143-158 (2014).
  12. Zhou, D., et al. An efficient method of directly cloning chimpanzee adenovirus as a vaccine vector. Nature Protocols. 5 (11), 1775-1785 (2010).
  13. Zou, X. H., et al. DNA assembly technique simplifies the construction of infectious clone of fowl adenovirus. Journal of Virological Methods. 257, 85-92 (2018).
  14. Guo, X., et al. Site-directed modification of adenoviral vector with combined DNA assembly and restriction-ligation cloning. Journal of Biotechnology. 307, 193-201 (2020).
  15. Liu, H., et al. Single plasmid-based, upgradable, and backward-compatible adenoviral vector systems. Human Gene Therapy. 30 (6), 777-791 (2019).
  16. Yan, B., et al. User-friendly reverse genetics system for modification of the right end of fowl adenovirus 4 genome. Viruses. 12 (3), 301(2020).
  17. Zhang, W., et al. Fiber modifications enable fowl adenovirus 4 vectors to transduce human cells. Journal of Gene Medicine. 23 (10), 3368(2021).
  18. Zou, X., et al. Fiber1, but not fiber2, is the essential fiber gene for fowl adenovirus 4 (FAdV-4). Journal of General Virology. 102 (3), 001559(2021).
  19. Guo, X., et al. Restriction-assembly: a solution to construct novel adenovirus vector. Viruses. 14 (3), 546(2022).
  20. Duan, Y., et al. Genetic analysis of human adenovirus type 7 strains circulating in different parts of China. Virologica Sinica. 36 (3), 382-392 (2021).
  21. Arad, U. Modified Hirt procedure for rapid purification of extrachromosomal DNA from mammalian cells. Biotechniques. 24 (5), 760-762 (1998).
  22. Knipe, D. M. H. P. M. Fields' Virology. 2, 1733(2013).
  23. Liu, H. Y., Han, B. J., Zhong, Y. X., Lu, Z. Z. A three-plasmid system for construction of armed oncolytic adenovirus. Journal of Virological Methods. 162 (1-2), 8-13 (2009).
  24. Mennechet, F. J. D., et al. A review of 65 years of human adenovirus seroprevalence. Expert Review of Vaccines. 18 (6), 597-613 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

GentransferHAdV 7 genoominfectieuze kloonPCR primersplasmide backboneGibson assemblagerestrictieverdijstingHEK293 cellen
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.