DiI-kleurstofvulling als een eenvoudig en goedkoop hulpmiddel om trillingssensorische neuronen in C. elegans te visualiseren

Samenvatting

DiI-kleurstofvulling is een methode die vaak wordt gebruikt in C. elegans om een subset van de trilhaarvormige sensorische neuronen te visualiseren, waardoor genetische mutaties kunnen worden geïdentificeerd die de structuur of functie van sensorische neuronen veranderen.

Samenvatting

C. elegans wordt al lang gebruikt als een eenvoudig en toegankelijk model om de neuronale structuur en de vele functies van het zenuwstelsel te bestuderen. Van de 302 neuronen in het volwassen hermafrodiete zenuwstelsel zijn er 60 geclassificeerd als trilhaarsensorische neuronen. Deze neuronen staan centraal in een aantal gedragingen van C. elegans , inclusief maar niet beperkt tot chemo-, mechano- en osmosensing, mannelijke paring en dauervorming. Al tientallen jaren gebruiken leden van de C. elegans-gemeenschap de rode fluorescerende lipofiele kleurstof DiI om een subset van de trilhaarsensorische neuronen te visualiseren die direct worden blootgesteld aan de externe omgeving. Deze kleurstof komt de trilhaaruiteinden van de neuronen binnen en verspreidt zich in een relatief uniform patroon door de dendrieten, cellichamen en axonen. Deze eenvoudige en krachtige methode is een uitstekend hulpmiddel om genetische mutanten te identificeren die structurele of functionele defecten veroorzaken in trilhaarsensorische neuronen. Hier presenteren we een gestroomlijnde versie van deze kleuringsmethode om de acht paren amphid- en twee paren phasmide-neuronen te visualiseren die in het milieu worden blootgesteld in C. elegans. We bespreken tips voor het gebruik van deze goedkope methode voor het in beeld brengen van cellulaire kleurstofvulpatronen bij verdoofde dieren.

Inleiding

Caenorhabditis elegans (C. elegans) zijn gemakkelijk te manipuleren, hebben snelle generatietijden en zijn goedkoop in onderhoud. Vanwege deze en vele andere voordelen heeft C. elegans gediend als een geprefereerd modelorganisme voor het bestuderen van vele biologische processen, met name de ontwikkeling en functie van het zenuwstelsel. Een heel nummer in het Journal of Neurogenetics was onlangs gewijd aan de historische effecten van onderzoek naar dit specifieke onderwerp¹. Ze zijn vooral gunstig voor het bestuderen van de functie van primaire trilharen, die betrokken zijn bij het waarnemen van chemische en fysische omgevingscondities².

Volwassen hermafrodiete C. elegans hebben in totaal 302 neuronen, waarvan er 60 primaire trilharen bezitten aan het einde van hun dendritische processen³. Deze 60 trilhaarneuronen zijn geclassificeerd als sensorische neuronen en zijn betrokken bij veel C. elegans-gedragingen, inclusief maar niet beperkt tot chemo-, mechano- en osmosensing, mannelijke paring en dauervorming ^3,4. Er zijn twee subsets van trilhaarvormige sensorische neuronen die worden blootgesteld aan de externe omgeving, waaronder zestien amphide neuronen (8 paar) in het hoofd en vier fasmide-neuronen (2 paar) in de staart ^3,5.

Al tientallen jaren gebruiken onderzoekers in de C. elegans-gemeenschap lipofiele kleurstoffen, zoals het rood fluorescerende 1,1'-dioctadecyl-3,3,3'-tetramethylindocarbocyanineperchloraat (DiI), om een aantal verschillende weefsels in levende dieren te visualiseren 6,7,8,9. Wanneer dieren worden blootgesteld aan DiI, intercaleert de kleurstof gemakkelijk en snel in het membraan van de dendrieten, axonen en cellichamen van de 20 extern blootgestelde amfid- en fasmideneuronen in een relatief uniforme verdeling. Wanneer wildtype dieren worden blootgesteld aan DiI, kan de kleurstof in deze neuronen worden gevisualiseerd door middel van fluorescerende beeldvorming gedurende een relatief breed tijdsbestek. Als er morfologische of functionele afwijkingen zijn in de primaire trilharen, kan het zijn dat de kleurstof de neuronen niet goed vult, en daarom kan een signaal in sommige of alle cellen zwakker lijken of volledig afwezig zijn 6,7,10,11. Elk van deze uitkomsten kan informatief zijn over structurele of functionele tekorten die aanwezig kunnen zijn in de trilhaarsensorische neuronen van genetische varianten.

Dit manuscript heeft tot doel het gemak aan te tonen waarmee kleurstofvulling kan worden gebruikt in C. elegans om de structuur van trilhaarsensorische neuronen te visualiseren (Figuur 1). We hebben deze techniek toegepast bij wildtype en gemuteerde dieren om aan te tonen hoe verschillende genetische achtergronden een verscheidenheid aan kleurstofvullende resultaten kunnen laten zien, vaak gerelateerd aan de structurele of functionele integriteit van hun trilhaarvormige sensorische neuronen. We tonen kleuring 30 min, 24 uur en 48 uur na het afvullen van de kleurstof in verschillende leeftijden van dieren om te helpen bij het bepalen van het optimale tijdsverloop voor live beeldvorming. We geven ook voorbeelden van moeilijkheden die zich kunnen voordoen tijdens kleuring en beeldvorming en tips om deze probleempunten te vermijden. Door het gebruik van deze methode kunnen onderzoekers van instellingen van elke omvang beginnen voort te bouwen op de basis van de biologie van trilhaarsensorische neuronen in C. elegans. Het vullen van kleurstoffen is eenvoudig en kosteneffectief genoeg om te worden opgenomen in laboratoriumactiviteiten met studenten om hen de kans te geven om te werken met C. elegans en fluorescentiemicroscopie met minimale voorafgaande technische expertise. Bovendien is er een aanzienlijke conservering van genen die betrokken zijn bij de biologie van primaire cilia en, meer in het algemeen, de sensorische neuronfunctie tussen mensen en C. elegans¹². Voortgezet onderzoek naar ciliaire genfuncties en genetische interacties in C. elegans zou uiteindelijk meer inzicht kunnen geven in de complexiteit van menselijke ciliopathieën¹³.

Protocol

1. Bereiding van oplossingen

1. Bereid de bleekoplossing voor. Combineer 2 ml bleekmiddel, 500 μl 10 M NaOH en 7,5 ml dH₂O in een centrifugebuis van 15 ml.
   OPMERKING: Bleekoplossing blijft tot 1 week stabiel wanneer het bij kamertemperatuur (RT) wordt bewaard.
2. Bereid de M9-buffer voor. Combineer 3 g KH₂PO₄, 6 g Na₂HPO₄ en 5 g NaCl in 1 l steriel water en autoclaaf om te steriliseren. Zodra het volledig is afgekoeld tot RT, voegt u 1 ml steriel 1 M MgSO₄ toe.
3. Bereid de DiI-voorraadoplossing voor. Voeg 10 mg DiI toe aan 5 ml dimethylformamide (DMF) voor een uiteindelijke concentratie van 2 mg/ml DiI in DMF. DiI is lichtgevoelig, dus dek de oplossingen altijd af met aluminiumfolie. DiI in DMF kan vele jaren bij -20 °C worden bewaard en hoeft niet tussen gebruik te worden ontdooid.
   LET OP: DMF is zowel ontvlambaar als schadelijk bij contact met de huid of bij inademing. Werk met deze oplossing onder een chemische kap, uit de buurt van open vuur en draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM).

2. Isolatie van gesynchroniseerde populaties door bleekpreparaat

NOTITIE: Verzamel alle apparatuur en oplossingen die nodig zijn voor alle stappen van het proces voordat u begint. Bleekpreparaten zijn erg tijdgevoelig, dus het hebben van de benodigde materialen voordat het proces begint, zorgt voor protocolsucces.

1. Was niet-uitgehongerde, drachtige volwassen dieren van borden met 1 ml M9-buffer. Laat de dieren zich aan één rand van de plaat verzamelen door de plaat iets te kantelen.
   OPMERKING: Probeer meestal ~50-100 niet-uitgehongerde, drachtige volwassen dieren te verzamelen voor een betrouwbare opbrengst van eieren. Het bleekpreparaat kan echter worden uitgevoerd op bijna elk aantal drachtige volwassen dieren. Het aantal drachtige volwassen dieren dat kan worden verzameld, kan sterk variëren, afhankelijk van de genetische achtergrond van de dieren. Een groter aantal verzamelde dieren levert meestal een groter aantal eieren op.
2. Gebruik een glazen pasteurpipet om de dieren in de M9-buffer te verzamelen en over te brengen naar een gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 ml.
3. Centrifugeer de dieren bij 350 g gedurende 30 s. Deze snelheid is laag genoeg om de levende dieren op de bodem van de buis te verzamelen zonder schade aan te richten.
4. Decanteer het grootste deel van de overtollige M9-buffer en laat de verzamelde wormen op de bodem van de buis ongestoord.
5. Voeg 1 ml van de bereide bleekoplossing toe en laat de dieren in de oplossing drijven totdat ze beginnen te desintegreren, waarbij u de tube regelmatig omkeert om weefselafbraak te bevorderen. Bekijk de weefselafbraak en het vrijkomen van eieren door de buis periodiek te controleren onder een ontleedmicroscoop. Dit proces duurt meestal tussen de 5 minuten en 10 minuten.
6. Zodra de buis voornamelijk vrijgelaten eieren bevat en er nog maar een paar zichtbare dierlijke weefsels over zijn, centrifugeert u op maximale snelheid voor een standaard tabletop-microcentrifuge (meestal tussen 15.000-21.000 g) gedurende 30 s om de eieren op de bodem te verzamelen.
7. Decanteer zoveel mogelijk van de bleekoplossing met behulp van een glazen pipet en zorg ervoor dat u de gepelleteerde eieren niet verstoort. Voeg 1 ml M9-buffer toe om de afbraak van de eieren door de resterende bleekoplossing te stoppen.
   OPMERKING: Stap 2.6 en 2.7 moeten snel worden uitgevoerd. Vertragingen bij het centrifugeren, het verwijderen van de bleekoplossing en het wassen met M9-buffer kunnen leiden tot een lage eieropbrengst als gevolg van degradatie.
8. Centrifugeer de buis opnieuw bij 21.000 g gedurende 30 s. Decanteer het bovenstaande zonder de gepelleteerde eieren te verstoren.
9. Was nog twee keer met 1 ml M9-buffer en decanteer vloeistof tussen elke wasbeurt zonder de gepelleteerde eieren te verstoren.
10. Decanteer na de laatste wasbeurt het grootste deel van de M9-buffer en suspendeer de eieren vervolgens opnieuw in de resterende vloeistof door de buis af te likken of krachtig te schudden.
11. Breng met behulp van een steriele glazen pipet een druppel van de oplossing met de eieren over op het oppervlak van een verse NGM-plaat met E. coli. Probeer de druppel naast de E. coli te plaatsen en voeg ongeveer 100 eieren per bord toe. Deze eieren zijn ongeveer gesynchroniseerd in leeftijd.
    OPMERKING: In gevallen waarin de eiopbrengst zo hoog is dat het moeilijk is om 100 eieren per druppel te verkrijgen, kan extra M9-buffer worden toegevoegd aan de buis met eieren om hun concentratie te verdunnen.

3. Procedure voor het vullen van kleurstoffen

1. Label zoveel microcentrifugebuisjes van 1,5 ml als nodig is voor het aantal stammen dat met kleurstof wordt gevuld. Maak folieafdekkingen voor elke buis om lichtgevoelige DiI-oplossing te beschermen, zodra deze is toegevoegd.
2. Was dieren in een gewenst ontwikkelingsstadium van de leeftijdsgesynchroniseerde NGM-platen met ongeveer 1 ml M9-buffer. Zorg ervoor dat elke plaat ongeveer 100 dieren bevat die zijn uitgekomen uit de 100 eieren die tijdens de bleeksynchronisatie op de plaat zijn geplaatst. Verzamel de dieren in de correct geëtiketteerde microcentrifugebuisjes van 1,5 ml.
   OPMERKING: Kleurstofvulling werkt goed in een breed scala aan ontwikkelingsstadia. Deze studie toont het vullen van kleurstoffen aan bij dieren variërend van larvale fase 3 (L3) tot volwassenen (48 uur na L3).
3. Centrifugeer dieren bij 350 g gedurende 30 s om ze op de bodem van de buis te verzamelen.
4. Decanteer de M9-buffer zonder de dieren te storen die op de bodem van de buis zijn verzameld.
5. Was nog twee keer met 1 ml M9-buffer en decanteervloeistof tussen elke wasbeurt zonder de verzamelde dieren te storen. Decanteer tijdens de laatste wasronde om 200 μL M9-buffer in de tube over te laten.
6. Bedek alle buisjes met aluminiumfolie ter bescherming tegen blootstelling aan licht en voeg 1 μL DiI in DMF rechtstreeks toe aan de M9-buffer in elke buis.
   OPMERKING: Als u de hoeveelheden M9-buffer en DiI wijzigt, zorg er dan voor dat u een verhouding van 1:200 DiI in de M9-buffer aanhoudt.
7. Schud of schud alle buizen op RT gedurende 2 uur.
8. Centrifugebuisjes van 350 g gedurende 30 s om dieren op de bodem van de buisjes te verzamelen.
9. Decanteer de vloeistof met de DiI uit de microcentrifugebuisjes. Was drie keer met M9-buffer en decanteer vloeistof tussen elke wasbeurt.
10. Na het decanteren van de laatste wasbeurt, breng de dieren in een klein (~50 μL) volume M9-buffer over naar verse NGM-platen met E. coli.
11. Laat de dieren herstellen na het kleuren op verse NGM-platen gedurende ten minste 30 minuten. Dek de platen af met aluminiumfolie tot observatie om de DiI-vlek te behouden. Observeer dieren tot 24 uur na het vullen van de kleurstof zonder noemenswaardig verlies van fluorescerend signaal. Op of na 48 uur kan het signaal beginnen te vervagen (zie figuur 2).

4. Kleurstofvulling voor beeldvorming

1. Bereid een agarose van 2% in een steriele wateroplossing. Los de agarose volledig op met behulp van een magnetron.
   OPMERKING: Agarose (2%) in wateroplossing kan meerdere keren worden hergebruikt totdat herhaald waterverlies de agaroseconcentratie verhoogt tot een punt waarop de oplossing te stroperig wordt.
2. Verkrijg glazen objectglaasjes en dekglaasjes van 22 mm x 22 mm om agarosepads voor te bereiden. Doe met behulp van een glazen pipet een kleine druppel van de gesmolten 2% agarose in water op een glaasje en plaats snel een dekglaasje op de agarosedruppel. Zodra het agarosepad volledig is gestold, verwijdert u het dekglaasje en laat u het agarosepad op het glasplaatje zitten.
   OPMERKING: Vermijd de vorming van luchtbellen in agarosepads, omdat deze de beeldvorming van dieren kunnen belemmeren.
3. Voeg 5-10 μL verdovingsmiddel (10 mM levamisol) toe aan het oppervlak van het agarosepad. Breng 5-20 dieren over naar de verdoving en plaats vervolgens het dekglaasje terug op het agarosepad.
4. Observeer dieren met behulp van een stereo-, samengestelde en/of confocale fluorescentiemicroscoop, afhankelijk van de beschikbare apparatuur en de behoeften op het gebied van screening en beeldvorming. DiI heeft een excitatiepiek bij 550 nm en een emissiepiek bij 564 nm; bekijk het dus met behulp van een tetramethylrhodamine/cyanine kleurstof 3/geel fluorescerend eiwit (TRITC/Cy3/YFP)-compatibele filterkubus.
   OPMERKING: De juiste microscoopinstellingen, zoals belichtingstijd, versterking en laservermogen, die nodig zijn om duidelijke beelden van kleurstofvulling te verkrijgen, kunnen variëren tussen verschillende soorten microscopen en moeten onafhankelijk worden bepaald door gebruikers voor hun unieke behoeften.

Resultaten

Volwassen N2-wormen die 24 uur na het vullen van de kleurstof worden afgebeeld, vertonen een duidelijk fluorescerend signaal dat relatief gelijkmatig over de geamafficheerde neuronen (Figuur 1A,A') en fasmideneuronen (Figuur 1D,D') is verspreid. Bij deze dieren zijn de dendritische uitsteeksels en cellichamen van de geamphide neuronen gemakkelijk te onderscheide...

Discussie

xSuccesvolle kleurstofvulling is afhankelijk van een zorgvuldige afweging van het ontwikkelingsstadium en de genetische achtergrond van de dieren, evenals de verstreken tijd tot de beeldvorming. Sommige genetische mutaties verstoren de structuur en/of functie van de extern blootgestelde trilhaarsensorische neuronen, wat resulteert in dieren die niet in staat zijn om de vulling goed te verven. Daarom kan het vullen van de kleurstof van nieuwe C. elegans-mutanten worden gebruikt a...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DiI	Biotium	60010	Niet oplosbaar in water, maak 2 mg/mL oplossing in DMF. Oplossing is lichtgevoelig, bedek met folie. Bewaar bij -20 °C. Oplossing goed voor vele jaren.
Levamisolhydrochloride	Fisher	AC187870100	10 mM oplossing in M9 Buffer. Bewaar bij -20 °C. Oplossing goed voor vele jaren.
M9 Buffer	IPM Scientific	11006-517	Beschikbaar voor aankoop, maar ook gemakkelijk in huis te maken volgens recept in protocol.
N2 (C. elegans stam)	CGC	N2	C. elegans wilde isolaat
YH2125 (C. elegans stam)	n/a	n/a	Stam gegenereerd in Yoder Laboratorium (Bentley-Ford et al, 2021)