Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een strategie voor de studie van IL-9-producerende lymfoïde cellen in het Nippostrongylus brasiliensis infectiemodel

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64075

⸱

3 maart 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

IL-9-tot expressie brengende T- en ILC2-cellen worden geïnduceerd tijdens N. brasiliensis-infectie , maar hun karakterisering is grotendeels over het hoofd gezien in de geïnfecteerde darm vanwege hun lage frequentie en differentiële kinetiek. Dit protocol beschrijft de isolatie van deze cellen uit verschillende doelorganen en de bevestiging van hun identiteit via flowcytometrie in verschillende infectiestadia.

Samenvatting

IL-9 is een pleiotroop cytokine geassocieerd met verschillende processen, waaronder antitumorimmuniteit, inductie van allergische pathologieën en de immuunrespons tegen worminfecties, waar het een belangrijke rol speelt bij de uitdrijving van de parasiet. In een muizenmodel van Nippostrongylus brasiliensis-infectie wordt IL-9 voornamelijk geproduceerd door CD4 + T-lymfocyten en aangeboren lymfoïde cellen in de longen, dunne darm en drainerende lymfeklieren. Gezien de technische problemen die gepaard gaan met de intracellulaire kleuring van IL-9, evenals de complexiteit van het isoleren van hematopoëtische cellen uit de dunne darm bij infectie, is er een dringende behoefte aan een uitgebreid maar eenvoudig protocol om de expressie van IL-9 in verschillende lymfoïde en niet-lymfoïde weefsels in dit model te analyseren. Het hier beschreven protocol schetst de kinetiek van IL-9 geproduceerd door CD4 + T-cellen en aangeboren lymfoïde cellen in de longen en dunne darm, de belangrijkste organen die het doelwit zijn van N. brasiliensis, evenals in de mediastinale en mesenteriale lymfeklieren, gedurende de infectie. Bovendien beschrijft het het aantal larven dat nodig is voor infectie, afhankelijk van het celtype en het orgaan van belang. Dit protocol is bedoeld om te helpen bij de standaardisatie van testen om tijd en middelen te besparen door de mogelijkheid te bieden om zich te concentreren op de specifieke cellen, organen en ziektestadia van belang in het N. brasiliensis-infectiemodel.

Inleiding

Haakwormen zijn darmparasieten die wereldwijd ongeveer 700 miljoen mensen infecteren, meestal in tropische gebieden in onderontwikkelde landen. Infecties met hoge intensiteit met Ancylostoma duodenale en Necator americanus, de meest voorkomende haakwormparasieten bij de mens, veroorzaken bloedarmoede en eiwittekort dat kan leiden tot vertraagde groei en mentale ontwikkeling1. N. americanus en de knaagdierparasiet Nippostrongylus brasiliensis induceren een prototypische type 2 immuunrespons in hun gastheer en delen overeenkomsten in hun levenscyclus. Vandaar dat de infectie van muizen met N. brasiliensis het meest gebruikte model is voor menselijke haakworminfecties. Stadium 3 (L3) N. brasiliensis infectieuze larven verplaatsen zich van de huid naar de longen in de eerste paar uur na infectie. Eenmaal in de long worden ze L4 en migreren ze de luchtpijp op om te worden ingeslikt, door de maag te gaan en de darm te bereiken om binnen 4-5 dagen volwassenen (L5) te worden. In de darm leggen L5-wormen eieren die worden uitgescheiden in de ontlasting om de levenscyclus van de parasiet opnieuw op te starten2.

De immuunrespons geïnduceerd door N. brasiliensis wordt gekenmerkt door een toename van verschillende type 2 cytokines, waaronder IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 en IL-13, samen met eosinofilie, basofilie, bokaal- en mestcelhyperplasie en verhoogde IgG1- en IgE-productie. De meeste studies die proberen de immuunresponsen te identificeren en te definiëren die worden opgewekt bij N. brasiliensis-infectie zijn gericht op de rol van IL-4 of IL-13 in dit model3. De identificatie en karakterisering van IL-9-tot expressie brengende cellen en de functie van dit cytokine waren echter grotendeels over het hoofd gezien, totdat Licona-Limón et al. de eerste studie publiceerden die een cruciale rol voor IL-9 in de immuunrespons tegen N. brasiliensis aantoonde. Met behulp van reportermuizen beschreef deze studie T-cellen (meestal T-helper 9) en type 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2's) als de belangrijkste cellulaire subsets die IL-9 tot expressie brengen bij infectie4.

Isolatie en karakterisering van immuuncellen uit met worm geïnfecteerde longen is haalbaar en is uitgebreid gerapporteerd 3,4. Vanwege de inherente weefselremodellering en slijmproductie bleek het echter een technische uitdaging om dit in de geïnfecteerde darm te doen, tot de recente publicatie van Ferrer-Font et al.5. De groep schetste een protocol voor het isoleren en analyseren van eencellige suspensies van immuunsubsets van Heligmosomoides polygyrus-geïnfecteerde muizendarmen. Op basis hiervan hebben we nu een protocol gestandaardiseerd voor isolatie en cytometrische analyse van IL-9-tot expressie brengende lymfoïde cellen uit de met N. brasiliensis geïnfecteerde darm. Daarnaast hebben we IL-9-kinetiek vastgesteld uit verschillende cellulaire bronnen en anatomische locaties gedurende de infectie.

Het karakteriseren van de verschillende celpopulaties die betrokken zijn bij deze infectie is van vitaal belang voor een breder begrip van de immuunrespons op de parasiet en de interactie met de gastheer. Dit uitgebreide protocol biedt een duidelijke route om IL-9-producerende cellen te isoleren en te analyseren van gewenste organen in ziektestadia van belang, waardoor de kennis over de rol van deze cellen bij N. brasiliensis-infectie en parasietinfecties in het algemeen sterk kan worden verbeterd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle hier beschreven dierproeven werden goedgekeurd door het Intern Comité voor Dierbehandeling (CICUAL) van het Instituut voor Cellulaire Fysiologie, Nationale Autonome Universiteit van Mexico.

OPMERKING: Een stroomdiagram van het gehele protocol wordt weergegeven in figuur 1.

1. Huisvesting van muizen

  1. Gebruik 8-10 weken oude, vrouwelijke of mannelijke groepen muizen, gehuisvest in dierenfaciliteiten met constante temperatuur en vochtigheid in 12 uur licht / donker cycli, met ad libitum toegang tot water en voedsel.
    OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van een IL-9 reporter muizenstam in C57BL/6 achtergrond, zoals eerder beschreven4; andere IL-9-reporterstammen konden echter 6,7,8 worden gebruikt, evenals intracellulaire IL-9-kleuring, met variabele resultaten9.

2. Infectie van muizen

  1. Scheer de achterkant van de muizen van het midden van het lichaam tot in de buurt van de basis van de staart 1 dag voorafgaand aan infectie. Het gebruik van anesthetica is niet essentieel.
  2. Onderhuids elke muis inenten met 200 levensvatbare N. brasiliensis-larven in het derde stadium (L3) in 100 μL fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)10 in de onderrug, zoals eerder beschreven 2,11, of injecteer 100 μL PBS alleen als controle. Offer de dieren op dag 4, dag 7 of dag 10 na de infectie.

3. Isolatie van long-, dunne darm-, mediastinale en mesenteriale lymfeklieren

  1. Euthanaseer de muis door cervicale dislocatie. Plaats de muis op zijn rug en spuit hem in met 70% ethanol. Maak een middellijnincisie met een schaar en open de huid om de buik- en thoracale gebieden bloot te leggen.
    OPMERKING: Isofluraan kan worden gebruikt als alternatieve euthanasiemethode12. Kooldioxidekamers worden niet aanbevolen, omdat CO2 leidt tot schade aan longweefsel en bloeding13.
  2. Isolatie van mediastinale lymfeklieren en longen
    1. Maak een incisie in het borstbeen en snijd in een "V" -vorm om de ribben en thoracale spieren te verwijderen. Zodra de thoracale holte is blootgesteld, lokaliseert u de mediastinale lymfeklieren naast de slokdarm, onder het hart (zie aanvullende figuur 1).
    2. Extraheer de mediastinale lymfeklieren en verzamel ze in 1 ml R-10 medium (tabel 1) in een 12-well kweekplaat. Bewaren op ijs, beschermd tegen licht tot verwerking.
      OPMERKING: De monsters moeten worden beschermd tegen licht, om te voorkomen dat het fluorescerende signaal van de reportermuizen die in deze experimenten worden gebruikt, afneemt.
    3. Extraheer de longen en verzamel ze in 1 ml R-10 medium in een 12-well kweekplaat per muis. Bewaren op ijs, beschermd tegen licht tot verwerking.
  3. Isolatie van mesenteriale lymfeklierketens en dunne darm
    1. Stel de peritoneale holte bloot en beweeg de dunne darm voorzichtig naar rechts om de mesenteriale lymfeklierketen (MLN) langs de dikke darm bloot te leggen.
    2. Verwijder met een tang de MLN, rol het voorzichtig op een papieren handdoek en trek het vet eraf.
    3. Breng de MLN over op 1 ml R-10 medium in een 12-well kweekplaat. Bewaren op ijs, beschermd tegen licht tot verwerking.
    4. Snijd de dunne darm net onder de pylorische sluitspier en boven de blindedarm. Trek de darm langzaam naar buiten met behulp van een tang en verwijder het aangehechte mesenterium en vetweefsel.
    5. Leg de dunne darm op een papieren handdoek en bevochtig deze royaal met PBS. Verwijder de Peyer's patches van de dunne darm met een schaar.
      OPMERKING: Om de levensvatbaarheid te behouden, verwijdert u het resterende vetweefsel en houdt u de dunne darm vochtig met PBS tijdens het hele proces.
    6. Knip de dunne darm in de lengterichting af met een schaar en schuif de tang voorzichtig over de open darm om de fecale inhoud en het slijm te verwijderen.
    7. Houd de dunne darm vast met een tang en was deze in 5 ml PBS op ijs door deze een paar keer voorzichtig onder te dompelen. Herhaal dit twee keer.
    8. Snijd de dunne darm in korte stukjes (ongeveer 5 mm) en verzamel ze in een conische buis van 50 ml met 10 ml HBSS14 met 2% FBS (tabel 1). Ga onmiddellijk door met het isoleren van intra-epitheliale en lamina propria-cellen.

4. Bereiding van eencellige suspensies uit de dunne darm, longen en lymfeklieren

OPMERKING: Het is uiterst belangrijk om maximaal zes muizen per persoon te verwerken bij het bereiden van eencellige suspensies uit de dunne darm, omdat de levensvatbaarheid van cellen aanzienlijk afneemt met langere verwerkingsperioden. Deze methode is overgenomen van de Heligmosomoides polygyrus infectie muismodel 5.

  1. Verwarm de schudincubator, R-20 medium, HBSS en HBSS-2 mM EDTA (tabel 1) voor op 37 °C.
  2. Bereid 10 ml dunne darm digestiemedium (tabel 1) per monster.
  3. Schud de darmstukken uit stap 3.3.8 krachtig met de hand.
  4. Filtreer elk monster door een nylon gaas (ongeveer 10 cm x 10 cm) over een glazen trechter. Was het monster door 10 ml voorverwarmd HBSS over het gaas toe te voegen en gooi de doorstroom weg. Herhaal dit nog een keer.
    OPMERKING: Gebruik een nieuw gaas voor elk monster en hergebruik dit gedurende de hele procedure.
  5. Verwijder het gaas uit de trechter en verzamel het monster uit het gaas in een conische buis van 50 ml met 10 ml warme HBSS-2 mM EDTA (stap 4.1). Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C, met schudden bij 200 tpm.
  6. Vortex gedurende 10 s bij maximale snelheid (3.200 tpm) en filter het monster met het gaas over een glazen trechter, waarbij de doorstroming wordt teruggewonnen in een conische buis van 50 ml.
  7. Herhaal stap 4.5 en 4.6 tweemaal en herstel de doorstroming in dezelfde conische buis van 50 ml. De intra-epitheliale cellen bevinden zich in deze fractie van 30 ml. Bewaar het resterende weefsel.
  8. Eencellig suspensiepreparaat uit intra-epitheliale cellen
    1. Centrifugeer de 30 ml celsuspensie, teruggewonnen in stap 4.7, bij 450 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Gooi het supernatant weg.
    2. Voeg 5 ml PBS toe en centrifugeer op 450 x g gedurende 5 minuten bij RT. Gooi het supernatant weg.
    3. Resuspendie van de celkorrel in 3 ml RPMI 10% FBS-20 μg/ml DNase (tabel 1). Op ijs houden, beschermd tegen licht tot celkleuring.
  9. Eencellig suspensiepreparaat uit lamina propria-cellen
    1. Was het resterende dunne darmweefsel uit stap 4.7 door meer dan 10 ml warm HBSS door het gaas over de trechter te gieten. Herhaal de wasbeurt. Verzamel het weefsel uit het gaas in een conische buis van 50 ml met 10 ml spijsverteringsmedium voor de dunne darm.
    2. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C, met schudden bij 200 tpm. Vortex op maximale snelheid gedurende 10 s om de 5 min.
    3. Voeg 10 ml FACS-EDTA-buffer (tabel 1) toe om de verteringsreactie te stoppen en plaats deze op ijs.
    4. Filtreer elk monster door een celzeef van 100 μm met behulp van een serologische pipet en herstel de suspensie in een conische buis van 50 ml die op ijs is geplaatst.
    5. Centrifugeer bij 600 x g gedurende 6 minuten bij 4 °C.
    6. Gooi het supernatant weg. Was de celpellet met 5 ml PBS en centrifugeer gedurende 6 minuten op 600 x g bij 4 °C.
    7. Gooi het supernatant weg en resuspensie van de celkorrel in 1 ml RPMI 10% FBS-20 μg/ml DNase. Op ijs houden, beschermd tegen licht tot celkleuring.
  10. Eencellige suspensievoorbereiding uit de longen
    OPMERKING: Elke long en dunne darm moeten parallel worden verwerkt door twee mensen om langere behandelingstijden te voorkomen, wat resulteert in een lage levensvatbaarheid van de cellen.
    1. Bereid 4 ml longverteringsmedium (tabel 1) per verwerkt monster.
    2. Verwijder het RPMI-medium uit de put met de longen uit stap 3.2.3. Knip de long in kleine stukjes met een fijne schaar.
    3. Breng de longstukken over in een conische buis van 15 ml met een spatel. Voeg 4 ml longverteringsmedium toe (tabel 1).
    4. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C, met schudden bij 250 tpm. Als u klaar bent, blijft u op ijs totdat elk monster is verwerkt.
    5. Filter elk monster door een celzeef van 100 μm, geplaatst in een enkele put van een kweekplaat met 6 putten. Dissocieer het weefsel met een zuiger van de spuit.
    6. Herstel elk monster terug in een conische buis van 15 ml en voeg 4 ml R-2-medium toe (tabel 1). Blijf op ijs terwijl de andere monsters worden verwerkt.
    7. Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspensie van de celkorrel in 1 ml R-5-medium (tabel 1).
    8. Bereid tijdens het centrifugeren 4 ml 27,5% dichtheidsgradiëntoplossing (tabel 1) per monster om de hematopoëtische celfractie15,16 te verrijken. Deze strategie voor eencellige scheiding is efficiënter, kosteneffectiever en minder toxisch in vergelijking met andere media met een vergelijkbare dichtheidsgradiënt17.
    9. Voeg 4 ml 27,5% dichtheidsgradiëntoplossing toe aan de 1 ml celsuspensie uit stap 4.10.7 en schud krachtig.
    10. Voeg langzaam 1 ml R-5 medium (tabel 1) toe aan de gemengde suspensie om twee fasen te creëren.
    11. Centrifugeer op 1.500 x g gedurende 20 minuten bij RT, met lage acceleratie en de rem uit. Observeer de ring gevormd tussen de twee fasen.
    12. Herstel de ring gevormd tussen de twee fasen met een micropipet van 1 ml en resuspensie in 4 ml R-2-medium.
    13. Centrifugeer bij 450 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg. Resuspendeer de celkorrel in 1 ml ACK-buffer (tabel 1) en incubeer gedurende 1 minuut bij RT.
    14. Voeg 4 ml R-5 medium toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 x g bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspensie van de celkorrel in 1 ml R-10 medium. Op ijs houden, beschermd tegen licht tot kleuring voor flowcytometrie.
  11. Eencellige suspensievoorbereiding uit lymfeklieren
    1. Plaats de lymfeklieren uit stap 3.2.2 of 3.3.3 tussen twee stukken gaas in een put van een kweekplaat met 6 putten en dissocieer met een zuiger van de spuit.
    2. Recupereer de celsuspensie in een conische buis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 x g bij 4 °C.
    3. Gooi het supernatant weg en resuspensie van de celkorrel in 1 ml R-10-medium. Op ijs houden, beschermd tegen licht tot kleuring voor flowcytometrie.
      OPMERKING: Als er klonten zichtbaar zijn, filtert u het monster door een celzeef van 100 μm.

5. Celkleuring voor flowcytometrie (figuur 2 en figuur 3)

OPMERKING: Centrifugeer de lymfekliercelsuspensies van stap 4.11.3 bij 450 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en resuspensie van de celpellet in 500 μl FACS-buffer (tabel 1).

  1. Celkleuring voor de identificatie van ILC2's (figuur 3 en aanvullende figuur 2)
    OPMERKING: Deze kleuringsprocedure is specifiek voor de identificatie van IL-9-tot expressie brengende ILC2-cellen.
    1. Plaat 150 μL per longmonster (ongeveer 1,8 x 10 6 cellen) vanaf stap 4.10.14 en 50 μL per lymfekliermonster vanaf stap 4.11.3 (ongeveer 0,7 x 10 6 en 2,2 x 106 cellen voor respectievelijk mediastinale en mesenteriale lymfekliermonsters) in een 96-well conische bodemkweekplaat. Voeg 100 μL FACS-buffer toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 x g bij 4 °C.
    2. Plaat 100 μL per dunne darmmonster (ongeveer 2,7 x 10 6 en 0,6 x 106 cellen voor respectievelijk intra-epitheliale en lamina propria-monsters) uit stappen 4.8.3 en 4.9.7 in een 96-well conische bodemkweekplaat. Voeg 150 μL FACS-buffer toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 x g bij 4 °C.
    3. Gooi het supernatant weg en resuspensie van elke celkorrel in 50 μl van de gebiotinyleerde antilichaamcocktail (tabel 2) verdund in FACS-buffer. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C beschermd tegen licht.
      OPMERKING: Gebruik FACS-buffer met 20 μg/ml DNase voor intra-epitheliale en lamina propria-monsters.
    4. Voeg 150 μL FACS-buffer toe. Centrifugeer bij 450 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    5. Gooi het supernatant weg en resuspensie de celpellet in 200 μL FACS-buffer. Centrifugeer opnieuw en gooi het supernatant weg.
    6. Resuspendeer de celkorrel in 50 μL van de antilichaam/vlekcocktail (tabel 2) en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C beschermd tegen licht.
    7. Voeg 150 μL FACS-buffer toe. Centrifugeer bij 450 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    8. Gooi het supernatant weg en resuspensie de celpellet in 200 μL FACS-buffer. Centrifugeer opnieuw en gooi het supernatant weg. Herhaal de was (stap 5.1.7) en gooi het supernatant weg.
    9. Resuspendie van de celkorrel in 300 μL FACS-buffer en analyseer met flowcytometrie.
    10. Gebruik voor de dunne darm- en longmonsters de gating-strategie: lymfocyten, enkele cellen, levende cellen, hematopoëtische cellen, CD90+Lineage-cellen, ST2+-cellen en IL-9+-cellen (figuur 3A,B en aanvullende figuur 2A). Gebruik voor de lymfekliermonsters de gating-strategie: levende cellen, enkele cellen, CD90+ Lineage-cellen, ST2+-cellen en IL-9+-cellen (aanvullende figuur 2B,C).
  2. Celkleuring voor identificatie van IL-9-producerende lymfocyten (figuur 2 en aanvullende figuur 3)
    1. Breng 800 μL per longmonster over van stap 4.10.14 naar een buis van 1,5 ml (ongeveer 14,6 x 106 cellen). Centrifugeer bij 450 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
    2. Voor lymfekliermonsters, plaat 400 μL van de celsuspensie uit stap 4.11.3 (ongeveer 5,6 x 10 6 en 17,5 x 106 cellen voor respectievelijk mediastinale en mesenteriale lymfekliermonsters) in een 96-well conische bodemplaat in twee stappen.
      1. Breng eerst 200 μL over, centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
      2. Breng nog eens 200 μL over in de overeenkomstige put. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
    3. Resuspendeer de celkorrel in 50-400 μl van de antilichaam/vlekcocktail (tabel 3) en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C beschermd tegen licht.
      OPMERKING: Longmonsters moeten worden geresuspendeerd in 400 μL, mediastinale lymfekliermonsters in 50 μL en mesenteriale lymfekliermonsters in 100 μL van de kleuringscocktail.
    4. Voeg 150 μL FACS-buffer toe aan de mediastinale lymfekliermonsters en 100 μL aan de mesenteriale lymfekliermonsters. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
    5. Was de long- en lymfekliermonsters door de pellets opnieuw te suspendiëren in respectievelijk 1 ml en 200 μl FACS-buffer. Centrifugeer bij 450 xg gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en herhaal de wasbeurt.
    6. Resuspendeer de longmonsters in 600 μL FACS-buffer en analyseer ze met flowcytometrie. Gebruik de gating-strategie: lymfocyten, enkele cellen, levende cellen, hematopoëtische cellen, CD4+TCRβ+-cellen en IL-9+-cellen (figuur 2A).
    7. Resuspendeer de lymfekliermonsters in 300 μL FACS-buffer en analyseer met flowcytometrie. Gebruik de gating-strategie: lymfocyten, enkele cellen, levende cellen, CD4+ TCRβ+-cellen en IL-9+-cellen (figuur 2B en aanvullende figuur 3A).

6. Bepaling van het absolute aantal cellen in eencellige suspensies

  1. Verdun de monsters uit de isolerende stappen 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 en 4.11.3 met PBS in een verhouding van 1:20 (10 μL monster + 190 μL PBS).
  2. Meng 10 μL van elk verdund monster uit stap 6.1 met 10 μL Trypan Blue. Laad 10 μL in een hemocytometer en tel de levende cellen, rekening houdend met elke verdunning.
  3. Verkrijg het absolute aantal cellen door het percentage van de populatie van belang uit levende cellen bepaald door flowcytometrie (levensvatbaarheidskleurstofnegatieve cellen) te vermenigvuldigen met het totale aantal levende cellen in de eencellige suspensie na isolatie, en dit aantal te delen door 100 (aanvullende figuur 4, aanvullende figuur 5 en aanvullende figuur 6).
    Absoluut aantal = (Percentage van de populatie van belang van levende cellen bepaald door flowcytometrie x Totaal aantal levende cellen in de eencellige suspensie)/100

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Muizen werden subcutaan geïnjecteerd met 200 L3 stadium N. brasiliensis larven, of met PBS voor schijncontroles. Het aantal larven dat in dit protocol werd gebruikt, werd aangepast om levensvatbare cellen uit de longen, lymfoïde weefsel en de dunne darm te isoleren, in tegenstelling tot eerdere rapporten waar hogere ladingen wormen werden gebruikt om cellen in lymfoïde weefsels en longen slechts4 te detecteren. Longen, mediastinale lymfeklieren, mesenteriale lymfeklieren en de dunne darm ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een volledig begrip van intestinale parasiet-gastheer interacties en immuunresponsen op helminth-infectie vereist de identificatie en analyse van de verschillende celpopulaties en effectormoleculen die essentieel zijn voor de inductie van weefselremodellering en wormuitdrijving. Bodemoverdraagbare worminfecties vormen een groot probleem in ontwikkelingslanden over de hele wereld. Tot voor kort was er echter geenprotocol beschikbaar dat de analyse mogelijk maakte van zeldzame celpopulaties in de du...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen José Luis Ramos-Balderas bedanken voor zijn technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidie aan PLL van CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P en EO-M ontvingen een fellowship van CONACYT (respectievelijk 736162 en 481437). MCM-M ontving een fellowship van CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ACK bufferHomemade
Attune Nxt cytometerThermofisher
B220Biolegend103204
CD11bBiolegend101204
CD11c Biolegend117304
CD19 Biolegend115504
CD4Biolegend100404
CD4 (BV421)Biolegend100443
CD45.2Biolegend109846
CD8 Biolegend100703
CD90.2Biolegend105314
Collagenase DRoche11088866001
DNAse IInvitrogen18068015Specifieke activiteit: ≥10 000 eenheden/mg   
Facs ARIA II sorterBD Biosciences
FACS Melody cell sorterBD Biosciences
Fc-BlockBiolegend101320
FcεRIeBioscience13589885
Fetal bovine serumGibco26140079
FlowJoFlowJoFlow cytometry analysedatasoftware
Gr-1Tonbo305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Homemade
IL-9biolegend514103
NK1.1 Biolegend108704
Nylon mesh ‎ lbaB07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556
Phosphate-buffered saline Homemade
RPMIGibco11875093
Siglec F Biolegend155512
StreptavidinBiolegend405206
TCR-β Biolegend109203
TCR-β (PE/Cy7)Biolegend109222
TCR-γδ Biolegend118103
Ter119Biolegend116204
Tricine buffer Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability DyeBiolegend423101

Referenties

  1. Centers for Disease Control and Prevention. Parasites - Hookworm. , (2022).
  2. Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , Chapter 19 (Unit 19.12) (2003).
  3. Mearns, H., et al. Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology. Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).
  4. Licona-Limon, P., et al. Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection. Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).
  5. Ferrer-Font, L., et al. High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection. Elife. 9, 51678(2020).
  6. Kharwadkar, R., et al. Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage. Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).
  7. Wilhelm, C., et al. An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation. Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).
  8. Gerlach, K., et al. TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells. Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).
  9. Olson, M. R., et al. Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production. Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).
  10. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  11. Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models. Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).
  12. Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice. International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).
  13. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).
  14. old Spring Harbor Protocols. Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red. Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  15. Bielecki, P., et al. Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state. Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).
  16. Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells. Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).
  17. Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension. Micromachines. 11 (1), 94(2020).
  18. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
  19. Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
  20. Flamar, A. L., et al. Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity. Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).
  21. Olguín-Martínez, E., et al. IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2. Frontiers in Immunology. 13, 787713(2022).
  22. Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells. Frontiers in Immunology. 12, 757967(2021).
  23. Noelle, R. J., Nowark, E. C. Cellular sources and immune functions of interleukin-9. Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

IL 9 producerende cellenhelminth infectiemodelCD4 T lymfocyteninnate lymfo de cellenintracellulaire cytokinestainingisolatie van lymfo d weefselimmunologie van de dunne darmimmuunrespons van de longenmesenteriale lymfeklieren
Een strategie voor de studie van IL-9-producerende lymfoïde cellen in het Nippostrongylus brasiliensis infectiemodel
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.