Methodenartikel

Milliseconde waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie voor de studie van alfa-synucleïne structurele dynamica onder fysiologische omstandigheden

2.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64050

⸱

23 juni 2022

 , 
1Living Systems Institute, Department of Biosciences, University of Exeter

In dit artikel

Samenvatting

Het structurele ensemble van monomeer alfa-synucleïne beïnvloedt de fysiologische functie en fysisch-chemische eigenschappen. Het huidige protocol beschrijft hoe milliseconde waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie en daaropvolgende data-analyses kunnen worden uitgevoerd om conformatie-informatie over het monomeer van dit intrinsiek ongeordende eiwit onder fysiologische omstandigheden te bepalen.

Samenvatting

Alfa-synucleïne (aSyn) is een intrinsiek ongeordend eiwit waarvan de fibrillaire aggregaten overvloedig aanwezig zijn in Lewy-lichamen en neurieten, die de kenmerken zijn van de ziekte van Parkinson. Toch is veel van zijn biologische activiteit, evenals de aggregatie ervan, centraal betrokken bij de oplosbare monomeervorm van het eiwit. Opheldering van de moleculaire mechanismen van aSyn biologie en pathofysiologie vereist structureel sterk opgeloste methoden en is gevoelig voor biologische omstandigheden. De oorspronkelijk uitgevouwen, meta-stabiele structuren maken monomere aSyn onhandelbaar voor veel structurele biologietechnieken. Hier wordt de toepassing van een dergelijke benadering beschreven: waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) op de milliseconde tijdschaal voor de studie van eiwitten met lage thermodynamische stabiliteit en zwakke beschermingsfactoren, zoals aSyn. Op de milliseconde tijdschaal bevatten HDX-MS-gegevens informatie over de toegankelijkheid van oplosmiddelen en waterstofgebonden structuur van aSyn, die verloren gaan bij langere etiketteringstijden, wat uiteindelijk een structurele resolutie tot het aminozuurniveau oplevert. Daarom kan HDX-MS informatie verstrekken met hoge structurele en temporele resoluties over conformatiedynamica en thermodynamica, intra- en intermoleculaire interacties en de structurele impact van mutaties of veranderingen in omgevingsomstandigheden. Hoewel breed toepasbaar, wordt aangetoond hoe milliseconde HDX-MS-metingen in monomere aSyn kunnen worden verkregen, geanalyseerd en geïnterpreteerd.

Inleiding

De ziekte van Parkinson (PD) is een neurodegeneratieve ziekte die wereldwijd miljoenen mensen treft1. Het wordt gekenmerkt door de vorming van cytoplasmatische insluitsels bekend als Lewy bodies en Lewy neurites in de substantia nigra pars compacta regio van de hersenen. Deze cytoplasmatische insluitsels blijken aggregaten van het intrinsiek ongeordende eiwit aSyn2 te bevatten. Bij PD en andere synucleinopathieën transformeert aSyn van een oplosbare ongeordende toestand in een onoplosbare, sterk gestructureerde zieke toestand. In zijn oorspronkelijke vorm neemt monomere aSyn een breed scala aan conformaties aan, gestabiliseerd door elektrostatische interacties op lange afstand tussen zijn N- en C-termini en hydrofobe interacties tussen zijn C-terminus en niet-amyloïde bètacomponent (NAC) regio 3,4,5,6. Eventuele verstoringen in die stabiliserende interacties, zoals mutaties, posttranslationele modificaties en veranderingen in de lokale omgeving, kunnen leiden tot het verkeerd vouwen van het monomeer, waardoor het proces van aggregatiewordt geactiveerd 7.

Hoewel er een enorme hoeveelheid onderzoek bestaat naar de oligomere en fibrillaire vormen van aSyn 8,9,10,11, is er een cruciale behoefte om de monomere vorm van het eiwit te bestuderen en beter te begrijpen welke conformers functioneel zijn (en hoe) en welke vatbaar zijn voor aggregaat 8,9,10,11 . Omdat het intrinsiek ongeordend is, slechts 14 kDa groot is en moeilijk te kristalliseren, is het aSyn-monomeer niet vatbaar voor de meeste structurele biologische technieken. Een techniek die in staat is om de conformatiedynamiek van monomere aSyn te meten, is milliseconde HDX-MS, die onlangs belangrijke structurele waarnemingen heeft gegenereerd die uitdagend of onmogelijk te verkrijgen zouden zijn anders 12,13,14. Milliseconde HDX-MS meet gevoelig het gemiddelde van het eiwitconformatie-ensemble door de isotopische uitwisseling bij amidewaterstoffen te monitoren, wat wijst op de toegankelijkheid van oplosmiddelen en de deelname van het waterstofbindingsnetwerk van een bepaald eiwitgebied op de millisecondetijdschaal. Het is noodzakelijk om het milliseconde-aspect van de HDX-MS te benadrukken, omdat aSyn, vanwege zijn native uitgevouwen, meta-stabiele aard, een zeer snelle waterstofuitwisselingskinetiek vertoont die zich ver onder de ondergrens van conventionele HDX-MS-systemen manifesteert. Het grootste deel van het aSyn-molecuul heeft bijvoorbeeld waterstof volledig uitgewisseld voor deuterium onder intracellulaire omstandigheden in minder dan 1 s. Verschillende laboratoria hebben inmiddels snelmenginstrumenten gebouwd; in dit geval wordt een prototype snel mengend quench-flow instrument gebruikt dat HDX-MS kan uitvoeren met een dead-time van 50 ms en een temporele resolutie van 1 ms15. Hoewel milliseconde HDX-MS onlangs acuut belangrijk is geweest in de studie van aSyn, is het waardevol bij het bestuderen van intrinsiek ongeordende eiwitten / regio's op grotere schaal en een groot aantal eiwitten met lussen / regio's die slechts zwak stabiel zijn. Bijvoorbeeld peptidegeneesmiddelen (bijv. Insuline; GLP-1/glucagon; tirzepatide) en peptidefusie-eiwitten (bijv. de HIV-remmer FN3-L35-T1144) zijn belangrijke medicijnformaten waarbij structurele en stabiliteitsinformatie in de oplossingsfase een kritische input kan zijn voor beslissingen over de ontwikkeling van geneesmiddelen, en toch is het peptidegedeelte vaak slechts zwak stabiel en onhandelbaar door HDX-MS op de secondentijdschaal 16,17,18,19,20 . Van opkomende HDX-MS-methoden met labeling in de seconden/minuten-domeinen is aangetoond dat ze structurele informatie afleiden voor DNA G-quadruplexen, maar het zou mogelijk moeten zijn om dit uit te breiden naar meer diverse oligonucleotidestructuren door de toepassing van milliseconde HDX-MS21.

HDX-MS-experimenten kunnen op drie verschillende niveaus worden uitgevoerd: (1) bottom-up (waarbij het gelabelde eiwit proteolytisch wordt verteerd), (2) middle-down (waarbij het gelabelde eiwit proteolytisch wordt verteerd en de resulterende peptiden verder worden gefragmenteerd door soft-fragmentation technieken), en (3) top-down (waarbij soft-fragmentation technieken het gelabelde eiwit direct fragmenteren)22 . Submoleculaire HDX-MS-gegevens stellen ons dus in staat om het uitwisselingsgedrag te lokaliseren naar specifieke regio's van een eiwit, waardoor het van cruciaal belang is om voldoende sequentiedekking voor dergelijke experimenten te hebben. De structurele resolutie van elk HDX-MS-experiment is afhankelijk van het aantal proteolytische peptiden of fragmenten afgeleid van het eiwit bij vertering of zachte fragmentatie, respectievelijk. In elk van de drie hierboven beschreven experimenttypen wordt de verandering in amide-uitwisseling bij elk peptide / fragment teruggekoppeld naar de primaire structuur van het eiwit om het gedrag van gelokaliseerde gebieden van het eiwit aan te geven. Hoewel de hoogste structurele resolutie wordt bereikt door zachte fragmentatie, valt de beschrijving van deze experimenten buiten het bereik van de huidige studie, die zich richt op het meten van aSyn monomeer conformaties. Uitstekende resultaten kunnen worden verkregen met de vaak toegepaste "bottom-up" workflow die hier wordt beschreven.

Hier worden procedures gegeven over (1) hoe aSyn-monsters en HDX-MS-buffers te bereiden en te verwerken, (2) hoe peptidemapping uit te voeren voor een bottom-up HDX-MS-experiment, (3) hoe HDX-MS-gegevens over monomere aSyn te verkrijgen onder fysiologische omstandigheden, met name in het millisecondetijddomein (met behulp van een op maat gemaakt instrument; alternatieve instrumenten voor milliseconde-etikettering zijn ook beschreven), en (4) hoe de HDX-MS-gegevens te verwerken en te analyseren. Methoden met behulp van monomere aSyn bij fysiologische pH (7,40) in twee oplossingsomstandigheden worden hier geïllustreerd. Hoewel kritisch nuttig in de studie van aSyn, kunnen deze procedures worden toegepast op elk eiwit en zijn ze niet beperkt tot intrinsiek ongeordende eiwitten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Eiwitexpressie en zuivering van aSyn

  1. Bereid aSyn voor naar aanleiding van een eerder gepubliceerd rapport9.
  2. Dialyseren in een veilige opslagbuffer (bijv. Tris, pH 7,2 ).
  3. Concentreer het monster indien nodig (bijv. spinfiltermicrocentrifugebuizen met 3 kDa MWCO, 14.000 x g gedurende ongeveer 10-30 minuten, zie materiaaltabel).
    OPMERKING: Het wordt geadviseerd om niet overmatig te concentreren. De integriteit van het monomeerensemble is niet geverifieerd boven 25 μM.
  4. Aliquot en bewaren bij −80 °C
    OPMERKING: Het aSyn monomeer eiwit is stabiel voor maximaal 1 jaar in deze opslagomstandigheden.

2. HDX buffer voorbereiding

OPMERKING: Aangezien Tris een hoge temperatuurcoëfficiënt heeft, moet de pH-meting worden aangepast aan de temperatuur waarbij de HDX-reactie zal worden uitgevoerd, wat in dit protocol 20 °C is.

  1. Bereid evenwichtsbuffer voor toestand A en toestand B voor door 0,002 mol Tris te wegen in 100 ml water van LC-MS-kwaliteit. Voeg voor toestand B 29,8 mg KCl, 14,2 mg MgCl2, 36,8 g CaCl2 en 836 mg NaCl toe aan de Tris-buffer. Stel de pH in op 7,40 ± 0,05.
    OPMERKING: De evenwichtsbuffer moet de omstandigheden bevatten waaronder aSyn moet worden bestudeerd. In dit geval gaat het om 20 mM Tris bij pH 7,4 +/− zouten.
  2. Bereid de etiketteringsbuffer voor toestand A en toestand B voor door 0,002 mol Tris in 100 ml gedeutereerd water te wegen. Voeg voor toestand B 29,8 mg KCl, 14,2 mg MgCl2, 36,8 g CaCl2 en 836 mg NaCl toe aan de Tris-etiketteringsbuffer. De pD van de etiketteringsbuffer komt overeen met de pH van de evenwichtsbuffer. Aangezien pH = pD - 0,41, zo instellen dat de pH-meter 6,99 ± 0,0523,24.
    OPMERKING: De etiketteringsbuffer moet dezelfde componenten hebben als de evenwichtsbuffer, behalve dat deze wordt bereid met gedeutereerd water.
  3. Bereid de blusbuffer voor door 0,010 mol Tris en 0,050 mol ureum af te wegen en vul aan tot 100 ml met water van LC-MS-kwaliteit. Stel de pH in op 2,50 ± 0,05 bij 0,5 °C.
    OPMERKING: Voorafgaand aan HDX-experimenten moet een quenchbufferscherm worden uitgevoerd om de beste quenchbuffer voor het eiwit van belang te identificeren. Verschillende concentraties en combinaties van denaturanten (bijv. ureum en guanidiniumhydrochloride) en reductiemiddelen (bijv. Tris (2-carboxyethyl)fosfine) worden gescreend, samen met fysieke parameters zoals vangvolume en temperatuur, om het gebluste eiwit effectief te ontvouwen en te verteren. Een blusbuffer bestaande uit 100 mM Tris en 0,5 M ureum bij een pH van 2,50 is optimaal voor dit onderzoek.
  4. Bereid de wasbuffer van de verteringskolom voor door 0,125 mol guanidiniumhydrochloride in een glazen fles van Duran te wegen. Voeg 25 ml methanol en 250 μl mierenzuur toe. Maak tot 250 ml met water van LC-MS-kwaliteit.
    OPMERKING: Gebruik voor de Enzymate BEH pepsinekolom (zie Tabel met materialen) een kolomwasbuffer van 0,5 M guanidiniumhydrochloride, 10% (v/v) methanol en 0,1% (v/v) mierenzuur.
  5. Bereid de zwakke wassing van de spuit voor door 0,5 μL mierenzuur te pipetteren in 249,5 ml water van LC-MS-kwaliteit.
  6. Bereid de spuit sterke was voor door gelijke delen water van LC-MS-kwaliteit, methanol, acetonitril en isopropanol te mengen. Voeg mierenzuur toe aan een uiteindelijke concentratie van 2% (v/v).
    OPMERKING: Om kruisbesmetting tussen de verschillende buffers en het eiwit te voorkomen en om reiniging van de injectiepoort mogelijk te maken, is het van cruciaal belang dat spuitwasoplossingen worden bereid en dat het stroompad naar de klep (vaak de "wasvoering" genoemd) volledig is geprimed met vloeistof. Het mierenzuur is optioneel voor de zwakke wassing van de spuit.

3. Peptide mapping procedure

  1. Bereid het voorbeeld voor volgens de onderstaande stap.
    1. Filter ontdooide aSyn eiwitvoorraad uit de −80 °C vriezer met 0,22 μm spuitfilters. Meet de absorptie van het gefilterde voorraadeiwit bij 280 nm om de concentratie volgens de Beer-Lambert-wet te bepalen. Verdun het eiwit tot een concentratie van 5 μM in de evenwichtsbuffer (stap 2.1.).
      OPMERKING: De beer-lambertuswet: A = εcl, waarbij A absorptie is, ε de extinctiecoëfficiënt is van het eiwit op de gemeten golflengte (280 nm hier) met eenheden M−1cm−1, c is de eiwitconcentratie in M en l is de padlengte in cm. Voor wild-type aSyn26, ε = 5960 M−1cm−1.
  2. Stel de vloeistofchromatografiemethode in.
    1. Maak een inlaatbestand met een laad-/vangtijd van 3 minuten bij een druk van 7000-9000 psi, gevolgd door een gradiënt van 5% acetonitril tot 40% acetonitril in 7 minuten, gevolgd door herhaalde wasstappen van 5%-95% acetonitrilwater gedurende 10 minuten.
    2. Zorg ervoor dat slotspray (bijv. leucine-enkefaline, zie Materiaaltabel) met 2000 psi stroomt en is aangesloten op de bronvergrendelingsspraysonde van de massaspectrometer.
  3. Stel de massaspectrometrie MSE-methoden in.
    OPMERKING: MSE is een breedbandgegevensonafhankelijke acquisitiemethode zonder precursor massa-isolatie. Daarom worden alle ionen binnen het geselecteerde m/z-bereik verder gefragmenteerd met behulp van botsing-geïnduceerde dissociatie (CID)27.
    1. Kies in het MS-methodebestand MSE Continuum en stel een acquisitietijd in tussen 2-10 minuten, elektrospraybron en positieve resolutiemodus. Verkrijg MSE meer dan 50-2000 Da en scan elke 0,3 s.
    2. Voor functie 1 (lage energie) stelt u de val in en draagt u botsingsenergieën over op 4 V. Stel voor functie 2 (hoge energie) de botsingsenergie voor rampoverdracht in op constant bij 4V en de trapbotsingsenergie op basis van tabel 1 voor elk energieniveau.
      OPMERKING: Ionenmobiliteit MSE-methoden kunnen ook worden gebruikt. Alternatieve toewijzingsmethoden (bijv. gegevensafhankelijke acquisitie of DDA) kunnen naar goeddunken van de gebruiker worden gebruikt.
  4. Stel de autosampler-robot in (zie Materiaalopgave).
    1. Voeg 50 μL van het 5 μM eiwit toe aan een injectieflacon met totaal herstel. Plaats de injectieflacon in een monsterpositie in de rechterkamer van HDX. Zorg ervoor dat deze kamer op 0,5 °C is.
    2. Voeg één reagensflacon met evenwichtsbuffer en twee reagensflacons met etiketteringsbuffer toe aan de reagensposities één, twee en drie in de linker hdx-kamer. Zorg ervoor dat deze kamer op 20 °C staat door de Peltier-temperatuurregelaar in te stellen (zie Materiaaltabel). Voeg één reagensflacon met blusbuffer toe aan de reagenspositie in de rechterkamer van HDX.
    3. Voeg acht totale herstelflacons toe in de reactieposities van de linker HDX-kamer en acht maximale herstelflacons in de reactieposities van de hdx-rechterkamer.
      OPMERKING: Om volledige reiniging en maximale reproduceerbaarheid van de gedoseerde volumes te garanderen, wordt geadviseerd om een spuitwassing en prime wash op de autosampler-spuiten uit te voeren. Voer bijvoorbeeld een reeks uit van (1) zwakke was, (2) sterke was, (3) zwakke was voordat u de mappingexperimenten start. Deze volgorde kan uitgebreid worden herhaald en het wordt aanbevolen om dit tot 20x te doen of totdat de spuit volledig bevochtigd is.
    4. Stel een voorbeeldlijst in met de juiste LC- en MS-methoden in de planningssoftware en start de planning.
      OPMERKING: Voor deze studie wordt Chronos gebruikt als planningssoftware (zie Materiaaltabel).
  5. Verwerk de kaartgegevens.
    1. Identificeer peptiden uit de mapping experimentbestanden met behulp van de juiste software (zie Tabel met materialen).
    2. Importeer peptide-identificatiegegevens in DynamX (zie Materiaaltabel) met behulp van de volgende peptidedrempelparameters: minimale intensiteit = 5000, minimale sequentielengte = 0, maximale sequentielengte = 40, minimumproducten = 1, minimumproducten per aminozuur = 0,25, minimale opeenvolgende producten = 2, minimale somintensiteit voor producten = 0, minimumscore = 0 en maximale MH+ Fout (ppm) = 0.
      OPMERKING: U kunt ook de geoptimaliseerde instellingen afleiden volgens een aanbevolen workflow28.
    3. Selecteer Gegevens in het menu en klik op PLGS-resultaten importeren. Klik op Toevoegen om de relevante gegevensbestanden voor de spectrale toewijzing te kiezen. Wanneer alles is toegevoegd, klikt u op Volgende en voert u de bovenstaande filterinstellingen in. Klik vervolgens op Voltooien.
    4. Beheer handmatig isotopische toewijzingen om de uiteindelijke peptidedekkingskaart van aSyn in DynamX te verkrijgen.

4. Milliseconde waterstof/deuterium uitwisselingsstudie

  1. Reinig het FastHDX-prototype-instrument (zie Materiaaltabel) voordat u HDX-experimenten start.
    1. Open de compatibele HDX-software-GUI en laat het systeem initialiseren.
    2. Voer de temperatuur van de monsterkamer in als 20 °C en de bluskamer als 0,5 °C. Klik op Instellen om de nieuwe temperaturen toe te passen.
    3. Plaats de centrifugebuizen met water van LC-MS-kwaliteit bij alle inlaten.
    4. Controleer op het tabblad Titrator Plumbing Delivery zowel de linker- als de rechterspuit en klik op Prime om eventuele latente luchtbellen in de buizen te verwijderen. Herhaal dit totdat alle bubbels verdwenen zijn.
    5. Vink op het tabblad Macro's alle vakjes voor de spuiten aan. Klik op Kalibreer spuiten thuispositie. Klik op Wash Syringe Load Loop. Klik op Wash All Mixing Loop Volumes.
    6. Herhaal stap 4.1.5. 1x meer.
    7. Als er belletjes in de bufferspuiten verschijnen, ontgas dan door de spuit los te koppelen en de bel verticaal uit te werpen. Vervang de spuit en kalibreer opnieuw naar de nulpositie.
  2. Stel het FastHDX-prototype-instrument in voor HDX-experimenten.
    1. Voeg 500 uL gefilterde 5 μM aSyn toe aan een injectieflacon met totaal herstel en plaats in een tafelkoelkast om temperatuurgeïnduceerde oligomerisatie en aggregatie te voorkomen.
    2. Voeg 50 ml evenwichts-, etiketterings- en blusbuffers toe aan elke buffer (2. HDX-buffervoorbereidingsstappen 1-3) inlaat in de linker- en rechterkamer.
    3. Voeg 50 ml kolomwasbuffer toe (2. HDX-bufferbereiding stap 4) naar de pepsinewasinlaat.
    4. Om de eiwit- en kolomwaslijnen 1x te primen, controleert u zowel de linker- als de rechterspuiten op het tabblad Titrator Plumbing Delivery en klikt u eenmaal op Prime.
      OPMERKING: Elke volgende klik op Prime zal extra herhalingen van het prime-proces veroorzaken, wat resulteert in de consumptie van grote hoeveelheden eiwitmonster. Voorzichtigheid is geboden om dit te voorkomen, zelfs als er een vertraging in de software is nadat een klik op de knop is geprobeerd.
    5. Herhaal stap 4.1.5. 1x.
    6. Voer op het tabblad Handmatige quenchflow de vereiste instellingen in, die worden uitgelegd in de stappen 4.2.7.-4.2.10.
    7. Voor een tijdsverloopexperiment voert u de tijden in milliseconden in met de knop Symbolische stippen . Als replica's vereist zijn, voeg dan hetzelfde tijdspunt meerdere keren toe, bijvoorbeeld voor een drievoud van 50 ms moet 50 50 50 worden ingevoerd. De voorbeeldlijst in de massaspectrometersoftware (MassLynx wordt hier gebruikt, zie Tabel met materialen) moet precies overeenkomen met die tijdspunten.
      OPMERKING: De bestandsnamen en/of voorbeeldtekst van de massaspectrometer moeten worden gebruikt om te zorgen voor een permanente registratie van de HDX-labeltijden die overeenkomen met die welke zijn ingevoerd in de FastHDX-software-GUI. Labeltijden voor elke monsterrun worden nergens anders opgeslagen.
    8. Stel Traptijd (mins) in op de lengte van de overvultijd. Hier is het 3.00 uur.
    9. Wacht op HPLC (mins) = (traptijd + looptijd + 1,5 min) in.
      OPMERKING: Voor een experiment met 3 minuten overvullen en een verloop van 17 minuten is dit bijvoorbeeld 21,50 minuten.
    10. Klik alleen op het vak Leeg uitvoeren als u lege experimenten uitvoert tussen voorbeeldruns. Zo ja, zorg dan voor een vermelding (d.w.z. een geldige rij in de voorbeeldlijst) in de software voor de lege run na elke samplerun.
    11. Zodra de voorbeeldlijst klaar is op de software, markeert u de juiste vermeldingen en start u de uitvoering in de software door op de knop Afspelen en FastHDX in de software te klikken.
      OPMERKING: Vanwege waterstof / deuterium scrambling kunnen MS-only methoden of zachte fragmentatietechnieken (elektronenoverdracht dissociatie, elektronenvangst dissociatie en ultraviolette fotodissociatie) slechtsworden gebruikt 29. Voor aSyn bij een fysiologische pH van 7,40 zijn tijdspunten variërend van 50 ms tot 300 s het meest van toepassing, omdat deze de gehele deuteriumopnamecurve8 bestrijken.

5. Gegevensverwerking

  1. Laad het bestand met spectraal toegewezen peptiden uit de peptide mapping experimenten. Open het menu Bestand en klik op Openen in de DynamX-software (zie Materiaaltabel).
  2. Importeer RAW-bestanden in de gewenste massameetsoftware (bijv. DynamX, HDExaminer, enz.). Open het menu "Gegevens" en klik op MS Files. Klik op Nieuwe toestand om toestanden te maken voor elke bestudeerde eiwitconditie.
    1. Klik op Nieuwe belichting om elk HDX-tijdspunt toe te voegen. Klik op Nieuwe RAW om de .raw bestanden te importeren. Sleep elk .raw bestand naar de juiste positie. Klik op OK als u klaar bent.
  3. Wijs eerst automatisch isotopen toe (dit is automatisch volgens stap 5.2. hierboven) en beheer vervolgens handmatig de isotopische toewijzing om een hoge gegevenskwaliteit te garanderen.
  4. Exporteer de clustergegevens naar een .csv bestand met kolommen in de volgende volgorde: eiwitnaam, volgordestartnummer, volgeindnummer, volgorde, modificatie, fragment, maximaal mogelijke opname, massa van mono-isotopensoorten, staatsnaam, blootstellingstijd, bestandsnaam, lading, retentietijd, intensiteit en centroïde.
  5. Open het menu Gegevens in de software voor massameting en klik op Clustergegevens exporteren.

6. Data-analyse

  1. Laad de geëxporteerde clustergegevens in de gewenste HDX-analysesoftware. Hier wordt HDfleX gebruikt30 (zie Materiaaltabel).
  2. Pas de experimentele gegevens voor alle peptiden en toestanden aan en selecteer de juiste back-exchange correctiemethoden om waargenomen snelheidsconstanten voor de HDX-reactie te krijgen.
  3. Bereken een globale significantiedrempel met de voorkeursmethode (HDfleX ondersteunt hiervoor verschillende opties) en voer hybride significantietests uit om de significante verschillen tussen de staten te bepalen, vergelekenmet 31,32.
    OPMERKING: Als het waargenomen verschil groter is dan de globale drempel en de p-waarde lager is dan het gekozen betrouwbaarheidsniveau (bijv. 95%), wordt het verschil als significant beschouwd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Vanwege de intrinsiek ongeordende aard is het moeilijk om de ingewikkelde structurele veranderingen in aSyn bij fysiologische pH vast te leggen. HDX-MS bewaakt de isotopische uitwisseling bij backboneamidehydrogenen en onderzoekt de eiwitconformatiedynamiek en interacties. Het is een van de weinige technieken om deze informatie te verkrijgen met hoge structurele en temporele resoluties. Dit protocol is breed toepasbaar op een breed scala aan eiwitten en buffercondities, en dit wordt geïllustreerd door de meting van de ui...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit artikel worden de volgende procedures beschreven: (1) het uitvoeren van peptide mapping experimenten op monomere aSyn om de hoogste sequentiedekking te verkrijgen, (2) het verkrijgen van milliseconde HDX-MS gegevens op monomere aSyn onder fysiologische omstandigheden, en (3) het uitvoeren van data-analyse en interpretatie van de resulterende HDX-MS data. De verstrekte procedures zijn over het algemeen eenvoudig uit te voeren, elk labelexperiment duurt meestal slechts ongeveer 8 uur voor drie replicaties en acht ti...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Dankbetuigingen

NS wordt gefinancierd door de Universiteitsraad Diamond Jubilee Scholarship. JJP wordt ondersteund door een UKRI Future Leaders Fellowship [Subsidienummer: MR/T02223X/1].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column Waters Corporation186002346Analytical column
Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolvVWR20060.420Voor LC mobiele fasen
CaCl2Sigma AldrichC5670Zout voor HDX buffers
ChronosAxel Semrau (Koop bij Waters Corporation)667006090Planningssoftware om meerdere HDX-MS monsterinjecties automatisch mogelijk te maken. Alternatieve software is verkrijgbaar bij andere leveranciers, bijv. HDXDirector of LEAP Shell
Deuterium chlorideGoss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)DLM-2-50Voor HDX labelbuffers
Deuterium oxide (99.9% D2O)Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)DLM-4Gedeutereerd water
DynamX 3.0Waters Corporation176016027Isotooptoewijzing en berekening van deuteriumincorporatie
Enzymate BEH Pepsin ColumnWaters Corporation186007233Pepsine digestiekolom
Formic Acid, 99.0% LC/MS GradeFisher Scientific10596814Voor LC mobiele fasen
Guanidinium hydrochlorideSigma AldrichRDD001-500GChaotroop/Denaturant
HDfleXUniversity of ExeterN/Ahttps://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982
KClSigma AldrichP3911Zout voor HDX buffers
LEAP HDX-2 CTC PAL bemonsteringsrobotWaters Corporation725000637Autosampler robot
Leucine enkephalinWaters Corporation186006013Voor massaspectrometrie lockspray kalibratie.
MassLynxWaters Corporation667004007Software die de inlaatmethoden en het massaspectrometer bestuurt
Maximum recovery vialsWaters Corporation600000670CV100 pack inclusief doppen - gebruikt voor quench tray in LEAP HDX-2
MgCl2Sigma AldrichM8266Zout voor HDX buffers
Millipore 0.22 µm spuitfiltersMilliporeN9CA7069BSpuitfilters
ms2minApplied Photophysics LtdN/Afast-mix quench-flow millisecond hdx instrument
NaClSigma AldrichS9888Zout voor HDX buffers
Peltier temperatuurregelaarLEAP Technologies Inc.HP115-COOL/DPeltier controller om de nauwkeurige temperatuur van de kamers in de LEAP robot in te stellen.
ProteinLynx Global Server 3.0Waters Corporation715001030Peptide identificatie software. Alternatieve software is verkrijgbaar bij andere leveranciers.
Reagent pot capsWaters Corporation186004632100 pack
Reagent pots voor LEAP HDX-2Waters Corporation186001420100 pack exclusief doppen - gebruikt voor buffers in LEAP HDX-2
Sodium deuteroxide (99.5% in D2O)Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)DLM-57Voor HDX labelbuffers
Spin filter microcentrifugebuizen (3 kDa MWCO)Amicon (Merck Sigma Aldrich)UFC5003Micro centrifuge buizen om eiwitten te concentreren. Dit vergemakkelijkt bufferuitwisseling en nauwkeurige monsterlading voor HDX-MS experimenten.
Synapt G2-Si massaspectrometerWaters Corporation176850035Massaspectrometer
Total recovery vialsWaters Corporation600000671CV100 pack inclusief doppen - gebruikt voor labeltray in LEAP HDX-2
Tris-HClSigma AldrichT3253-250GBuffer
Trizma baseSigma AldrichT60040-B2005Buffer
UreaSigma AldrichU5378-1KGChaotroop/Denaturant
VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column Waters Corporation186004623Trap ontzouting kolom

Referenties

  1. Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson's disease, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
  2. Breydo, L., Wu, J. W., Uversky, V. N. α-Synuclein misfolding and Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta (BBA): Molecular Basis of Disease. 1822 (2), 261-285 (2012).
  3. Dedmon, M. M., Lindorff-Larsen, K., Christodoulou, J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. Mapping long-range interactions in α-synuclein using spin-label NMR and ensemble molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 127 (2), 476-477 (2005).
  4. Esteban-Martín, S., Silvestre-Ryan, J., Bertoncini, C. W., Salvatella, X. Identification of fibril-like tertiary contacts in soluble monomeric α-synuclein. Biophysical Journal. 105 (5), 1192-1198 (2013).
  5. McClendon, S., Rospigliosi, C. C., Eliezer, D. Charge neutralization and collapse of the C-terminal tail of alpha-synuclein at low pH. Protein Science. 18 (7), 1531-1540 (2009).
  6. Ranjan, P., Kumar, A. Perturbation in long-range contacts modulates the kinetics of amyloid formation in α-synuclein familial mutants. ACS Chemical Neuroscience. 8 (10), 2235-2246 (2017).
  7. Villar-Piqué, A., da Fonseca, T. L., Outeiro, T. F. Structure, function and toxicity of alpha-synuclein: the Bermuda triangle in synucleinopathies. Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 1 240-255 (2015).
  8. Seetaloo, N., Zacharopoulou, M., Stephens, A. D., Schierle, G. S. K., Phillips, J. J. Local structural dynamics of alpha-synuclein correlate with aggregation in different physiological conditions. bioRxiv. , (2022).
  9. Stephens, A. D., et al. Extent of N-terminus exposure of monomeric alpha-synuclein determines its aggregation propensity. Nature Communications. 11 (1), 2820(2020).
  10. Stephens, A. D., et al. Different structural conformers of monomeric α-synuclein identified after lyophilizing and freezing. Analytical Chemistry. 90 (11), 6975-6983 (2018).
  11. Lautenschläger, J., et al. C-terminal calcium binding of α-synuclein modulates synaptic vesicle interaction. Nature Communications. 9 (1), 712(2018).
  12. Oganesyan, I., Lento, C., Tandon, A., Wilson, D. J. Conformational dynamics of α-synuclein during the interaction with phospholipid nanodiscs by millisecond hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (5), 1169-1179 (2021).
  13. Keppel, T. R., Weis, D. D. Analysis of disordered proteins using a simple apparatus for millisecond quench-flow H/D exchange. Analytical Chemistry. 85 (10), 5161-5168 (2013).
  14. Al-Naqshabandi, M. A., Weis, D. D. Quantifying protection in disordered proteins using millisecond hydrogen exchange-mass spectrometry and peptic reference peptides. Biochemistry. 56 (31), 4064-4072 (2017).
  15. Kish, M., et al. Allosteric regulation of glycogen phosphorylase solution phase structural dynamics at high spatial resolution. bioRxiv. , (2019).
  16. El-Amine, M., et al. Mechanisms of tolerance induction by a gene-transferred peptide-IgG fusion protein expressed in B lineage cells. Journal of Immunology. 165 (10), 5631-5636 (2000).
  17. Kishimoto, S., et al. Site-specific chemical conjugation of antibodies by using affinity peptide for the development of therapeutic antibody format. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 698-702 (2019).
  18. Xu, W., et al. A protein-based, long-acting HIV-1 fusion inhibitor with an improved pharmacokinetic profile. Pharmaceuticals. 15 (4), 424(2022).
  19. Frías, J. P., et al. Tirzepatide versus semaglutide once weekly in patients with type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (6), 503-515 (2021).
  20. Gerstein, H. C., et al. Cardiovascular and renal outcomes with efpeglenatide in type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (10), 896-907 (2021).
  21. Largy, E., Gabelica, V. Native hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry of structured DNA oligonucleotides. Analytical Chemistry. 92 (6), 4402-4410 (2020).
  22. Marcsisin, S. R., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry: What is it and what can it tell us. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (3), 967-972 (2010).
  23. Glasoe, P. K., Long, F. A. Use of glass electrodes to measure acidities in deuterium oxide. Journal of Physical Chemistry. 64 (1), 188-190 (1960).
  24. Krȩzel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
  25. Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S., Popp, J. The Bouguer-Beer-Lambert law: Shining light on the obscure. ChemPhysChem. 21 (18), 2029-2046 (2020).
  26. Gasteiger, E., et al. The Proteomics Protocols Handbook. , Springer. New York. 571-607 (2005).
  27. Bateman, R. H., et al. A novel precursor ion discovery method on a hybrid quadrupole orthogonal acceleration time-of-flight (Q-TOF) mass spectrometer for studying protein phosphorylation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 13 (7), 792-803 (2002).
  28. Sørensen, L., Salbo, R. Optimized workflow for selecting peptides for HDX-MS data analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (11), 2278-2281 (2018).
  29. Demmers, J. A. A., Rijkers, D. T. S., Haverkamp, J., Killian, J. A., Heck, A. J. R. Factors affecting gas-phase deuterium scrambling in peptide ions and their implications for protein structure determination. Journal of the American Chemical Society. 124 (37), 11191-11198 (2002).
  30. Seetaloo, N., Kish, M., Phillips, J. J. HDfleX: Software for flexible high structural resolution of hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry data. Analytical Chemistry. 94 (11), 4557-4564 (2022).
  31. Hageman, T. S., Weis, D. D. Reliable identification of significant differences in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements using a hybrid significance testing approach. Analytical Chemistry. 91 (13), 8008-8016 (2019).
  32. Hageman, T. S., Weis, D. D. A structural variant approach for establishing a detection limit in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements. Analytical Chemistry. 91 (13), 8017-8024 (2019).
  33. Chetty, P. S., et al. Helical structure and stability in human apolipoprotein A-I by hydrogen exchange and mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19005-19010 (2009).
  34. Keppel, T. R., Weis, D. D. Mapping residual structure in intrinsically disordered proteins at residue resolution using millisecond hydrogen/deuterium exchange and residue averaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 547-554 (2015).
  35. Li, J., Rodnin, M. V., Ladokhin, A. S., Gross, M. L. Hydrogen-deuterium exchange and mass spectrometry reveal the pH-dependent conformational changes of diphtheria toxin T domain. Biochemistry. 53 (43), 6849-6856 (2014).
  36. Roder, H., Elöve, G. A., Englander, S. W. Structural characterization of folding intermediates in cytochrome c by H-exchange labelling and proton NMR. Nature. 335 (6192), 700-704 (1988).
  37. Rob, T., et al. Measuring dynamics in weakly structured regions of proteins using microfluidics-enabled subsecond H/D exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (8), 3771-3779 (2012).
  38. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13 (13), 2528-2532 (2013).
  39. Svejdal, R. R., Dickinson, E. R., Sticker, D., Kutter, J. P., Rand, K. D. Thiol-ene microfluidic chip for performing hydrogen/deuterium exchange of proteins at subsecond time scales. Analytical Chemistry. 91 (2), 1309-1317 (2018).
  40. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  41. Coales, S. J., E, S. Y., Lee, J. E., Ma, A., Morrow, J. A., Hamuro, Y. Expansion of time window for mass spectrometric measurement of amide hydrogen/deuterium exchange reactions. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (24), 3585-3592 (2010).
  42. Hoyer, W., et al. Dependence of alpha-synuclein aggregate morphology on solution conditions. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 383-393 (2002).
  43. Rand, K. D., Pringle, S. D., Morris, M., Engen, J. R., Brown, J. M. ETD in a traveling wave ion guide at tuned Z-spray ion source conditions allows for site-specific hydrogen/deuterium exchange measurements. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22 (10), 1784-1793 (2011).
  44. Kan, Z. Y., Ye, X., Skinner, J. J., Mayne, L., Englander, S. W. ExMS2: An integrated solution for hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry data analysis. Analytical Chemistry. 91 (11), 7474-7481 (2019).
  45. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Characterizing short-lived protein folding intermediates by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (20), 8591-8597 (2010).
  46. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  47. Mistarz, U. H., et al. Photodissociation mass spectrometry accurately localizes sites of backbone deuteration in peptides. Analytical Chemistry. 90 (2), 1077-1080 (2017).
  48. Phillips, J. J., et al. Rate of asparagine deamidation in a monoclonal antibody correlating with hydrogen exchange rate at adjacent downstream residues. Analytical Chemistry. 89 (4), 2361-2368 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Intrinsiek ongeordende eiwittenpeptide mappingeiwitaggregatieconformationele dynamiekdeuteriumopnametoetsing van statistische significantie

Gerelateerde artikelen