Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Generatie van iPSC-afgeleide retinale organoïden voor menselijke patiënten om retinitis pigmentosa te modelleren

2.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64045

⸱

16 juni 2022

 ,  , 
1Beijing Tongren Hospital, Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Ophthalmology & Visual Science Key Laboratory, Beijing Tongren Eye Center, Capital Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

In dit protocol werden retinitis pigmentosa, door de patiënt geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleide 3D-retinale organoïden gegenereerd. Die organoïden recapituleerden met succes enkele klinische fenotypes van de ziekte retinitis pigmentosa.

Samenvatting

Retinitis pigmentosa (RP) is een zeldzame en erfelijke retinale degeneratieve ziekte met een prevalentie van ongeveer 1/4.000 mensen wereldwijd. De meerderheid van de RP-patiënten heeft progressieve fotoreceptordegeneratie die leidt tot verlies van perifeer gezichtsvermogen, nachtblindheid en ten slotte totale blindheid. Tot op heden zijn duizenden mutaties in meer dan 90 genen gerapporteerd die geassocieerd zijn met RP. Momenteel zijn er weinig diermodellen beschikbaar voor alle aangetaste genen en verschillende soorten mutaties, wat het ontcijferen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de gen-/mutatiepathologie grotendeels belemmert en de behandeling en de ontwikkeling van geneesmiddelen beperkt. Patiëntgeïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleide 3D retinale organoïden (RO's) hebben een beter systeem geboden om de ziekte met vroege aanvang bij de mens te modelleren dan cellen en dieren. Om RP te bestuderen, werden die van de patiënt afgeleide 3D-retinale organoïden gebruikt om de klinische fenotypes van RP samen te vatten. In de RP-patiënt-afgeleide RO's werd Rhodopsine-mislokalisatie duidelijk weergegeven. Vergeleken met andere diermodellen recapituleren iPSC-afgeleide retinale organoïdemodellen van patiënten nauwkeuriger RP-kenmerken en vormen ze een ideale benadering voor het onderzoeken van de pathogenese van de ziekte en voor de ontwikkeling van geneesmiddelen.

Inleiding

Menselijke netvliesaandoeningen, zoals retinitis pigmentosa en leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, worden slecht begrepen door het ontbreken van geschikte experimentele modellen 1,2. Hoewel het netvlies van de muis erg lijkt op het menselijk netvlies en een krachtig hulpmiddel is voor het bestuderen van de etiologie van netvliesdegeneratie, zijn er enorme soortverschillen tussen muizen en mensen 3,4. De nucleaire architectuur van de fotoreceptorcellen bij muizen en mensen is bijvoorbeeld anders en het netvlies van de muis heeft geen macula 5,6. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) technologie stelt ons in staat om de gespecialiseerde cellen van organismen terug te brengen naar de oorspronkelijke pluripotente toestand door middel van de "herprogrammerings"-processen door combinaties van transcriptiefactoren en/of verbindingen 7,8,9,10. Die iPSC's hebben een bijna onbeperkt delings- en proliferatievermogen en kunnen zich ontwikkelen tot verschillende soorten cellen. Onlangs zijn iPSC-afgeleide 3D-retinale organoïden ontwikkeld om de vroege gebeurtenissen van de ontwikkeling van het menselijk netvlies te modelleren en om de pathofysiologie van menselijke netvliesaandoeningen af te bakenen 11,12,13,14,15. Retinale organoïden hebben veel voordelen: (1) ze kunnen worden gebruikt om in vivo de ontwikkeling van het netvlies en de pathogenese van ziekten samen te vatten; (2) ze kunnen worden gebruikt voor high-throughput screening van geneesmiddelen en preklinische proeven met gentherapie; en (3) ze kunnen worden gebruikt als preklinische evaluaties van behandelingsopties voor retinale degeneratieve ziekten 16,17.

Een van de doelstellingen van dit project was het bestuderen van de pathogenese van retinale pigmentosa (RP), een ziekte die ongeneeslijk blijft vanwege haar extreme heterogeniteit18. Tot op heden zijn meer dan 90 genen geïdentificeerd die geassocieerd zijn met RP19,20. Het RPGR-gen, dat wordt beschouwd als een van de meest voorkomende oorzakelijke genen van RP15, is goed voor ongeveer 16% van alle RP 4,21,22. iPSC's met een frameshift-mutatie in het RPGR-gen zijn met succes gegenereerd en gedifferentieerd tot georganiseerde en gestratificeerde 3D-retinale organoïden14. Door gebruik te maken van deze organoïden werden abnormale morfologie van de fotoreceptorlaag en de dislocatie van opsins in fotoreceptoren waargenomen.

Al met al wordt hier in detail een stapsgewijs en laagdrempelig protocol beschreven over het genereren van door de patiënt afgeleide 3D-retinale organoïden23,24. Die organoïden recapituleerden met succes enkele klinische fenotypes van de ziekte. Dit biedt een bemoedigend model om de ontwikkeling van het netvlies en ziektemechanismen te bestuderen, voor therapeutische screening en om toekomstige preklinische gentherapie te evalueren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek van Capital Medical University.

1. Celcultuur en generatie van iPSC's

  1. Kies RPGR-patiënten voor deze studie. Hier werden drie patiënten, één familiale drager en drie gezonde controles, gebruikt. Patiënt 1 bezat een mutatie c.1685_1686delAT in exon 14 van het RPGR-gen, patiënt 2 had een mutatie c.2234_2235delGA in exon 15 van het RPGR-gen en patiënt 3 had een mutatie c.2403_2404delAG in exon 15 van het RPGR-gen. Kies drie gezonde vrijwilligers als controles14. Verzamel perifere volbloedmonsters van de patiënten en gezonde controles met venapunctie en doe ze in bloedafnamebuisjes (Materiaaltabel).
  2. Isoleer perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) door middel van dichtheidsgradiëntcentrifugatie met een dichtheidsgradiëntmedium25. Breid CD34+ PBMC's geactiveerd met cytokine uit in 8 ml groeibevorderend medium (Tabel 1) in een petrischaaltje.
  3. Na 1 week, elektroporeren de CD34-positieve perifere bloed mononucleaire cellen met een transfectiesysteem (Lijst van Materialen) en kies CD34-positieve cellen en het ingebouwde T-01 Programma zonder enige wijziging. Transfecteer een cocktail van herprogrammeringsplasmiden (2 μg) die menselijke OCT4-, SOX2-, NANOG-, LIN28-, c-MYC- en KLF4-eiwitten kunnen produceren.
  4. Zaai de getransfecteerde cellen in vitronectine humane recombinante eiwitgecoate platen met zes putjes in 2 ml DMEM/F12 aangevuld met B-27 (1x), N-2 (1x), PD0325901 (0,5 μM), bFGF (100 ng/ml), CHIR99021 (3 μM), HA-100 (10 μM), A-83-01 (0,5 μM) en hLIF (1000 U/ml) om de groei van de iPSC's te behouden.
  5. Pluk 3 weken na transductie de kolonies van iPSC's handmatig, breng ze vervolgens over in platen met zes putjes en bewaar ze in reagens B (Materiaaltabel) voor expansie.
    OPMERKING: De platen met zes putjes moeten worden gecoat met humaan recombinant vitronectine-eiwit. Verdun vitronectineoplossing in DPBS om een eindconcentratie van 10 μg/ml te bereiken. Voeg de verdunde vitronectine toe aan met weefselkweek behandelde platen met zes putjes. Draai het kweekwerk om de vitronectine-oplossing gelijkmatig over het oppervlak van de platen met zes putjes te verdelen. Incubeer de platen gedurende ten minste 1 uur bij 37 °C.
  6. Zorg ervoor dat cellen worden gedesaggregeerd met 0,5 mM EDTA wanneer de iPSC's ongeveer 80%-90% samenvloeien en dat de splitsingsverhouding 1:8 of 1:10 is. Voeg op de dag van passage blebbistatine (2,5 μM) toe aan reagens B (tabel 1).
    OPMERKING: Blebbistatine werd gebruikt om celadhesie en de levensvatbaarheid van stamcellen te bevorderen en stamcelapoptose te voorkomen. 18 uur later moet het medium worden ververst met reagens B.

2. Generatie van menselijke RO's

OPMERKING: De iPSC's moeten worden gedissocieerd wanneer de iPSC's ongeveer 80%-90% samenvloeiing bereiken.

  1. Dissocieer de menselijke iPSC (hiPSC)-kolonies met behulp van 0,5 mM EDTA bij 37 ◦C gedurende 5 minuten.
  2. Scheid de hiPSC-klonters in afzonderlijke cellen door voorzichtig te pipetteren. Tel de cellen voor onderhoud en kweek ze in reagens B (tabel 1).
  3. Zaai op dag 0 12.000 cellen/putje in 96 conische putjes met V-bodem voor celreaggregatie in 100 μL differentiatiemedium (Tabel 1).
  4. Zuig op dag 6 voorzichtig het celkweekmedium op en voeg 100 μL van het differentiatiemedium toe dat 20 μM Y 27632 en 1,5 nM (55 ng/ml) hBMP4 bevat.
  5. Vervang op dag 9 de helft van het differentiatiemedium om de hBMP4-concentratie rond de 0,75 nM te houden.
  6. Streef naar 60 μL van het differentiatiemedium uit elk putje en voeg 60 μL van het verse differentiatiemedium met 20 μM Y-27632 toe aan elk putje.
  7. Vervang op dag 12 de helft van het differentiatiemedium door een vers differentiatiemedium om 0,375 nM hBMP4 te bereiken.
  8. Breng op dag 18 de aggregaten over in een nieuw petrischaaltje met tips van 10 ml en snijd elk aggregaat in 2-4 stukken met een microchirurgisch mes onder een omgekeerde microscoop om meer organoïden te genereren.
  9. Breng de aggregaten van dezelfde groep over in een centrifugebuis van 15 ml. Wanneer de aggregaten zich op de bodem van de buizen nestelen, zuigt u de supernatant op.
  10. Resuspendeer de aggregaten met 1 ml neuraal retina medium (DMEM/F12, 10% foetaal runderserum, 1% N-2 supplement, 0,5 μM retinoïnezuur, 0,1 mM taurine, 1% penicilline-streptomycine) en breng ze over in petrischaaltjes met antiaanbaklaag en 15 ml neuraal retina medium erin. Doe 10-15 retinale organoïden in één petrischaaltje.
  11. Ververs het kweekmedium elke 5 dagen. Houd de cultuur in het donker, aangezien retinoïnezuur gevoelig is voor licht (Figuur 1) en controleer de vorming van het zelforganiserende menselijke netvliesweefsel met een omgekeerde microscoop 26,27,28,29.

3. Analyse van retinale organoïden

  1. Immunofluorescentiekleuring van hiPSC-afgeleid 3D-netvlies
    1. Fixeer het 3D-netvlies gedurende 20 minuten bij 4 °C in 1 ml vers 4% paraformaldehyde in DPBS. Spoel de organoïden vervolgens af met 1 ml DPBS-buffer.
    2. Meet 0,5 g agarose af (materiaaltabel) en meng het agarosepoeder met 100 ml DPBS in een magnetronbestendige kolf. Gebruik een magnetron om de agarose 1-3 minuten op te lossen totdat deze volledig is opgelost. Laat de agaroseoplossing afkoelen tot ongeveer 40 °C.
    3. Integreer ze in 2% in DPBS.
    4. Snijd de samples met een vibratoom in secties met een dikte van 50 μm. Plaats de gesneden secties op hechtingsmicroscoopglaasjes (Materiaaltabel) en bewaar ze bij -80 °C.
    5. Ontdooi de plakjes 15 minuten op kamertemperatuur (RT).
    6. Was de plakjes 5 minuten met DPBS en herhaal 3x.
    7. Gebruik 0,5% Triton X-100 in DPBS-oplossing om de plakjes gedurende 15 minuten bij RT te permeeren.
    8. Verwijder de permeabilisatieoplossing, was de plakjes 5 minuten met DPBS en herhaal 3x.
    9. Incubeer de plakjes met 1% BSA en 0,5% Triton X-100 in DPBS gedurende 30 minuten bij RT.
    10. Incubeer de plakjes met anti-Rhodopsine-antilichaam (1:1000) en anti-L/M opsine-antilichaam (1:1000) verdund in 1% BSA en 0,1% Triton X-100 gedurende 16 uur bij 4 °C.
    11. Was de plakjes 5 minuten met DPBS en herhaal 3x.
    12. Incubeer de plakjes met ezel anti-muis en konijn secundair antilichaam (1:500) verdund in 1% BSA en 0,1% Triton X-100 gedurende 1 uur bij RT.
    13. Voeg 30 nM 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) toe in DPBS gedurende 15 minuten bij RT voor nucleaire kleuring.
    14. Was de plakjes 5 minuten met DPBS en herhaal 5x.
    15. Monteer de plakjes met inbeddingsmedium (Materiaaltabel) en bedek de dia's (Materiaaltabel). Bewaar in een donkere doos en bewaar maximaal 4 weken bij 4 °C.
  2. RNA-extractie en RNA-sequencing
    1. Verzamel 1-3 (afhankelijk van de grootte) 3D-netvlies afgeleid van elke controle en patiënt op dezelfde differentiatietijdstippen (dag 0, dag 47, dag 91, dag 121 en dag 151) in 1 ml RNA-extractiereagens (Materiaaltabel) op ijs.
    2. Gebruik de homogenisator (materiaaltabel) om de monsters te verstoren, 1 min AAN, 30 s UIT, gedurende drie cycli, en controleer het monster op verstoring.
    3. Stop de homogenisatie wanneer de monsters volledig gehomogeniseerd zijn en draai de buis krachtig gedurende 30 s.
    4. Incubeer de monsters gedurende 15 minuten op ijs.
    5. Centrifugeer de monsters bij 13.800 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C en breng het bovenstaande over in een nieuwe RNasevrije buis van 2 ml.
    6. Voeg 0,4 ml chloroform toe aan de buis, vortex en centrifugeer bij 13.800 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    7. Breng een deel (ongeveer 2/3) van de kleurloze bovenste fase voorzichtig over naar een nieuwe RNase-vrije buis. Zuig of verstoor de witte interface met DNA niet.
    8. Voeg 0,5 ml koude isopropanol toe, vortex gedurende 30 s en centrifugeer op 13.800 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Aan de zijkant van de buisbodem vormt zich een pellet.
    9. Zuig het bovenstaande middel voorzichtig op met een pipetpunt en bewaar de pellet.
      OPMERKING: De RNA-pellet is geleiachtig en transparant wanneer de zuiverheid zeer hoog is.
    10. Voeg 1 ml koude 70% ethanol toe, draai de monsters krachtig gedurende 30 s en centrifugeer op 13.800 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    11. Zuig het bovenstaande voorzichtig op met een pipetpunt en laat de pellet 5-10 minuten aan de lucht drogen in de kap bij RT. Droog de korrel niet te lang.
    12. Voeg 20-50 μL RNasevrij water toe en suspendeer de pellet voorzichtig door op en neer te pipetteren.
    13. Breng 1 μL RNA aan op een spectrofotometer (Materiaaltabel). In totaal werd ongeveer 10 μg RNA van respectievelijk controles en patiënten gebruikt voor de bereiding van de Illumina-bibliotheek30.
    14. Bewaar het RNA bij -80 °C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De schematische illustratie beschrijft de differentiatieprocedures om gezonde en patiënt-iPSC-afgeleide retinale organoïden te genereren (Figuur 1). Van iPSC tot RO's, variaties kunnen worden geproduceerd als gevolg van verschillende factoren. De status van de iPSC is de bepalende stap van de RO-generatie. Bovendien wordt het ten zeerste aanbevolen dat onderzoekers elke stap, catalogus en lotnummer van alle media registreren, zodat de volledige experimenten ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Retinale organoïden zijn 3D, gelamineerde structuren afgeleid van hiPSC's of embryonale stamcellen (ESC's) en fungeren als een veelbelovend model om de ruimtelijke en temporele patronen van de ontwikkeling van het menselijk netvlies na te bootsen31,32. De RO's bestaan uit verschillende soorten retinale cellen, waaronder fotoreceptoren, bipolaire cellen, ganglioncellen, amacriene cellen, horizontale cellen en Müller glia

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs onthullen geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

We danken M.S. Yan-ping Li en Zhuo-lin Liu voor hun technische ondersteuning en nuttige opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82171470, 31871497, 81970838, Z20J00122), Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014, 82125007) en National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96 V-bottomed conical wellsSumitomo BakeliteMS-9096VZ
A-83–01R&D Systems2939/10
Adhesion microscope slidesCITOtest188105
AgaroseGene Tech111760
Amaxa Nucleofector 2b DeviceLonzaAAB-1001Transfectiesysteem
B-27Thermo Fisher Scientific17504044
bFGFR&D Systems3718-FB
BlebbistatinNuwacell BiotechnologiesRP01008
Blood collection tubeBD Vacutainer EDTA366643
CHIR99021TOCRIS4423/10
Cover slidesCITOGLAS10212440C
cTarget hPSC MediumNuwacell BiotechnologiesRP01020
DAPIInvitrogenD-1306
DMEM/Ham’s F12Gibco10565-042
Donkey anti-mouse 488InvitrogenA-21202
Donkey anti-rabbit 594InvitrogenA-21207
EDTANuwacell BiotechnologiesRP01007
Embedding mediumFluorSaveTM Reagent345789
EX-CYTE growth enhancement mediumSigma811292Groeiverbeteringsmedium
Fetal bovine serumGibco04-002-1A
FicollSigma-Aldrich26873-85-8Dichtheidsgradiëntmedium
FLT3LPeprotech300-19
GlutaMAXLife Technologies35050-061L-glutamine supplement
HA-100STEMCELL Technologies72482
Ham’s F12Gibco11765-054
hLIFThermo Fisher ScientificAF-250-NA
HomogenizerEDEN labD-130
IL-3Peprotech213-13
IL-6Peprotech200-06
Iscove’s Modified Dulbecco MediumGibco12440053
KnockOut Serum Replacement - Multi-SpeciesGibcoA3181502Serumvervangingsmedium
L/M-opsinMilliporeab5405
MonothioglycerolSigmaM6145
N-2 supplementThermo Fisher Scientific17502048
Nanodrop SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND2000Spectrofotometer
ncEpic 125x SupplementNuwacell BiotechnologiesRP01001-02125x supplement
ncEpic Basal MediumNuwacell BiotechnologiesRP01001-01Basaal hpsc medium
ncLaminin511 human recombinant proteinNuwacell BiotechnologiesRP01025
PD0325901STEMCELL Technologies72182
Penicillin-streptomycinGibco15140-122
Recombinant human BMP4R&D Systems314-BP
Retinoic acidSigmaR2625
RhodopsinSigmaO4886
RNeasy Mini KitQiagen74104
RNeasy Mini KitQiagen74104
sIL6-RThermo Fisher ScientificRP-75602
StemSpan SFEM mediumSTEMCELL Technologies09600
TaurineSigmaT8691
Trizol reagentInvitrogen15596026
VitronectinNuwacell BiotechnologiesRP01002
V-Lance knifeAlcon Surgical8065912001

Referenties

  1. Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
  2. Lin, Q., et al. Generation of nonhuman primate model of cone dysfunction through in situ AAV-mediated CNGB3 ablation. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 869-879 (2020).
  3. Zhou, M., Liu, Y., Ma, C. Distinct nuclear architecture of photoreceptors and light-induced behaviors in different strains of mice. Translational Vision Science & Technology. 10 (2), 37(2021).
  4. Zito, I., et al. RPGR mutation associated with retinitis pigmentosa, impaired hearing, and sinorespiratory infections. Journal of Medical Genetics. 40 (8), 609-615 (2003).
  5. Solovei, I., et al. Nuclear architecture of rod photoreceptor cells adapts to vision in mammalian evolution. Cell. 137 (2), 356-368 (2009).
  6. Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A Comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), 0125631(2015).
  7. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  8. Han, J. W., Yoon, Y. S. Induced pluripotent stem cells: Emerging techniques for nuclear reprogramming. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (7), 1799-1820 (2011).
  9. Kim, J. S., Choi, H. W., Choi, S., Do, J. T. Reprogrammed pluripotent stem cells from somatic cells. International Journal of Stem Cells. 4 (1), 1-8 (2011).
  10. Li, Y. P., Liu, H., Jin, Z. B. Generation of three human iPSC lines from a retinitis pigmentosa family with SLC7A14 mutation. Stem Cell Research. 49, 102075(2020).
  11. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686(2019).
  12. Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 366(2020).
  13. Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
  14. Deng, W. L., et al. Gene correction reverses ciliopathy and photoreceptor loss in iPSC-derived retinal organoids from retinitis pigmentosa patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
  15. Gao, M. L., et al. Patient-specific retinal organoids recapitulate disease features of late-onset retinitis pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128(2020).
  16. Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
  17. Aasen, D. M., Vergara, M. N. New drug discovery paradigms for retinal diseases: A focus on retinal organoids. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 36 (1), 18-24 (2020).
  18. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  19. Anasagasti, A., Irigoyen, C., Barandika, O., Lopez de Munain, A., Ruiz-Ederra, J. Current mutation discovery approaches in Retinitis Pigmentosa. Vision Research. 75, 117-129 (2012).
  20. Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Genes and mutations causing autosomal dominant retinitis pigmentosa. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 5 (10), 017129(2014).
  21. Kortum, F., et al. X-linked retinitis pigmentosa caused by non-canonical splice site variants in RPGR. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 850(2021).
  22. Megaw, R. D., Soares, D. C., Wright, A. F. RPGR: Its role in photoreceptor physiology, human disease, and future therapies. Experimental Eye Research. 138, 32-41 (2015).
  23. Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100438(2021).
  24. Liu, H., Hua, Z. Q., Jin, Z. B. Modeling human retinoblastoma using embryonic stem cell-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100444(2021).
  25. Zhang, X. H., Xie, Y., Xu, K., Li, Y. Generation of an induced pluripotent stem cell line BIOi002-A from a patient with autosomal dominant optic atrophy. Stem Cell Research. 53, 102278(2021).
  26. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  27. Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communication. 6, 6286(2015).
  28. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  29. Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
  30. Kumar, R., et al. A high-throughput method for illumina RNA-seq library preparation. Frontiers in Plant Science. 3, 202(2012).
  31. Fligor, C. M., et al. Three-dimensional retinal organoids facilitate the investigation of retinal ganglion cell development, organization and neurite outgrowth from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 8 (1), 14520(2018).
  32. Morizur, L., Herardot, E., Monville, C., Ben M'Barek, K. Human pluripotent stem cells: A toolbox to understand and treat retinal degeneration. Molecular and Cellular Neurosciences. 107, 103523(2020).
  33. Bhatt, L., Groeger, G., McDermott, K., Cotter, T. G. Rod and cone photoreceptor cells produce ROS in response to stress in a live retinal explant system. Molecular Vision. 16, 283-293 (2010).
  34. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  35. Xue, Y., et al. Retinal organoids long-term functional characterization using two-photon fluorescence lifetime and hyperspectral microscopy. Frontiers in Cellular Neurosciences. 15, 796903(2021).
  36. Colombo, L., et al. Comparison of 5-year progression of retinitis pigmentosa involving the posterior pole among siblings by means of SD-OCT: A retrospective study. BMC Ophthalmology. 18 (1), 153(2018).
  37. Ferrari, S., et al. Retinitis pigmentosa: Genes and disease mechanisms. Current Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
  38. Shintani, K., Shechtman, D. L., Gurwood, A. S. Review and update: Current treatment trends for patients with retinitis pigmentosa. Optometry. 80 (7), 384-401 (2009).
  39. Wang, A. L., Knight, D. K., Vu, T. T., Mehta, M. C. Retinitis pigmentosa: Review of current treatment. International Ophthalmology Clinics. 59 (1), 263-280 (2019).
  40. Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
  41. Parfitt, D. A., et al. Identification and correction of mechanisms underlying inherited blindness in human iPSC-derived optic cups. Cell Stem Cell. 18 (6), 769-781 (2016).
  42. Shimada, H., et al. In vitro modeling using ciliopathy-patient-derived cells reveals distinct cilia dysfunctions caused by CEP290 mutations. Cell Reports. 20 (2), 384-396 (2017).
  43. Deretic, D., Wang, J. Molecular assemblies that control rhodopsin transport to the cilia. Vision Research. 75, 5-10 (2012).
  44. Rao, K. N., Li, L., Anand, M., Khanna, H. Ablation of retinal ciliopathy protein RPGR results in altered photoreceptor ciliary composition. Scientific Reports. 5, 11137(2015).
  45. Zhang, X., Wang, W., Jin, Z. B. Retinal organoids as models for development and diseases. Cell Regeneration. 10 (1), 33(2021).
  46. Zhang, X. H., Jin, Z. B. Patient iPSC-derived retinal organoids: Observable retinal diseases in-a-dish. Histology and Histopathology. 36 (7), 705-710 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Ge nduceerde pluripotente stamcellenfotoreceptordegeneratiepati ntafgeleide organo denmislokalisatie van rhodopsineretinale degeneratieziektemodelleringgeneesmiddelenontwikkelinggenmutatie

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.