IL-9-tot expressie brengende T- en ILC2-cellen worden geïnduceerd tijdens N. brasiliensis-infectie , maar hun karakterisering is grotendeels over het hoofd gezien in de geïnfecteerde darm vanwege hun lage frequentie en differentiële kinetiek. Dit protocol beschrijft de isolatie van deze cellen uit verschillende doelorganen en de bevestiging van hun identiteit via flowcytometrie in verschillende infectiestadia.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een strategie voor de studie van IL-9-producerende lymfoïde cellen in het Nippostrongylus brasiliensis infectiemodel
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
IL-9 is een pleiotroop cytokine geassocieerd met verschillende processen, waaronder antitumorimmuniteit, inductie van allergische pathologieën en de immuunrespons tegen worminfecties, waar het een belangrijke rol speelt bij de uitdrijving van de parasiet. In een muizenmodel van Nippostrongylus brasiliensis-infectie wordt IL-9 voornamelijk geproduceerd door CD4 + T-lymfocyten en aangeboren lymfoïde cellen in de longen, dunne darm en drainerende lymfeklieren. Gezien de technische problemen die gepaard gaan met de intracellulaire kleuring van IL-9, evenals de complexiteit van het isoleren van hematopoëtische cellen uit de dunne darm bij infectie, is er een dringende behoefte aan een uitgebreid maar eenvoudig protocol om de expressie van IL-9 in verschillende lymfoïde en niet-lymfoïde weefsels in dit model te analyseren. Het hier beschreven protocol schetst de kinetiek van IL-9 geproduceerd door CD4 + T-cellen en aangeboren lymfoïde cellen in de longen en dunne darm, de belangrijkste organen die het doelwit zijn van N. brasiliensis, evenals in de mediastinale en mesenteriale lymfeklieren, gedurende de infectie. Bovendien beschrijft het het aantal larven dat nodig is voor infectie, afhankelijk van het celtype en het orgaan van belang. Dit protocol is bedoeld om te helpen bij de standaardisatie van testen om tijd en middelen te besparen door de mogelijkheid te bieden om zich te concentreren op de specifieke cellen, organen en ziektestadia van belang in het N. brasiliensis-infectiemodel.
Inleiding
Haakwormen zijn darmparasieten die wereldwijd ongeveer 700 miljoen mensen infecteren, meestal in tropische gebieden in onderontwikkelde landen. Infecties met hoge intensiteit met Ancylostoma duodenale en Necator americanus, de meest voorkomende haakwormparasieten bij de mens, veroorzaken bloedarmoede en eiwittekort dat kan leiden tot vertraagde groei en mentale ontwikkeling1. N. americanus en de knaagdierparasiet Nippostrongylus brasiliensis induceren een prototypische type 2 immuunrespons in hun gastheer en delen overeenkomsten in hun levenscyclus. Vandaar dat de infectie van muizen met N. brasiliensis
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle hier beschreven dierproeven werden goedgekeurd door het Intern Comité voor Dierbehandeling (CICUAL) van het Instituut voor Cellulaire Fysiologie, Nationale Autonome Universiteit van Mexico.
OPMERKING: Een stroomdiagram van het gehele protocol wordt weergegeven in figuur 1.
1. Huisvesting van muizen
- Gebruik 8-10 weken oude, vrouwelijke of mannelijke groepen muizen, gehuisvest in dierenfaciliteiten met constante temperatuur en vochtigheid in 12 uur licht / donker cycli, met ad libitum toegang tot water en voedsel.
OPMERKING: Dit protocol maak....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Muizen werden subcutaan geïnjecteerd met 200 L3 stadium N. brasiliensis larven, of met PBS voor schijncontroles. Het aantal larven dat in dit protocol werd gebruikt, werd aangepast om levensvatbare cellen uit de longen, lymfoïde weefsel en de dunne darm te isoleren, in tegenstelling tot eerdere rapporten waar hogere ladingen wormen werden gebruikt om cellen in lymfoïde weefsels en longen slechts4 te detecteren. Longen, mediastinale lymfeklieren, mesenteriale lymfeklieren en de dunne darm .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een volledig begrip van intestinale parasiet-gastheer interacties en immuunresponsen op helminth-infectie vereist de identificatie en analyse van de verschillende celpopulaties en effectormoleculen die essentieel zijn voor de inductie van weefselremodellering en wormuitdrijving. Bodemoverdraagbare worminfecties vormen een groot probleem in ontwikkelingslanden over de hele wereld. Tot voor kort was er echter geenprotocol beschikbaar dat de analyse mogelijk maakte van zeldzame celpopulaties in de du.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen José Luis Ramos-Balderas bedanken voor zijn technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidie aan PLL van CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P en EO-M ontvingen een fellowship van CONACYT (respectievelijk 736162 en 481437). MCM-M ontving een fellowship van CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| ACK buffer | Homemade | ||
| Attune Nxt cytometer | Thermofisher | ||
| B220 | Biolegend | 103204 | |
| CD11b | Biolegend | 101204 | |
| CD11c | Biolegend | 117304 | |
| CD19 | Biolegend | 115504 | |
| CD4 | Biolegend | 100404 | |
| CD4 (BV421) | Biolegend | 100443 | |
| CD45.2 | Biolegend | 109846 | |
| CD8 | Biolegend | 100703 | |
| CD90.2 | Biolegend | 105314 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNAse I | Invitrogen | 18068015 | Specifieke activiteit: ≥10 000 eenheden/mg |
| Facs ARIA II sorter | BD Biosciences | ||
| FACS Melody cell sorter | BD Biosciences | ||
| Fc-Block | Biolegend | 101320 | |
| FcεRI | eBioscience | 13589885 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| FlowJo | FlowJo | Flow cytometry analysedatasoftware | |
| Gr-1 | Tonbo | 305931 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Homemade | ||
| IL-9 | biolegend | 514103 | |
| NK1.1 | Biolegend | 108704 | |
| Nylon mesh | lba | B07HYHHX5V | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Phosphate-buffered saline | Homemade | ||
| RPMI | Gibco | 11875093 | |
| Siglec F | Biolegend | 155512 | |
| Streptavidin | Biolegend | 405206 | |
| TCR-β | Biolegend | 109203 | |
| TCR-β (PE/Cy7) | Biolegend | 109222 | |
| TCR-γδ | Biolegend | 118103 | |
| Ter119 | Biolegend | 116204 | |
| Tricine buffer | Homemade | ||
| Zombie Aqua Fixable Viability Dye | Biolegend | 423101 |
Referenties
- Centers for Disease Control and Prevention. Parasites - Hookworm. , (2022).
- Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , Chapter 19 (Unit 19.12) (2003).
- Mearns, H., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
