Methodenartikel

Een stabiel gevestigde tweepuntsinjectie van lysofosfatidylcholine-geïnduceerd focale demyelinisatiemodel bij muizen

DOI:

10.3791/64059

⸱

11 mei 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft een tweepuntsinjectie van lysofosfatidylcholine via een stereotaxisch frame om een stabiel en reproduceerbaar demyelinisatiemodel bij muizen te genereren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Receptorgemedieerde lysofosfolipidensignalering draagt bij aan de pathofysiologie van diverse neurologische ziekten, met name multiple sclerose (MS). Lysophosphatidylcholine (LPC) is een endogene lysofosfolipide geassocieerd met ontsteking, en het kan snelle schade veroorzaken met toxiciteit voor myeline lipiden, wat leidt tot focale demyelinisatie. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor stereotactische tweepunts LPC-injectie die direct ernstige demyelinisatie kan veroorzaken en de experimentele demyelinisatiebeschadiging snel en stabiel bij muizen kan repliceren door chirurgische ingreep. Dit model is dus zeer relevant voor demyelinisatieziekten, met name MS, en het kan bijdragen aan het gerelateerde voortschrijdende klinisch relevante onderzoek. Ook werden immunofluorescentie en Luxol snelle blauwe kleuringsmethoden gebruikt om het tijdsverloop van demyelinisatie in het corpus callosum van muizen geïnjecteerd met LPC weer te geven. Daarnaast werd de gedragsmethode gebruikt om de cognitieve functie van muizen na modellering te evalueren. Over het algemeen is de tweepuntsinjectie van lysofosfatidylcholine via een stereotaxisch frame een stabiele en reproduceerbare methode om een demyelinisatiemodel bij muizen te genereren voor verder onderzoek.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Receptorgemedieerde lysofosfolipide signalering omvat diverse fysiologische processen van bijna alle orgaansystemen1. In het centrale zenuwstelsel (CZS) speelt deze signalering een cruciale rol bij de pathogenieën van auto-immuun neurologische ziekten zoals multiple sclerose (MS). Multiple sclerose is een chronische immuungemedieerde aandoening die wordt gekenmerkt door pathologische demyelinisatie en ontstekingsreactie, waardoor neurologische disfunctie en cognitieve stoornissen ontstaan 2,3. Na continue terugval en remitting tijdens de vroege ziekte, gaan de meeste patiënten uiteindelijk door naar het secundair-progressieve stadium, wat onomkeerbare schade aan de hersenen en de daaruit voortvloeiende invaliditeit kan veroorzaken4. Er wordt aangenomen dat het pathologische kenmerk van het secundair-progressieve beloop het demyeliniseren van plaques veroorzaakt door inflammatoire laesiesis 5. Bestaande behandelingen voor MS kunnen het risico op terugval aanzienlijk verminderen. Er is echter nog steeds geen effectieve therapie voor langdurige demyeliniserende schade veroorzaakt door progressieve MS6. Er is dus een stabiel en gemakkelijk reproduceerbaar model nodig om preklinische therapieën te bestuderen die zich richten op degeneratie van witte stof.

Demyelinisatie en remyelinisatie zijn twee belangrijke pathologische processen bij het ontwikkelen van multiple sclerose. Demyelinisatie is het verlies van myelineschede rond axonen geïnduceerd door microglia met pro-inflammatoire fenotypen7, en het leidt tot langzame geleiding van zenuwimpulsen en resulteert in het verlies van neuronen en neurologische aandoeningen. Remyelinisatie is een endogene reparatierespons gemedieerd door oligodendrocyten, waarbij aandoeningen kunnen leiden tot neurodegeneratie en cognitieve stoornissen8. De ontstekingsreactie is cruciaal voor het hele proces en beïnvloedt zowel de mate van myelineschade als het herstel.

Daarom is een stabiel diermodel van aanhoudende inflammatoire demyelinisatie zinvol voor verdere verkenning van therapeutische strategieën voor MS. Vanwege de complexiteit van MS zijn verschillende soorten diermodellen opgesteld om demyeliniserende laesies in vivo na te bootsen, waaronder experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE), toxisch-demyeliniserende modellen, cuprizon (CPZ) en lysofosfosfatidylcholine (LPC)9 . LPC is een endogene lysofosfolipide geassocieerd met ontsteking, en het kan snelle schade veroorzaken met toxiciteit voor myeline lipiden, wat leidt tot focale demyelinisatie. Op basis van eerdere rapporten en onderzoek10,11 wordt een gedetailleerd protocol van tweepuntsinjectie met enkele wijzigingen verstrekt. Over het algemeen produceert het klassieke eenpunts LPC-injectiemodel alleen lokale demyelinisatie op de injectieplaats en gaat het vaak gepaard met spontane remyelinisatie12,13. Het tweepuntsinjectie LPC-model kan echter aantonen dat de LPC direct demyelinisatie in het corpus callosum van de muis kan induceren en duurzamere demyelinisatie kan veroorzaken met weinig myelineregeneratie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door het Institute of Animal Care Committee van Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China. Volwassen C57BL/6 mannelijke en vrouwelijke muizen (wild type, WT; 20-25 g; 8-10 weken oud) werden gebruikt voor de huidige studie. De muizen werden verkregen uit commerciële bronnen (zie Tabel van Materialen). Muizen werden gehuisvest in een specifieke pathogeenvrije (SPF) dierenfaciliteit met water en voedsel dat ad libitum werd geleverd. Ze werden bewaard in een afwisselende periode van 12 uur licht en donker in de standaardomstandigheden van 22 °C temperatuur en relatieve vochtigheid van 55%-60%.

1. Bereiding van LPC-oplossingen

  1. Los 25 mg LPC-poeder (zie materiaaltabel) op met 250 μL chloroform en methanol gemengde oplossing (1:1) om een 10% LPC-oplossing te maken en over te brengen naar een centrifugebuis van 500 μL.
    OPMERKING: Als de LPC niet volledig is opgelost, plaatst u de centrifugebuis in een ultrasone reiniger en ultrasoon op 40 kHz gedurende ~ 1 uur om een uniforme oplossing te verkrijgen.
  2. Verdeel de oplossing in 3 μL/buis en bewaar bij −80 °C.
    OPMERKING: De oplossing kan ~ 2 jaar worden bewaard.
  3. Verdun vóór de operatie de oplossing (stap 1.2.) met 27 μL 0,9% NaCl-oplossing en houd de oplossing in een waterbad met constante temperatuur bij 37 °C.
    OPMERKING: Bereid de oplossing vlak voordat u met de injectie begint.

2. Chirurgische voorbereiding

  1. Gebruik een naald van 32 G, 2 inch om verbinding te maken met een spuit van 5 μL (zie Materiaaltabel). Zorg ervoor dat de microliterspuit vrij is. Trek 5 μL LPC-oplossing op voor de bereiding van de injectie.
  2. Verdoof de muis in een inductiekamer die is aangesloten op een isofluraanverdamper met 3% isofluraan gemengd met 100% zuurstof met een snelheid van ongeveer 0,3 l/min.
  3. Bevestig de diepte van de anesthesie door het ontbreken van een teen-knijpreflex terwijl de ademhaling soepel verloopt.
  4. Scheer de kop van de muis tussen de oren met behulp van een elektrisch scheerapparaat. Breng bevochtigende oogdruppels aan om uitdroging van het hoornvlies tijdens de procedure te voorkomen.
  5. Plaats de muis vervolgens in een stereotaxisch frame (zie Materiaaltabel) met de dorsale kant naar boven en bevestig het hoofd met een neuskegel en tandklem. Onderhoud anesthesie met 1,2% -1,6% isofluraan door de neus.
    OPMERKING: De isofluraanconcentratie kan worden aangepast aan de ademhalingsstatus van de muizen.

3. Chirurgische ingreep

OPMERKING: Dieren worden tijdens alle procedures op een verwarmingskussen geplaatst.

  1. Bevestig de muis aan het stereotaxische apparaat met bilaterale oorbalken. Zorg ervoor dat de oorbalken vlak zijn en dat het hoofd horizontaal en stabiel is.
  2. Desinfecteer de huid op het hoofd door meerdere keren af te vegen met jodophor gevolgd door alcohol in cirkelvormige beweging. Gebruik vervolgens een scalpel om een kleine incisie van ongeveer 1,5 cm langs de middellijn van de hoofdhuid te snijden om de schedel bloot te leggen.
  3. Veeg de schedel af met een wattenstaafje gedompeld in 1% waterstofperoxide totdat de bregma, lambda en achterste fontanel zijn blootgesteld. Plaats de spuit op het stereotaxische apparaat.
    OPMERKING: Gebruik waterstofperoxide met zorg en vermijd het aanraken van de omliggende weefsels.
  4. Zorg voor een horizontale positionering van het hoofd van het dier (zowel voor als achter en links en rechts).
    1. Pas de Z-asknop van het stereotaxische frame aan zodat de naaldpunt en de schedel elkaar gewoon raken zonder te buigen en meet vervolgens de Z-ascoördinaat. Controleer de Z-coördinaten van bregma en posterieure fontanel.
    2. Stel de oorbalk zo in dat het verschil tussen de Z-coördinaten van bregma en posterieure fontanel niet meer dan 0,02 mm is. Volg vervolgens dezelfde methode om de Z-coördinaten van de overeenkomstige posities aan de linker- en rechterkant van de middellijn te meten. Pas de oorbalk aan om ervoor te zorgen dat links en rechts op hetzelfde niveau staan.
  5. Zoek het corpus callosum. Stel de XYZ-oorsprong in op bregma.
    OPMERKING: De eerste injectieplaats is 1,0 mm lateraal aan de bregma, 2,4 mm diep en 1,1 mm voorste. De tweede injectieplaats is 1,0 mm lateraal aan de bregma, 2,1 mm diep en 0,6 mm voorste. De coördinaat van de bregma is bijvoorbeeld (0,0,0). Meet de Z-coördinaat van de overeenkomstige locatie gemarkeerd als (-1, 1.1, X) en (-1, 0.6, Y). Er kan worden bepaald dat de eerste injectieplaatscoördinaat van het corpus callosum is (-1, 1,1, −[X + 2,4]), en de tweede injectieplaats (-1, 0,6, −[Y + 2,1]).
  6. Zodra de injectieplaats is bepaald, maakt u een markering met een steriele marker op de schedel en registreert u de coördinaten.
  7. Boor voorzichtig de gemarkeerde plaats met een schedelboor (zie Materiaaltabel). Zorg ervoor dat u bloedingen voorkomt.
  8. Beweeg de naald langzaam naar de gegeven coördinaten en start de injectie. Om corpus callosum demyelinisatie te induceren, injecteert u 2 μL LPC-oplossing (stap 1.) op elke injectieplaats (stap 3.5.) met een snelheid van 0,4 μL/min.
  9. Houd de naald na injectie nog eens 10 minuten op elke plaats.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat het interval van twee injecties niet meer dan 20 minuten is.
  10. Hecht de huid met een 4-0 hechting en wacht tot het dier binnen 10 minuten wakker wordt. Analgetica postoperatief toedienen in overeenstemming met de voorschriften voor institutionele dierverzorging.
    OPMERKING: De aanbevolen tijd voor euthanasie kan worden bepaald op basis van het doel van het experiment.

4. Monsterextractie voor focale demyelinisatie

OPMERKING: Voor meer informatie over deze stap, zie het eerder gepubliceerde rapport14.

  1. Los neutrale rode kleurstof (zie materiaaltabel) op in een 1% oplossing in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
  2. uren voordat u de muizen opoffert (voor details, zie vorige referentie10), injecteert u 500 μL 1% neutrale rode kleurstof in PBS door intraperitoneale injectie voor elke muis.
  3. Voer hartperfusie12 uit met 30 ml van 0,1% PBS voorgekoeld bij 4 °C.
  4. Snijd de hersenen in 1 mm met een hersenvorm (zie Tabel met materialen).
  5. Visualiseer de laesie gekleurd met neutraal rood onder de microscoop en dissociëer de laesie.
    OPMERKING: Verwijder zoveel mogelijk omringend normaal weefsel om de nauwkeurigheid van de daaropvolgende analyse te verbeteren. Het laesieweefsel kan worden onderzocht met RT-PCR, elektronenmicroscopie en western blot-analyses.

5. Histologische kleuring en immunofluorescentie

  1. Voor histologische kleuring en immunofluorescentie12, na hartperfusie (stap 4.3.), verwijder de hersenen10, fixeer in 4% PFA 's nachts (bij 4 °C) en droog volledig uit in 30% sucrose.
  2. Snijd in 20 mm coronale hersensecties met behulp van een bevroren snijmachine10 bij constante temperatuur (−20 °C).
  3. Gebruik de plakjes voor Luxol fast blue (LFB) kleuring, immunofluorescentie en western blot10.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tweepuntsinjectie van de LPC resulteerde in een duurzamere demyelinisatie
LPC leidt voornamelijk tot snelle schade met toxiciteit voor myeline en splitsing van de axonintegriteit15. De dag van injectie werd beschouwd als dag 0. Muizen werden gedurende een periode van 10-28 dagen (10 dpi en 28 dpi) gehouden. Luxol fast blue (LFB) kleuring10 werd gebruikt om het gebied van demyelinisatie bij muizen op deze tijdstippen te evalueren. In het tweepuntsinjectie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MS, een chronische demyeliniserende ziekte van het CZS, is een van de meest voorkomende oorzaken van neurologische disfunctie bij jonge volwassenen20. Klinisch ervaren ongeveer 60%-80% van de MS-patiënten de cyclus van recidieven en remissies voordat ze een secundair progressieve MS21,22 ontwikkelen, en het leidt uiteindelijk tot cumulatieve bewegingsstoornissen en cognitieve tekorten in de loop van de tijd23. Momen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grants: 82071380, 81873743).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
L-α-Lysophosphatidylcholine uit dooierSigma-AldrichL4129-25MG
32 gauge NaaldHAMILTON7762-05
10 μl spuitHAMILTON80014
hoge snelheid schedelboorstrong,koreastrong204
boorHager & Meisinger, Duitsland REF 500 104 001 001 005
Matrx dier Anesthesie VentilatorMIDMARKVMR
Draagbare Stereotaxische Instrument voor MuisReward68507
Micro spuitRewardKDS LEGATO 130
Isofluraan VETEASY
ParaformaldehydeServicebioG1101
FosfaatbufferBOSTERPYG0021
LuxoL snelle bLueServicebioG1030-100ML
HechtdraadFUSUNPHARMA20152021225
HersenvormReward68707
Elektronenmicroscoop fixeermiddelServicebioG1102-100ML
Neutral red (C.I. 50040), voor microscopie CertistainSigma-Aldrich1.01376
Anti-Myelin Basic Protein Antilichaam Millipore#AB5864
Anti-GST-P pAbMBL#311
Ki-67 Monoklonaal Antilichaam (SolA15)Thermo Fisher Scientific14-5698-95
Beta Actin Monoklonaal AntilichaamProteintech66009-1-Ig 
Myelin Basic Protein Polyklonaal AntilichaamProteintech10458-1-AP
OLIG2 Polyklonaal AntilichaamProteintech13999-1-AP
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Konijn IgG (H+L)YEASEN34206ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Ratten IgG (H+L) YEASEN34412ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Konijn IgG (H+L) YEASEN34212ES60
HRP Geit Anti-Konijn IgG (H+L)abclonalAS014
HRP Geit Anti-Muis IgG (H+L) abclonalAS003
Volwassen C57BL/6 mannelijke en vrouwelijke muizenHunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gaire, B. P., Choi, J. W. Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864(2021).
  2. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
  3. Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
  4. Mahad, D. H., Trapp, B. D., Lassmann, H. Pathological mechanisms in progressive multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 14 (2), 183-193 (2015).
  5. Filippi, M., et al. Multiple sclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 43(2018).
  6. Villoslada, P., Steinman, L. New targets and therapeutics for neuroprotection, remyelination and repair in multiple sclerosis. Expert Opinion on Investigational Drugs. 29 (5), 443-459 (2020).
  7. Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936(2018).
  8. Franklin, R. J., Ffrench-Constant, C. Remyelination in the CNS: From biology to therapy. Nature Reviews Neuroscience. 9 (11), 839-855 (2008).
  9. Gentile, A., et al. Immunomodulatory effects of exercise in experimental multiple sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2197(2019).
  10. Chen, M., et al. Deficiency of microglial Hv1 channel is associated with activation of autophagic pathway and ROS production in LPC-induced demyelination mouse model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 333(2020).
  11. Luo, Q., et al. A stable and easily reproducible model of focal white matter demyelination. Journal of Neuroscience Methods. 307, 230-239 (2018).
  12. Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination in experimental models of toxin-induced demyelination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 318, 193-212 (2008).
  13. Degaonkar, M. N., Raghunathan, P., Jayasundar, R., Jagannathan, N. R. Determination of relaxation characteristics during preacute stage of lysophosphatidyl choline-induced demyelinating lesion in rat brain: An animal model of multiple sclerosis. Magnetic Resonance Imaging. 23 (1), 69-73 (2005).
  14. Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
  15. Plemel, J. R., et al. Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy. Glia. 66 (2), 327-347 (2018).
  16. Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
  17. Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Developmental Biology. 302 (2), 683-693 (2007).
  18. Kassis, H., et al. Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke. Neurochemistry International. 77, 17-23 (2014).
  19. Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
  20. Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, Pt 8 1972-1983 (2006).
  21. Karussis, D. The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review. Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).
  22. Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45(2022).
  23. Kutzelnigg, A., et al. Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis. Brain. 128, Pt 11 2705-2712 (2005).
  24. Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality). Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).
  25. Lamport, A. C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum. Journal of Neuroimmunology. 334, 576995(2019).
  26. Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. The cuprizone model for demyelination. Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum. 188, 72-76 (2008).
  27. Zhan, J., et al. The cuprizone model: Dos and do nots. Cells. 9 (4), 843(2020).
  28. Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia (Barcelona, Spain). 35 (1), 32-39 (2020).
  29. Merkler, D., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset reflects the immunopathology of pattern II multiple sclerosis lesions. Multiple Sclerosis Journal. 12 (4), 369-374 (2006).
  30. Ucal, M., et al. Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats. Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lysofosfatidylcholine injectiemodel voor multiple sclerosestereotactische chirurgiecorpus callosumLuxol Fast Blueimmunofluorescentiekleuringoligodendrocyten progenitorcellenWestern blotelektronenmicroscopie

Gerelateerde artikelen