Methodenartikel

Het meten van Caenorhabditis elegans Gevoeligheid voor de Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

5.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64056

⸱

7 juni 2022

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Delaware

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft een test om de respons op levamisol te bepalen, een farmacologische agonist van één klasse caenorhabditis elegans acetylcholinereceptoren. In deze vloeibare levamisol-zwemtest observeren en kwantificeren onderzoekers visueel de tijdsafhankelijke verlamming van dieren die in 24-well-platen worden gekweekt.

Samenvatting

Op de neuromusculaire overgang (NMJ) leidt de binding van de exciterende neurotransmitter acetylcholine (ACh) aan postsynaptische receptoren tot spiercontractie. Net als bij gewervelde skeletspieren is cholinerge signalering in de lichaamswandspieren van het modelorganisme Caenorhabditis elegans vereist voor voortbeweging. Blootstelling aan levamisol, een farmacologische agonist van één klasse ACh-receptoren op de lichaamswandspieren, veroorzaakt tijdsafhankelijke verlamming van wilde dieren. Veranderde gevoeligheid voor levamisol suggereert defecten in signalering bij de NMJ of spierfunctie. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een vloeibare levamisoltest uitgevoerd op C. elegans gekweekt in 24-well platen. Krachtig zwemmen van de dieren in vloeistof maakt de beoordeling en kwantificering van door levamisol geïnduceerde verlamming in honderden wormen gedurende een periode van een uur mogelijk zonder fysieke manipulatie. Deze procedure kan worden gebruikt met zowel wild-type als mutanten die de gevoeligheid voor levamisol hebben veranderd om de functionele gevolgen van veranderde signalering bij de NMJ aan te tonen.

Inleiding

Activering van postsynaptische acetylcholinereceptoren (AChRs) op skeletspieren resulteert in een elektrisch signaal dat leidt tot spiercontractie. Verstoring van de neuromusculaire functie resulteert in myasthenische syndromen en spierdystrofieën bij de mens 1,2,3,4. De nematode Caenorhabditis elegans is uitgebreid gebruikt om meer te weten te komen over evolutionair geconserveerde fundamentele biologische processen en mechanismen van ziekte. Gewervelde skeletspieren en C. elegans lichaamswandspieren zijn functioneel gelijkwaardig in de controle van voortbeweging5. Hier wordt een eenvoudige test gepresenteerd die kan worden gebruikt om wild-type C. elegans te vergelijken met mutanten die neuromusculaire signalering of spierfunctie hebben veranderd.

Exciterende en remmende inputs ontvangen van respectievelijk cholinerge en GABAerge motorneuronen zorgen ervoor dat spieren aan de ene kant van het C. elegans-lichaam samentrekken terwijl de spieren aan de andere kant ontspannen, waardoor gecoördineerde voortbewegingmogelijk is 6. Levamisol, een anthelminticum dat wordt gebruikt om parasitaire nematodeninfecties te behandelen, bindt aan en activeert constitutief één klasse AChRs op de lichaamswandspieren, wat resulteert in tijdsafhankelijke verlamming7. Zo kan veranderde gevoeligheid voor levamisol worden gebruikt om C. elegans te identificeren met defecten in de balans van exciterende en remmende signalering 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Mutaties in subeenheden van de levamisolgevoelige AChR (L-AChR), zoals UNC-63, evenals de C. elegans-homoloog van Cubilin, LEV-10, die nodig is voor L-AChR-clustering bij de synaps, beïnvloeden bijvoorbeeld exciterende signalering en resulteren in levamisolresistentie 7,8. Mutaties in de GABAA-receptor UNC-49 verminderen remmende signalering en veroorzaken overgevoeligheid voor levamisol12.

Overgevoeligheid of resistentie tegen levamisol is traditioneel beoordeeld door dieren over te brengen naar agarplaten die levamisol bevatten en vervolgens regelmatig de wormen te porren om het tijdstip te bepalen waarop verlamming optreedt 13,14,15. We hebben een vloeibare levamisol zwemtest ontwikkeld die de noodzaak van fysieke manipulatie van de dieren elimineert en de screening van honderden dieren in slechts 1 uur mogelijk maakt. Hier wordt het gebruik van deze test met wild-type, unc-63 (x26), lev-10 (x17) en unc-49 (e407) dieren beschreven. Dit protocol kan echter ook worden uitgevoerd op C. elegans blootgesteld aan RNAi, zoals werd gedaan om knockdowns geïdentificeerd in een genoombreed RNAi-scherm te valideren voor veranderde levamisolgevoeligheid11.

Voor deze farmacologische test werden wormen tot volwassenheid gekweekt in 24-well platen, 0,4 mM levamisol in M9-buffer werd toegevoegd aan elke put en het aantal bewegende dieren werd elke 5 minuten gedurende 1 uur geregistreerd. Levamisol-geïnduceerde verlamming werd visueel waargenomen in de loop van de tijd, en na de voltooiing van de test werden de gegevens gekwantificeerd. De evaluatie van mutanten samen met wild-type C. elegans stelt studenten in staat om eerst voorspellingen te doen over mogelijke fenotypische effecten en vervolgens experimenten uit te voeren om hun hypothesen te testen. Kortom, deze eenvoudige, goedkope, vloeibare levamisoltest is een ideale manier om de impact van het verlies van specifieke genen op de NMJ-functie aan te tonen.

Protocol

1. Bereiding van platen voor de levamisoltest

  1. Bereid nematodengroeimedium (NGM) media door 3 g NaCl, 2,5 g pepton en 17 g agar te combineren met 1 l gedeïoniseerd (DI) water in een kolf met een roerstaaf.
  2. Leg na het autoclaveren de media op een hete plaat op 70 °C en roer gedurende 1 uur met een gematigde snelheid.
  3. Voeg 1 ml 5 mg / ml cholesterol druppelsgewijs toe om neerslag te voorkomen, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4 en 25 ml 1 M pH 6,0 kaliumfosfaatbuffer aan de media.
  4. Breng 2 ml NGM-media over in elke put van een 24-wellsplaat met een steriele serologische pipet (figuur 1).
  5. Laat de platen 2 dagen drogen op de benchtop voordat je ze inzaait met bacteriën. Voor langere opslag, plaats ze op 4 °C.
  6. Strooi OP50 E. coli uit op een lysogeny bouillon (LB) plaat en groei 's nachts bij 37 °C.
  7. Kies een enkele OP50-kolonie in B-bouillon (10 g trypton en 5 g NaCl in 1 L DI H2O) en zet de cultuur 's nachts op 37 °C.
  8. Laat met behulp van een steriele pipet 30 μL OP50-suspensie op de agar in het midden van elke put vallen (figuur 1).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u het agaroppervlak niet beschadigt, omdat dit zal leiden tot het graven van wormen.
  9. Laat de platen na het zaaien minstens 2 dagen op kamertemperatuur staan om een bacterieel gazon te laten ontstaan.
    OPMERKING: Als de bacteriën in de middelste putten na 2 dagen niet droog zijn, laat de platen dan 20 minuten open in de kap (figuur 1). De platen moeten 1-2 weken voor de test worden gegoten en bezaaid met bacteriën.

2. Synchroniseren van C. elegans (dag 1)

  1. Kweek wild-type, unc-63(x26), lev-10(x17), en unc-49(e407) C. elegans tot volwassenheid op platen van 6 cm, waarbij ten minste acht platen per stam worden bereid. Bevestig dat er veel niet-uitgehongerde gravid volwassenen op de borden staan.
    OPMERKING: Dit is twee keer zoveel platen als nodig is; het is echter belangrijk om back-upplaten te hebben voor het geval de eerste partij eieren tijdens het bleken wordt vernietigd.
  2. Maak 10x M9 buffer door 59,6 g Na2HPO4 (dibasisch), 29,9 g KH2PO4 (monobasisch), 12,8 g NaCl en 2,5 g MgSO4 in 750 ml DI-water met roeren op te lossen. Eenmaal opgelost, breng het volume op 1 L en filter steriliseer. Verdun 1:10 en autoclaaf om 1x M9 buffer te maken.
    LET OP: De 1x M9 buffer kan weken of maanden van tevoren gemaakt worden.
  3. Bereid bleekoplossing onder de motorkap voor op de dag van synchronisatie. Meng 10 ml bleekmiddel (tabel met materialen), 2,5 ml 10 N NaOH en 37,5 ml DI-water in een conische buis van 50 ml. Draag een bril, handschoenen en een laboratoriumjas wanneer u met de bleekoplossing werkt.
  4. Was met behulp van een plastic transferpipet gravid volwassen wormen van ten minste vier platen met 1x M9-buffer en breng ze over in een conische buis van 15 ml.
  5. Draai op 716 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en verwijder vervolgens het supernatant met behulp van een transferpipet.
  6. Voeg 10 ml van de bleekoplossing toe. Keer de buis om of schud voorzichtig gedurende ~ 4 minuten totdat de meeste, maar niet alle, van de wormkarkassen zijn opgelost (figuur 1).
    OPMERKING: Pas op dat u de wormen niet te veel bleekt, omdat dit de eieren zal vernietigen. Bepaalde mutaties kunnen de moeilijkheid van ei-isolatie verhogen.
  7. Draai op 716 x g gedurende 1 min.
  8. Giet de bleekoplossing in één beweging af; zolang de buis op dit punt niet wordt geschud, blijven de eieren aan de zijkant van de buis plakken.
  9. Voeg 15 ml 1x M9 buffer toe en keer om. Draai op 716 x g gedurende 1 min en giet de M9-buffer in één vloeiende beweging af.
  10. Voer in totaal drie wasbeurten uit met 1x M9 buffer, zoals beschreven in stap 2.9.
  11. Voeg na de laatste wasbeurt 10 ml verse 1x M9 toe en plaats deze een nacht op een rotator bij 15 °C om een gesynchroniseerde populatie uitgehongerde eerste larvale (L1) stadiumdieren te isoleren.
    OPMERKING: Controleer voordat u de rotator plaatst of er eieren in de M9-buffer zitten. Zo niet, herhaal dan de voorbereiding met reserveplaten en bleekmiddel voor een kortere tijd.

3. Plating gesynchroniseerde C. elegans (dag 2)

  1. Print een plaatkaart met 24 putten uit en wijs stammen toe aan gerandomiseerde plaatsen. Elke stam moet minstens zes keer in de 24-wellsplaat worden weergegeven.
  2. Ongeveer 24 uur na de bleekvoorbereiding, spin-down uitgehongerde L1-wormen in M9-buffer bij 716 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
  3. Verwijder ~ 9 ml M9-buffer met een plastic transferpipet en meng vervolgens voorzichtig de uitgehongerde wormen in het eerste larvale stadium (L1's) in de resterende M9-buffer.
  4. Pipetteer onmiddellijk 3 μL van de wormen in M9-buffer op een microscoopglaasje en bepaal het aantal L1's; het gewenste aantal is 20-30 L1s in 3 μL. Draai af en verwijder M9 als de wormconcentratie te laag is en voeg M9 toe als de concentratie te hoog is.
    OPMERKING: Controleer het aantal wormen per 3 μL ten minste 2x, waarbij u de buis elke keer omkeert.
  5. Pipetteer 3 μL L1s (20-30 wormen totaal) in elke put volgens de vooraf gemaakte plaatkaart (stap 3.1; Figuur 1).
    OPMERKING: Keer de buis regelmatig om met de L1's in M9 om een gelijkmatige verdeling van wormen te behouden, omdat ze naar de bodem zullen zakken. Als dit niet gebeurt, zullen sommige putten te weinig wormen hebben, terwijl anderen er te veel zullen hebben. Doorbaar de agar ook niet met de pipetpunt, omdat dit ervoor zorgt dat de dieren zich ingraven.
  6. Laat de wormen 3 dagen bij 20 °C uitgroeien tot volwassenheid.
    OPMERKING: Het gebruik van verschillende groeitemperaturen en bepaalde mutaties kan de rijpingssnelheid beïnvloeden, dus houd rekening met de levenscyclus van C. elegans .

4. Uitvoeren van de levamisoltest (dag 5)

  1. Druk een lege datasheet af, die wordt gebruikt om het aantal wormen te registreren dat elke 5 minuten gedurende 1 uur in elke put beweegt.
    OPMERKING: Studenten kunnen de wormen in maximaal 12 putten per 5 minuten tellen. De bovenste 12 putten worden in het eerste uur getest, terwijl de onderste 12 putten in het volgende uur worden getest.
  2. Controleer de wormen in de 24-well platen. Maak met behulp van een marker een "X" op het plaatdeksel over putten die besmet zijn, uitgehongerd zijn of te veel wormen hebben (>40), wat het tellen moeilijk zal maken.
  3. Maak 0,4 mM levamisoloplossing door 200 μL 100 mM levamisolvoorraad toe te voegen aan 50 ml 1x M9. Bereid 100 mM levamisolvoorraad door 240,76 mg levamisolhydrochloride op te lossen in 10 ml H2O en bewaar het bij −20 °C.
    OPMERKING: Levamisol moet worden verdund in M9; verdunning in H2O versnelt de verlamming. Studenten moeten handschoenen dragen. Inname van hoge concentraties levamisol is toxisch.
  4. Start een timer en voeg vervolgens met behulp van een transferpipet 1 ml 0,4 mM levamisol toe aan de eerste twee putten, zodat de dieren vrij zwemmen. Blijf levamisol toevoegen aan de aangrenzende putten en spreid de tijd op basis van het aantal te testen putten.
    OPMERKING: Als bijvoorbeeld 10 putten worden getest, wordt levamisol op de volgende manier toegevoegd: putten 1 en 2 op tijdstip 0, putten 3 en 4 na 1 min, putten 5 en 6 na 2 min, putten 7 en 8 na 3 min en putten 9 en 10 na 4 min.
  5. Begin na 5 minuten handmatig alleen het aantal bewegende wormen in elke put te tellen, te beginnen met de eerste put, en noteer dat aantal op de datasheet (figuur 1). Tellers kunnen worden gebruikt, maar zijn niet vereist om het aantal bewegende wormen nauwkeurig te bepalen.
    OPMERKING: Studenten moeten de timer in de gaten houden, omdat ze soms achterop raken tijdens vroege tijdspunten voordat veel wormen verlammen. Het aantal tijdspunten kan worden aangepast, of indien nodig kunnen er op elk tijdstip minder putten worden getest.
  6. Blijf het aantal bewegende wormen in elke put elke 5 min gedurende 1 uur tellen.
    OPMERKING: Onderdompeling in M9 induceert constante zwembeweging in de loop van deze 1 uur-test, waardoor het niet nodig is om de wormen te porren om verlamming te beoordelen (figuur 2A). Blootstelling aan 0,4 mM levamisoloplossing induceert tijdsafhankelijke verlamming zoals waargenomen door stoppen met zwemmen; wormen die verlammen, herstellen niet.
  7. Herhaal stap 4.4.-4.6. voor de rest van de putten in de plaat.
  8. Noteer aan het einde van de test, of wanneer de tijd het toelaat, het totale aantal wormen in elke put.

5. Data-analyse

  1. Verkrijg de plaatkaart (stap 3.1.) en noteer welke stam overeenkomt met elke put.
    OPMERKING: Vanwege de hoeveelheid verzamelde gegevens duurt de daaropvolgende analyse en bespreking van de gegevens minstens een paar uur.
  2. Voer de gegevens in een spreadsheet in, te beginnen met het totale aantal wormen in elke put en genotype.
  3. Door gegevens uit de putten te combineren, bepaalt u het aantal wormen dat op elk tijdstip voor elke stam beweegt.
  4. Gebruik deze gegevens om een "overlevingscurve" te creëren in de statistische software (Tabel van Materialen) om de tijdsafhankelijke verlamming van de populatie visueel weer te geven (figuur 2B).
  5. Maak een gegevenstabel zodat de linkerkolom de tijd aangeeft en de volgende kolommen de gegevens voor elke stam bevatten. Voor elk dier dat binnen de eerste 5 minuten verlamd is, maakt u een rij en voert u gedurende 5 minuten een "1" in. Herhaal dit voor elk tijdstip. Voor alle dieren die aan het einde van de test niet verlammen, voert u gedurende 60 minuten een "0" in.
  6. Voer paarsgewijze vergelijkingen uit met behulp van de log-rank (Mantel-Cox) -test in de statistische software (Table of Materials) om te bepalen of er een statistisch significant verschil is tussen twee verschillende stammen.
  7. Voor aanvullende/alternatieve analyse, in plaats van stap 5.3 uit te voeren. en stap 5.4., bepaal het percentage dieren dat op elk tijdstip in elke put beweegt. Plot het gemiddelde met standaardfout op elk tijdstip voor alle stammen die zijn getest met behulp van een spreadsheetprogramma of de statistische software (figuur 2C).

Resultaten

Signalering via AChRs en GABA-receptoren zorgt ervoor dat spieren aan de ene kant van het C. elegans-lichaam kunnen samentrekken terwijl de spieren aan de andere kant ontspannen, waardoor gecoördineerde voortbewegingmogelijk wordt 6,16. Levamisolbinding aan ionotrope L-AChRs veroorzaakt contractie, wat leidt tot tijdsafhankelijke verlamming van wilde dieren. Hier beoordeelden we de gevoeligheid van wild type, unc-63 L-AChR mutant, lev-10 L-AChR clustering mutant en unc-49 GABAA receptor mutant C. elegans voor levamisol. Mutaties in subeenheden van de L-AChR, evenals in genen die nodig zijn voor het verhandelen van L-AChRs naar het spierplasmamembraan, clustering van postsynaptische L-AChRs en downstream Ca2+ signalering, veroorzaken resistentie tegen levamisol-geïnduceerde verlamming 7,8,9,10,11,16,17, zoals waargenomen in de unc-63 en lev-10 mutanten (Figuur 2B ,C). Verlies van het GABA-gated ionkanaal UNC-49 veroorzaakte levamisolovergevoeligheid (figuur 2B,C) als gevolg van verstoring van de juiste balans van cholinerge en GABAerge signalering12. Toen deze test onlangs werd uitgevoerd door studenten in een geavanceerd geneticalaboratorium, observeerde 100% van de studenten levamisolresistentie met de unc-63- en lev-10-mutanten, terwijl 88% levamisolovergevoeligheid observeerde met de unc-49-mutant. Deze gegevens verzameld met de vloeibare levamisol zwemtest komen overeen met fenotypen waargenomen in traditionele plaatgebaseerde levamisol assays 7,8,11,12,13.

figure-results-1
Figuur 1: Schematische ontwikkeling en implementatie van de levamisoltest. 24-well NGM-platen worden gegoten; 2 dagen later wordt OP50 Escherichia coli in de putten gezaaid. C. elegans worden gesynchroniseerd door middel van bleekvoorbereiding en eerste larvale stadium (L1) dieren voor elke te testen stam (wild type, zwart; unc-63(x26), magenta; lev-10(x17), groen; unc-49(e407), blauw) worden de volgende dag volgens een vooraf bepaalde plaatkaart in de putten gepipetteerd. Na 3 dagen groei bij 20 ºC, of wanneer de dieren volwassen zijn, wordt 0,4 mM levamisol in M9-buffer toegevoegd aan elke put en wordt het aantal bewegende dieren elke 5 minuten geteld gedurende 1 uur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Levamisol-geïnduceerde verlamming bij wild type en representatieve mutant C. elegans. (A) Blootstelling aan 0,4 mM levamisol veroorzaakt tijdsafhankelijke verlamming; dit wordt niet waargenomen voor dieren die zwemmen in 1x M9 buffer gedurende 1 h. (B) Tijdsafhankelijke verlamming van wild-type (zwart), unc-63(x26) (magenta), lev-10(x17) (groen) en unc-49(e407) (blauw) dieren in de levamisol zwemtest. Verlies van de L-AChR-subeenheid UNC-63 of L-AChR clustereiwit LEV-10 resulteerde in levamisolresistentie en verlies van de GABAA-receptor UNC-49 veroorzaakte levamisolovergevoeligheid. n ≥ 50 per genotype, p < 0,0001 voor alle mutanten in vergelijking met het wilde type in dit representatieve experiment. (C) Met behulp van dezelfde gegevens als in paneel (B) werd voor elke stam het percentage bewegende dieren op elk tijdstip (gemiddelde van de percentages voor elke put ± SE) bepaald. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Veranderde respons op levamisol kan genen identificeren die nodig zijn voor postsynaptische cholinerge signalering en spierfunctie. Het protocol beschrijft hier een vloeibare levamisoltest die wordt gebruikt om tijdsafhankelijke verlamming gedurende een periode van 1 uur te kwantificeren. Studenten doen voorspellingen over de effecten van bepaalde genetische mutaties, voeren een experiment uit met een grote steekproefomvang en kwantificeren vervolgens hun resultaten. Deze test is een eenvoudige, efficiënte manier om door levamisol geïnduceerde verlamming te kwantificeren zonder dieren te plukken of aan te sporen, waardoor het geschikt is voor niet-gegradueerde laboratoria, evenals onderzoekers die neuromusculaire transmissie bestuderen. Hier worden enkele van de meest voorkomende valkuilen besproken, de beperkingen van de test en een variatie op het protocol dat het gebruik ervan met RNAi knockdown-dieren mogelijk maakt; ook hier besproken is hoe deze assay kan worden ingebed in een cursus-gebaseerde undergraduate onderzoekservaring.

Een goede voorbereiding van de 24-well platen is essentieel. Ten eerste moeten bacteriële gazons volledig droog zijn voordat ze L1-dieren in de putten spotten. Als ze niet genoeg gedroogd zijn, mengt de bacterie zich tijdens de test met de levamisoloplossing, waardoor de vloeistof troebel wordt en voorkomen dat individuen de wormen kunnen tellen. Ten tweede, bij het synchroniseren van wormen door middel van bleekvoorbereiding, mogen de dieren niet te lang worden blootgesteld aan de bleekoplossing, omdat dit ervoor zorgt dat de beschermende coating op de eieren uiteenvalt. Ten derde is het cruciaal om slechts 20-30 L1's per put te spotten, omdat te veel wormen in de putten het extreem moeilijk maken om het aantal dat beweegt in de toegewezen tijd nauwkeurig te tellen. Ten slotte is het belangrijk om een aseptische techniek te behouden tijdens de bereiding van de platen, omdat verontreinigde putten niet kunnen worden getest.

Er zijn een paar beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het uitvoeren van deze test. Ten eerste kan het tellen van het aantal bewegende wormen in elke put elke 5 minuten overweldigend zijn voor personen die geen eerdere laboratoriumervaring hebben, en dit kan leiden tot onnauwkeurige gegevensverzameling. Wat betreft andere testen die worden gebruikt om de gevoeligheid van geneesmiddelen te bepalen18,19, kan dit experiment met minder tijdspunten worden uitgevoerd. Ten tweede is het plateren van uitgehongerde L1's geïsoleerd uit een bleekvoorbereiding een eenvoudige methode om een gesynchroniseerde populatie te verkrijgen; er moeten echter aanpassingen worden aangebracht als de ontwikkelingstijdstip verschilt tussen de stammen die worden getest. Het is mogelijk om late vierde larvale stadiumdieren (L4's) te plukken in een 24-well plaat voor deze test; bij het bereiden van veel borden is dit echter te arbeidsintensief. Als alternatief moet men de tijdsduur bepalen die het duurt voordat elke stam L4 bereikt en vervolgens de L1's op verschillende tijdstippen in de putten plaatsen om zich aan te passen aan verschillen in rijpingssnelheid. Ten slotte, terwijl deze test kan worden gebruikt om nieuwe genen te identificeren die belangrijk zijn voor postynaptische spierfunctie11, kan veranderde levamisolrespons ook worden veroorzaakt door mutatie of RNAi knockdown van presynaptische genen12. Als veranderde levamisolgevoeligheid wordt waargenomen, moeten aanvullende experimenten worden uitgevoerd om de reden voor dit fenotype te bepalen.

Door een paar wijzigingen aan te brengen in de 24-well platen, kan de beschreven levamisole zwemtest ook worden uitgevoerd op RNAi knockdown dieren11. Gen knockdown via RNAi kan worden bereikt door C. elegans-bacteriën te voeden die dubbelstrengs RNA tot expressie brengen dat overeenkomt met het gen van belang20. Voor de bereiding van RNAi-platen moet 1 ml 1M IPTG en 1 ml 25 mg / ml carbenicilline worden toegevoegd per liter media na verwijdering uit de autoclaaf. Bacterieculturen worden gekweekt door een enkele kolonie te plukken in 3 ml LB-bouillon plus 3 μL 25 mg / mlcarbenicilline en 's nachts bij 37 ° C te schudden, en de plaatkaart wordt gemaakt wanneer de verschillende bacteriën in de putten worden gespot. C. elegans worden gesynchroniseerd door bleekvoorbereiding zoals beschreven; de RNAi overgevoelige eri-1 (mg366) stam moet echter worden gebruikt in plaats van het wilde type om gen knockdown te verhogen. RNAi knockdowns resulteren in dezelfde levamisolfenotypen die zijn waargenomen voor functieverliesmutanten11.

Het hier gepresenteerde protocol kan worden gebruikt in laboratoriumonderzoek, als een op zichzelf staand experiment in het niet-gegradueerde laboratorium, of in de openingsweken van een geavanceerde undergraduate-cursus als een inleiding tot basis C. elegans-technieken en neuromusculaire functie. In een meer geavanceerde op ontdekking gebaseerde cursus kunnen studenten deze test gebruiken om te bepalen of het verlies van C. elegans-homologen van genen gemuteerd bij personen met myasthenische syndromen, spierdystrofieën of myopathieën de gevoeligheid voor levamisolen verandert. Kortom, deze eenvoudige, goedkope levamisolgevoeligheidstest biedt een praktische benadering om te leren over signalering bij de NMJ en ervaring op te doen met het werken met het C. elegans-modelsysteem .

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

We bedanken Riya Dattani en Lauren Hogstrom, die de gegevens in figuur 2B, C blind voor genotype verzamelden in het BISC413 Advanced Genetics Laboratory (voorjaar 2022) aan de Universiteit van Delaware. Aanvullende informatie over de BISC413 cursusgebaseerde undergraduate research experience (CURE), evenals toegang tot de laboratoriumhandleiding ontworpen door J. Tanis, is op aanvraag beschikbaar. Nematode stammen werden geleverd door het Caenorhabditis Genetics Center, dat wordt ondersteund door de NIH-ORIP (P40 OD010440). Dit werk werd ondersteund door een P20 GM103446 Delaware INBRE Mentored CURE Award (aan J.E.T.).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
60 mm non-vented, sharp edge Petri DishesTriTech ResearchCat #: T3308
BD Difco Bacto AgarFisher ScientificCat#: DF0140-01-0
BioLite 24 Well MultidishFisher ScientificCat#:12-556-006
Calcium Chloride DihydrateFisher ScientificCat#: BP510-500
CholesterolMP BiomedicalsCat#: 02101382-CF
eri-1(mg366)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)GR1373
Gibco Bacto PeptoneFisher ScientificCat#: DF0118-17-0
Gibco Bacto TryptoneFisher ScientificCat#: DF0123-17-3
GraphPad Prism (Statistisch software)GraphPad Software, Inc.
lev-10(x17)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)ZZ17
Levamisol hydrochlorideFisher ScientificCat#: AC187870100
Low Splash Regular Bleach - 121oz - up & upTargetZoek target.com
Magnesium Sulfate HeptahydrateFisher ScientificCat#: BP213-1
Microsoft ExcelMicrosoft, Inc
N2 wild typeCaenorhabditis Genetics Center (CGC)Bristol N2
OP50 E. coliCaenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50
Potassium Phosphate DibasicFisher ScientificCat#: BP363-1
Potassium Phosphate MonobasicFisher ScientificCat#: BP362-500
Sodium Chloride (NaCl)Fisher ScientificCat#: BP358-1
Sodium Hydroxide 10NFisher ScientificCat#: SS255-1
Sodium Phosphate DibasicFisher ScientificCat#: BP332-1
unc-49(e407)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)CB407
unc-63(x26)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)ZZ26

Referenties

  1. Engel, A. G., Shen, X. M., Selcen, D., Sine, S. M. Congenital myasthenic syndromes: Pathogenesis, diagnosis, and treatment. The Lancet Neurology. 14 (4), 420-434 (2015).
  2. Mahjneh, I., Lochmüller, H., Muntoni, F., Abicht, A. DOK7 limb-girdle myasthenic syndrome mimicking congenital muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 23 (1), 36-42 (2013).
  3. Rodríguez Cruz, P. M., et al. Congenital myopathies with secondary neuromuscular transmission defects; A case report and review of the literature. Neuromuscular Disorders. 24 (12), 1103-1110 (2014).
  4. Montagnese, F., et al. Two patients with GMPPB mutation: The overlapping phenotypes of limb-girdle myasthenic syndrome and limb-girdle muscular dystrophy dystroglycanopathy. Muscle and Nerve. 56 (2), 334-340 (2017).
  5. Gieseler, K., Qadota, H., Benian, G. M. Development, structure, and maintenance of C. elegans body wall muscle. WormBook. , 1-59 (2017).
  6. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 2 (9), 791-797 (1999).
  7. Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
  8. Gally, C., Eimer, S., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. A transmembrane protein required for acetylcholine receptor clustering in Caenorhabditis elegans. Nature. 431 (7008), 578-582 (2004).
  9. Eimer, S., et al. Regulation of nicotinic receptor trafficking by the transmembrane Golgi protein UNC-50. The EMBO Journal. 26 (20), 4313-4323 (2007).
  10. Gendrel, M., Rapti, G., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. A secreted complement-control-related protein ensures acetylcholine receptor clustering. Nature. 461 (7266), 992-996 (2009).
  11. Chaya, T., et al. A C. elegans genome-wide RNAi screen for altered levamisole sensitivity identifies genes required for muscle function. G3: Genes, Genomes, Genetics. 11 (4), 047(2021).
  12. Vashlishan, A. B., et al. An RNAi screen identifies genes that regulate GABA synapses. Neuron. 58 (3), 346-361 (2008).
  13. Krajacic, P., Pistilli, E. E., Tanis, J. E., Khurana, T. S., Lamitina, S. T. FER-1/Dysferlin promotes cholinergic signaling at the neuromuscular junction in C. elegans and mice. Biology Open. 2 (11), 1245-1252 (2013).
  14. Gottschalk, A., et al. Identification and characterization of novel nicotinic receptor-associated proteins in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 24 (14), 2566-2578 (2005).
  15. Loria, P. M., Hodgkin, J., Hobert, O. A conserved postsynaptic transmembrane protein affecting neuromuscular signaling in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 24 (9), 2191-2201 (2004).
  16. Treinin, M., Jin, Y. Cholinergic transmission in C. elegans: Functions, diversity, and maturation of ACh-activated ion channels. Journal of Neurochemistry. 158 (6), 1274-1291 (2021).
  17. Rapti, G., Richmond, J., Bessereau, J. L. A single immunoglobulin-domain protein required for clustering acetylcholine receptors in C. elegans. The EMBO Journal. 30 (4), 706-718 (2011).
  18. Kim, S., Sieburth, D. A receptor tyrosine kinase network regulates neuromuscular function in response to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (4), 1283-1295 (2019).
  19. Oh, K., Kim, H. Aldicarb-induced paralysis assay to determine defects in synaptic transmission in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 7 (14), 2400(2017).
  20. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Levamisolgevoeligheidneuromusculaire overgangvloeibare levamisolassayspierverlammingcholinerge signalering24 wells platenRNAi knockdownGABAerge signalering

Gerelateerde artikelen