Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Endotheelceltranscytosetest als een in vitro model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren

6.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64076

⸱

7 juni 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol illustreert een in vitro endotheelceltranscytosetest als een model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren door het vermogen van menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen te meten om mierikswortelperoxidase over cellen te transporteren in caveolae-gemedieerde transcellulaire transportprocessen.

Samenvatting

Disfunctie van de bloed-retinale barrière (BRB) draagt bij aan de pathofysiologie van verschillende vasculaire oogziekten, vaak resulterend in retinaal oedeem en daaropvolgend verlies van het gezichtsvermogen. De binnenste bloed-retinale barrière (iBRB) bestaat voornamelijk uit retinaal vasculair endotheel met lage permeabiliteit onder fysiologische omstandigheden. Dit kenmerk van lage permeabiliteit wordt strak gereguleerd en gehandhaafd door lage snelheden van paracellulair transport tussen aangrenzende retinale microvasculaire endotheelcellen, evenals transcellulair transport (transcytose) erdoorheen. De beoordeling van retinale transcellulaire barrièrepermeabiliteit kan fundamentele inzichten verschaffen in iBRB-integriteit in gezondheid en ziekte. In deze studie beschrijven we een endotheelcel (EC) transcytosetest, als een in vitro model voor het evalueren van iBRB-permeabiliteit, met behulp van menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen (HRMECs). Deze test beoordeelt het vermogen van HRMECs om transferrine en mierikswortelperoxidase (HRP) te transporteren in respectievelijk receptor- en caveolae-gemedieerde transcellulaire transportprocessen. Volledig confluente HRMECs gekweekt op poreus membraan werden geïncubeerd met fluorescerend gelabeld transferrine (clathrin-afhankelijke transcytose) of HRP (caveolae-gemedieerde transcytose) om de niveaus van transferrine of HRP te meten die naar de onderste kamer werden overgebracht, wat wijst op transcytoseniveaus in de EC-monolaag. Wnt-signalering, een bekende route die iBRB reguleert, werd gemoduleerd om de caveolae-gemedieerde HRP-gebaseerde transcytose-testmethode te demonstreren. De hier beschreven EC-transcytosetest kan een nuttig hulpmiddel zijn voor het onderzoeken van de moleculaire regulatoren van EC-permeabiliteit en iBRB-integriteit in vasculaire pathologieën en voor het screenen van medicijnafgiftesystemen.

Inleiding

Het menselijk netvlies is een van de meest energie-eisende weefsels in het lichaam. Een goede werking van het neurale netvlies vereist een efficiënte toevoer van zuurstof en voedingsstoffen, samen met een beperkte flux van andere potentieel schadelijke moleculen om de retinale omgeving te beschermen, die wordt gemedieerd via de bloed-retinale barrière (BRB)1. Vergelijkbaar met de bloed-hersenbarrière (BBB) in het centrale zenuwstelsel, fungeert de BRB als een selectieve barrière in het oog en reguleert de beweging van ionen, water, aminozuren en suiker in en uit het netvlies. BRB handhaaft ook retinale homeostase en zijn immuunprivilege door blootstelling aan circulatoire factoren zoals immuuncellen, antilichamen en schadelijke pathogenen te voorkomen2. BRB-disfunctie draagt bij aan de pathofysiologie van verschillende vasculaire oogziekten, zoals diabetische retinopathie, leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), retinopathie van prematuriteit (ROP), retinale ader occlusie en uveïtis, resulterend in vasogeen oedeem en daaropvolgend verlies van het gezichtsvermogen 3,4,5.

De BRB bestaat uit twee afzonderlijke barrières voor twee verschillende oculaire vasculaire netwerken, respectievelijk: de retinale vasculatuur en de fenestrated choriocapillaris onder het netvlies. De binnenste BRB (iBRB) bestaat voornamelijk uit retinale microvasculaire endotheelcellen (RMEC's) die de retinale microvasculatuur bekleden, die de binnenste retinale neuronale lagen voedt. Aan de andere kant vormt het retinale pigmentepitheel het belangrijkste onderdeel van de buitenste BRB, die tussen het neurosensorische netvlies en choriocapillaris2 ligt. Voor de iBRB vindt moleculair transport over RMEC's plaats via zowel paracellulaire als transcellulaire routes (figuur 1). De hoge mate van stofselectiviteit in de iBRB is afhankelijk van (i) de aanwezigheid van junctionele eiwitcomplexen die het paracellulaire transport tussen aangrenzende endotheelcellen (EC's) beperken, en (ii) lage expressieniveaus van caveolae-mediatoren, transporters en receptoren in de endotheelcellen die lage transcellulaire transportsnelheden handhaven 1,6,7,8 . Junctionele complexen die de paracellulaire flux reguleren, bestaan uit tight junctions (claudins, occludins), adherens junctions (VE cadherins) en gap junctions (connexinen), waardoor de doorgang van water en kleine in water oplosbare verbindingen mogelijk is. Terwijl kleine lipofiele moleculen passief diffunderen over het binnenste van RMEC's, wordt de beweging van grotere lipofiele en hydrofiele moleculen gereguleerd door ATP-aangedreven trans-endotheelroutes, waaronder vesiculaire transport- en membraantransporters 5,9.

Vesiculaire transcytose kan worden gecategoriseerd als caveolin-gemedieerde caveolaire transcytose, clathrine-afhankelijke (en receptor-gemedieerde) transcytose en clathrin-onafhankelijke macropinocytose (figuur 2). Deze vesiculaire transportprocessen omvatten blaasjes van verschillende grootte, waarbij macropinosomen de grootste zijn (variërend van 200-500 nm) en caveolae de kleinste (gemiddeld 50-100 nm), terwijl clathrin-gecoate blaasjes variëren van 70-150 nm10. Caveolae zijn kolfvormige lipiderijke plasmamembraaninvaginaties met een eiwitlaag, voornamelijk samengesteld uit caveolin-1 die lipidemembraancholesterol en andere structurele en signaaleiwitten bindt via hun caveolin-steigerdomein11. Caveolins werken samen met perifeer gehechte cavin om caveolae-stabilisatie op het plasmamembraan te bevorderen12. Caveolar membranen kunnen ook receptoren dragen voor andere moleculen zoals insuline, albumine en circulerende lipoproteïnen, waaronder high-density lipoprotein (HDL) en low-density lipoprotein (LDL) om hun beweging over endotheelcellen te ondersteunen13. Tijdens de ontwikkeling hangt de vorming van functionele BRB af van de onderdrukking van EC-transcytose8. Volwassen retinaal endotheel heeft daarom relatief lage niveaus van caveolae-, caveolin-1- en albuminereceptoren ten opzichte van andere endotheelcellen onder fysiologische omstandigheden, wat bijdraagt aan de barrière-eigenschappen 4,9.

Omdat iBRB-afbraak een belangrijk kenmerk is van veel pathologische oogaandoeningen, is het essentieel om methoden te ontwikkelen om de retinale vasculaire permeabiliteit in vivo en in vitro te beoordelen. Deze methoden helpen waarschijnlijk inzicht te geven in de mechanismen van gecompromitteerde BRB-integriteit en beoordelen de werkzaamheid van potentiële therapeutische doelen. Huidige in vivo beeldvorming of kwantitatieve vasculaire lekkagetests maken meestal gebruik van fluorescerende (natriumfluoresceïne en dextran), colorimetrisch (Evans Blue-kleurstof en mierikswortelperoxidase [HRP] substraat) of radioactieve tracers14 om extravasatie van de vasculatuur naar omliggende retinale weefsels te detecteren met microscoopbeeldvorming of in geïsoleerd weefsellysaat. Een ideale tracer voor het kwantificeren van vasculaire integriteit moet inert en groot genoeg zijn om gecompromitteerde bloedvaten vrij te doordringen terwijl ze beperkt zijn tot gezonde en intacte haarvaten. Methoden die natriumfluoresceïne of fluoresceïne isothiocyanaat-geconjugeerde dextran (FITC-dextran) gebruiken in levende fundus fluoresceïneangiografie (FFA) of geïsoleerde retinale flat mounts worden veel gebruikt voor het kwantificeren van retinale extravasatie in vivo of ex vivo. FITC-dextran heeft het voordeel dat het beschikbaar is in verschillende molecuulgewichten, variërend van 4-70 kDa voor grootteselectieve studies 15,16,17. FITC-albumine (~68 kDa) is een alternatieve grootschalige eiwittracer van biologische relevantie voor vasculaire lekkagestudies18. Evans Blue-kleurstof, geïnjecteerd intracardiaal19, retro-orbitaal of door de staartader20, vertrouwt ook op zijn binding met endogene albumine om een groot molecuul te vormen dat kan worden gekwantificeerd door meestal spectrofotometrische detectie of, minder vaak, fluorescentiemicroscopie in platte mounts20,21. Deze kwantitatieve of lichte beeldvormingsmethoden maken echter vaak geen onderscheid tussen paracellulair transport en trans-endotheeltransport. Voor de specifieke analyse van transcytose met ultrastructurele visualisatie van getranscytoseerde blaasjes, worden tracermoleculen zoals HRP meestal gebruikt om transcytosed blaasjes te lokaliseren in endotheelcellen die kunnen worden waargenomen onder een elektronenmicroscoop 22,23,24 (figuur 3A-C).

De ontwikkeling en het gebruik van in vitro iBRB-modellen om de permeabiliteit van endotheelcellen te evalueren, zou een robuuste en hoge doorvoerbeoordeling kunnen bieden als aanvulling op in vivo experimenten en het onderzoek naar moleculaire regulatoren van vasculaire lekkage te ondersteunen. Veelgebruikte testen om het paracellulaire transport en de integriteit van tight junctions te beoordelen, zijn trans-endotheel elektrische weerstand (TEER), een maat voor ionische geleiding (figuur 4) 2,25, en in vitro vasculaire lekkagetest met behulp van fluorescerende tracers met een klein molecuulgewicht26. Bovendien zijn transferrine-gebaseerde transcytose-assays die BBB modelleren gebruikt om clathrin-afhankelijke transcytose27 te onderzoeken. Desondanks zijn de testen om BRB en, meer specifiek, retinale EC caveolaire transcytose in vitro te evalueren beperkt.

In deze studie beschrijven we een EC-transcytosetest met behulp van menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen (HRMECs) als een in vitro model om iBRB-permeabiliteit en EC-transcytose te bepalen. Deze test is gebaseerd op het vermogen van HRMECs om transferrine of HRP te transporteren via respectievelijk de receptor-gemedieerde of caveolae-afhankelijke transcytoseroutes (figuur 2). HRMECs gekweekt tot volledige confluentie in de apicale kamer (d.w.z. filterinzet) werden geïncubeerd met fluorescerend-geconjugeerd transferrine (Cy3-Tf) of HRP om de fluorescentie-intensiteit te meten die overeenkomt met de niveaus van transferrine of HRP die uitsluitend door EC-transcytose naar de onderste kamer worden overgebracht. De samenvloeiing van de celmonolaag kan worden bevestigd door TEER te meten, wat de tight junction-integriteitaangeeft 25. Om de TEER- en transcytosetesttechniek aan te tonen, werden bekende moleculaire modulatoren van vasculaire permeabiliteit en EC-transcytose gebruikt, waaronder vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF)28 en die in Wnt-signalering (Wnt-liganden: Wnt3a en Norrin)29.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) in het Boston Children's Hospital voor het genereren van lichtmicroscopie en EM-beelden (figuur 3). Protocollen voor de in vivo studies kunnen worden verkregen van Wang et al.24. Alle experimenten met menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen (HRMECs) werden goedgekeurd door het Institutional Biosafety Committee (IBC) in het Boston Children's Hospital.

1. Bereiding van reagentia

  1. Oplossing voor het coaten van weefselkweekschaal: Bereid 0,1% gelatine-oplossing door 1 ml gelatine-stamoplossing (40% -50%) op te lossen in 500 ml steriele weefselkweekklasse 1x PBS (pH = 7,4). Filtreer de oplossing door een filter van 0,22 μm. Bewaar 0,1% gelatine-oplossing bij 2-8°C. Het kan voor onbepaalde tijd bij de genoemde temperatuur in steriele toestand worden bewaard.
  2. Groeimedium: Bereid 500 ml endotheelcelgroei compleet medium (BAVA) voor door EGM-supplementen op te lossen in het basale medium (EBM) voor endotheelcelgroei volgens de instructies van de fabrikant (Tabel met materialen). Aliquot groeimedium in buizen van 50 ml en bewaar de buizen bij 4 °C. De houdbaarheid van het groeimedium is 12 maanden bij 4 °C.
  3. Trypsine-oplossing: Voor 0,25% trypsine-EDTA-oplossing, aliquot uit de voorraadflacon in buisjes van 50 ml en bewaren bij 4 °C (tot 2 weken) of −20 °C (tot 24 maanden).

2. Kweken van HRMECs

  1. Initiële celkweek
    1. Laag celkweek Petrischalen (100 mm diameter x 20 mm hoogte) met 5 ml 0,1% gelatine-oplossing onder een laminaire stromingskap en houd ze ongestoord in de kap gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) voor een uniforme coating.
      OPMERKING: Gelatinecoating van gerechten verbetert de celaanhechting. Als alternatief kunnen ook T75-kweekkolven met gelatine worden gebruikt.
    2. Voordat u de cellen zaait, aspirateert u de gelatine-oplossing met behulp van een vacuümpomp. De vacuümdruk van de gebruikte aspirator was tot 724 mmHg.
      OPMERKING: Aspiratie moet onmiddellijk vóór het zaaien van cellen worden gedaan om uitdroging van de coatingoplossing te voorkomen.
    3. Ontdooi een bevroren injectieflacon met HRMECs (uit opslag in vloeibare stikstof) hetzij met behulp van een waterbad bij 37 °C, hetzij door een warm groeimedium aan de injectieflacon toe te voegen. Eenmaal ontdooid, breng de celsuspensie over naar 9 ml groeimedium (ervan uitgaande dat de ontdooide injectieflacon HRMECs 1 ml is).
      OPMERKING: De HRMECs werden commercieel verkregen (Materiaaltabel). Het groeimedium dat aan de cellen wordt toegevoegd, moet voor gebruik altijd worden voorgewarmd tot 37 °C.
    4. Draai de cellen op 200 x g gedurende 5 minuten bij RT en zuig het supernatant voorzichtig op om te voorkomen dat de celpellet wordt verwijderd.
    5. Resuspenseer de celkorrel in 10 ml groeimedium en breng de resulterende suspensie over op een met gelatine beklede petrischaal. Bewaar de cellen in de incubator op 37 °C en 5% CO2. Doorgaans zijn HRMECs 70% -80% confluent na 72 h.
      OPMERKING: Het groeimedium wordt om de dag vervangen.
  2. Subcultuur van HRMECs op doorlatende membraaninzetstukken
    1. Bereid celkweekfilterinzetstukken (6,5 mm inzetstukken met polycarbonaatmembraan van 0,4 μm poriegrootte, geplaatst in een plaat met 24 putten) voor het zaaien van HRMECs door elke insert (apicale kamer) gedurende 30 minuten te coaten met 200 μL 0,1% gelatine-oplossing onder een laminaire stromingskap. Zorg ervoor dat de oplossing het volledige bodemoppervlak van het filterelement bedekt.
      OPMERKING: Elke put heeft een apicale en basolaterale kamer gescheiden door een poreus membraan.
    2. Haal de petrischaal met gekweekte HRMECs (stap 2.1.5.) uit de couveuse en adem de groeimedia op. Spoel de cellen voorzichtig 2x met 10 ml 1x PBS onder een laminaire stromingskap om potentiële zwevende / dode cellen te verwijderen.
    3. Dissociëren van de cellen met 0,5-1 ml trypsine-EDTA-oplossing en plaats de petrischaal gedurende 5 minuten in de incubator (37 °C en 5% CO2).
    4. Doof de trypsine-activiteit door 4,5-9 ml groeimedia toe te voegen en breng de celsuspensie over in een buis van 15 ml met behulp van een pipet van 10 ml.
    5. Draai de cellen op 200 x g gedurende 5 minuten bij RT, verwijder voorzichtig het supernatant en resuspenseer de pellet in 3 ml groeimedia.
    6. Tel het aantal cellen met behulp van een handmatige hemocytometer of een geautomatiseerde celteller en zaad met een dichtheid van 4 x 104 cellen per filterinzetstuk (d.w.z. 1,25 x 105 cellen / cm2). Het volume van de celsuspensie voor elke insert is 250 μL.
    7. Ontlucht de coatingoplossing uit de putten met doorlatende inzetstukken en breng 250 μL van de celsuspensie per insert (apicale kamer) over. Voeg alleen medium (d.w.z. zonder cellen) toe aan een van de inserts, die zal worden gebruikt als een "blanco besturingselement" voor TEER-metingen. Voeg tegelijkertijd ook 750 μL medium per put toe, in de basolaterale kamers.
    8. Houd de 24-wells plaat met doorlatende inserts in de incubator (37 °C en 5% CO2) gedurende 7-12 dagen totdat de gekweekte cellen volledig confluent worden en de gewenste TEER-waarde van ~ 20 Ω·cm2 is bereikt.
    9. Verander het groeimedium om de dag. Tijdens de mediaverandering, adem de media zorgvuldig op om verstoring van de celmonolaag te minimaliseren en voeg respectievelijk 250 μL en 750 μL verse media per put toe aan de apicale en basolaterale kamers.
      OPMERKING: Groeimedium wordt veranderd voor zowel de apicale als de basolaterale kamers van de putten.

3. TEER-metingen (figuur 4)

  1. Meet op dag 14 na het zaaien van cellen (stap 2.2.9.) de TEER voor HRMECs met behulp van een epitheliaal volt-ohm meter (EVOM) elektrische weerstand (ER) systeem (Tabel van materialen) als volgt.
  2. Laad het ER-systeem vooraf op en controleer de functionaliteit van de meter met behulp van de STX04-testelektrode. Kalibreer, indien nodig.
  3. Sluit de elektrode aan op de meter en breng de elektrode in evenwicht door deze eerst gedurende 15-20 minuten in 70% ethanol te weken en vervolgens kort onder te dompelen in het groeimedium van de celcultuur.
  4. Houd in de tussentijd de celbevattende 24-wellsplaat in de laminaire stromingskap op RT gedurende 15-20 minuten voor temperatuurbalancering.
    OPMERKING: TEER-metingen worden beïnvloed door de temperatuur, dus de equilibratiestap is essentieel.
  5. Voeg voor TEER-meting vers groeimedium toe aan zowel de apicale (250 μL) als de basolaterale (750 μL) kamers van de putten.
  6. Voer TEER-metingen uit door de elektrode zorgvuldig onder te dompelen, zodat de kortere punt in het inzetstuk zit en de langere punt de bodem van de put raakt. Meet eerst de weerstand over het lege besturingselement. Meet voor elke insert TEER in drievoud.
    OPMERKING: Voor het spoelen van de elektrode tussen de metingen door wordt kweekmedium gebruikt. Zorg ervoor dat de elektrode in een hoek van 90° ten opzichte van de onderkant van het inzetstuk wordt gehouden voor stabiele metingen.
  7. Bereken de elektrische weerstand (in Ω,cm2) over de monolaag met behulp van de formule TEER = nettoweerstand (Ω) x oppervlakte van het filterinzetstuk (cm2); hier is de nettoweerstand het verschil tussen de weerstand van elke put (groeimedium met cellen) en de blanco put (alleen groeimedium).
  8. Voer de verdere behandeling van de cellen pas uit nadat de TEER-waarde ~20 Ω·cm2 heeft bereikt. Als het gewenste TEER-niveau niet wordt bereikt, bewaar de plaat dan in de incubator en meet de TEER de volgende dag.
    OPMERKING: HRMEC-confluentie kan ook worden gevalideerd door morfologisch onderzoek van de celvorm (onder een microscoop) met typische kasseimorfologie en / of door de aanwezigheid van celverbindingseiwitten met immunohistochemische kleuring afzonderlijk.

4. Transcytosetest

  1. Clathrin-gemedieerde in vitro transcytose assay met Cy3-tagged transferrine (Figuur 5)
    1. Bij het bereiken van confluency met TEER-waarden rond 20 Ω·cm2, ontneemt serum de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2 met behulp van 0,5% FBS in EBM (serumgedroogd medium) in beide kamers (apicale kamer: 250 μL en basolaterale kamer: 750 μL) voorafgaand aan de behandeling met het ligand. Serum-gereduceerde EBM werd gebruikt tijdens de test.
    2. Incubeer de cellen (met behulp van het serumgecomduceerde medium in stap 4.1.1.) in de apicale kamer met fluorescerend (cyanine 3)-gelabeld transferrineligand (Cy3-Tf) (eindconcentratie van 40 μg/ml) gedurende 60 minuten bij 37 °C.
      OPMERKING: Platen die Cy3-Tf bevatten, moeten worden beschermd tegen licht om fotobleaching van Cy3-Tf te voorkomen door er aluminiumfolie in te wikkelen en het experiment uit te voeren in een celkweekkap met de lichten uitgeschakeld.
    3. Leg na 1 uur de plaat op ijs en was de monolaag apisch en basolateraal 4x (3-5 min per wasbeurt) met het serumgecomduceerde medium op RT om de vrije ongebonden Cy3-Tf te verwijderen.
      OPMERKING: Wassen is essentieel om vrije tracermoleculen te verwijderen en een nauwkeurige aflezing van transcytose mogelijk te maken zonder mogelijke lekkage van de paracellulaire route.
    4. Voeg vers serumgecomproduceerd medium (zoals in stap 4.1.1.) toe aan de grondig gewassen filterinzetstukken met cellen en breng de inserts over naar verse putten van de 24-wellsplaat met voorverwarmd serumgecomprimeerd medium.
    5. Incubeer de cellen nog eens 90 minuten in de incubator (37 °C en 5% CO2) en verzamel vervolgens het medium uit de basolaterale kamer.
    6. Noteer de fluorescentie-intensiteit van de oplossing uit de basolaterale kamer met behulp van een fluorescentiedetector. De niveaus van fluorescentie-intensiteit, gemeten als relatieve fluorescerende eenheden (RFU), geven de hoeveelheid Cy3-Tf-complex transcytosen aan die via clathrin-afhankelijke transcytose over de HRMEC-monolaag is getranscytoseerd.
  2. Caveolae-gemedieerde in vitro transcytosetest met behulp van HRP (figuur 6)
    1. Bij het bereiken van volledige confluency met TEER-waarden rond 20 Ω cm2, ontneemt serum de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2 met behulp van 0,5% FBS-bevattend EBM-medium (serumgedroogd medium) vóór de behandeling (zoals in stap 4.1.1.). Serum-gereduceerd EBM-medium werd gedurende de gehele test gebruikt.
    2. Behandel de cellen in de apicale kamer met de gewenste behandelingen en voertuigcontroles.
      OPMERKING: Hier hebben we Wnt-modulatoren als voorbeeld gebruikt om de regulatie van caveolae-gemedieerde transcytose door de Wnt-signaleringsroute in HRMECs aan te tonen: humaan recombinant Norrin en Wnt-remmer XAV939. In een typisch experiment werden cellen gedurende 24 uur behandeld in een incubator (37 °C en 5% CO2) met de volgende concentraties: Norrin (125 ng/ml), Norrin (125 ng/ml) + XAV939 (10 μM) en voertuigbesturingsoplossing. Daarnaast werd ook Wnt3a-geconditioneerd medium (geproduceerd uit L Wnt-3A-cellen) gebruikt.
    3. Incubeer de cellen in de apicale kamer met HRP (5 mg/ml) gedurende 15 minuten bij 37 °C.
    4. Plaats daarna de 24-wells plaat op ijs en was de apicale en basolaterale kamers intensief 6x met P-buffer (10 mM HEPES pH = 7,4, 1 mM natriumpyruvaat, 10 mM glucose, 3 mM CaCl2, 145 mM NaCl) om de vrije extracellulaire HRP te verwijderen.
      OPMERKING: Wassen is essentieel om vrije tracermoleculen te verwijderen en een nauwkeurige aflezing van transcytose mogelijk te maken zonder mogelijke lekkage van de paracellulaire route.
    5. Voeg vers serumgecomprimeerd medium (zoals in stap 4.1.1.) toe aan de apicale kamer en breng de inzetstukken over in een nieuwe put met voorverwarmde media.
    6. Incubeer de monolaag nog eens 90 minuten in de incubator bij 37 °C en 5% CO2 voordat u het medium uit de basolaterale kamer verzamelt.
    7. Voeg aan het verzamelde medium 100 μL HRP fluorogeen peroxidasesubstraat (Materiaaltabel) toe volgens de instructies van de fabrikant en incubeer bij RT gedurende 10 minuten voordat u de reactie stopt met 100 μL Stop-oplossing.
    8. Detecteer de niveaus van hrp-substraatreactieproduct in de media met behulp van een fluorescentieplaatlezer. Meet de fluorescentie-intensiteit bij 420 nm emissiegolflengte (met 325 nm excitatie) en als relatieve fluorescerende eenheden (RFU). De waarden geven het niveau van HRP-transcytosen aan dat door de HRMEC-laag wordt getranscytoseerd door middel van caveolae-gemedieerde transcytose.
      OPMERKING: Het fluorescerende product dat hier wordt gebruikt (materiaaltabel) maakt geen fotobleach. Lichtbescherming tegen fotobleaching is niet nodig.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

EM-beelden van retinaal vasculair endotheel tonen transcytotisch vesiculair transport en caveolaire blaasjes in endotheelcellen in vivo.
EC-transcytose kan in vivo worden gevisualiseerd binnen retinale doorsneden met donkerbruin neerslag dat HRP-bevattende bloedvaten reflecteert onder een lichtmicroscoop (figuur 3A) en als elektrondicht neerslag indicatief voor HRP-bevattende transcytotische blaasjes (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

BRB speelt een essentiële rol in de gezondheid en ziekte van het netvlies. In vitro technieken die de vasculaire permeabiliteit beoordelen, zijn cruciale hulpmiddelen gebleken in studies met betrekking tot de ontwikkeling en functie van barrières (BRB/BBB). De hier beschreven procedure kan worden gebruikt om de moleculaire mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan EC-transcytose of om gerelateerde moleculaire modulatoren te evalueren die de BRB-permeabiliteit beïnvloeden. In vitro EC-transc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten of financiële belangen te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies (R01 EY028100, EY024963 en EY031765) aan JC. ZW werd ondersteund door een Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Biologische veiligheidskast Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific1286
Celcultuur petrischaal Nest Biotechnology704001
Centrifuge Eppendorf5702
Centrifugebuizen (15 mL)Corning Inc.352097
Centrifugebuizen (50 mL)Denville Scientific Inc.C1062-P
Cyanine 3-menselijke Transferrine Jackson ImmunoResearchAB_2337082
Endotheelcel basaal medium-2 (EBM-2)Lonza BioscienceCC-3156
Endotheelcel groeimedium-2 (EGM-2) SingleQuots supplementenLonza BioscienceCC-4176
EVOM Millicell elektrische weerstandssysteem-2 (ERS-2)MilliporeMERS00002
Foetaal runder serum (FBS)Lonza BioscienceCC-4102B
GelatineSigma-AldrichG7765
Hemocytometer (2-chip)Bulldog BioDHC-N002
Mierikswortelperoxidase (HRP)Sigma-AldrichP8250
Menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen (HRMEC)Cell SystemsACBRI 181
IncubatorThermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific3110
L cellen (voor Control-geconditioneerd medium)ATCCCRL-2648
L Wnt-3A cellen (voor Wnt3A-geconditioneerd medium)ATCCCRL-2647
LichtmicroscoopLeicaDMi1
Multimode Plate ReaderEnSight, PerkinElmer
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) buffer (1x)GIBCO10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substraat kitThermo Fisher Scientific15169
Recombinant menselijke Norrin (rhNorrin)R&D Systems3014-NR
Recombinant menselijke Vasculaire endotheliale groeifactor (rhVEGF)R&D Systems293-VE
Spuitfilter (0,22 µm)MilliporeSLGP033RS
Transwell inserts (6,5 mm transwell, 0,4 µm pore polyester membraan inzet)Corning Inc.CLS3470-48EA
Trypsine-EDTA (0,25%) (1x)GIBCO25-200-072
WaterbadPrecision, Thermo Fisher Scientific51221060
XAV939 (Wnt/β-catenine remmer)SelleckchemS1180

Referenties

  1. Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
  2. Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 763, 70-84 (2012).
  3. Chen, J., et al. Wnt signaling mediates pathological vascular growth in proliferative retinopathy. Circulation. 124 (17), 1871-1881 (2011).
  4. Klaassen, I., Van Noorden, C. J., Schlingemann, R. O. Molecular basis of the inner blood-retinal barrier and its breakdown in diabetic macular edema and other pathological conditions. Progress in Retinal and Eye Research. 34, 19-48 (2013).
  5. Yemanyi, F., Bora, K., Blomfield, A. K., Wang, Z., Chen, J. Wnt signaling in inner blood-retinal barrier maintenance. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11877(2021).
  6. Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight junctions of the outer blood retina barrier. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 211(2019).
  7. Erickson, K. K., Sundstrom, J. M., Antonetti, D. A. Vascular permeability in ocular disease and the role of tight junctions. Angiogenesis. 10 (2), 103-117 (2007).
  8. Chow, B. W., Gu, C. Gradual suppression of transcytosis governs functional blood-retinal barrier formation. Neuron. 93 (6), 1325-1333 (2017).
  9. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  10. De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
  11. Rothberg, K. G., et al. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell. 68 (4), 673-682 (1992).
  12. Kovtun, O., Tillu, V. A., Ariotti, N., Parton, R. G., Collins, B. M. Cavin family proteins and the assembly of caveolae. Journal of Cell Science. 128 (7), 1269-1278 (2015).
  13. Wolburg, H., Dermietzel, R., Spray, D. C., Nedergaard, M. The Endothelial Frontier. Blood-Brain Interface: From Ontogeny to Artificial Barriers. , Wiley. Hoboken, NJ. 75-107 (2006).
  14. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385(2015).
  15. Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye. 5, Pt 4 440-446 (1991).
  16. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-15 (2017).
  17. Comin, C. H., Tsirukis, D. I., Sun, Y., Xu, X. Quantification of retinal blood leakage in fundus fluorescein angiography in a retinal angiogenesis model. Scientific Reports. 11 (1), 19903(2021).
  18. Pietra, G. G., Johns, L. W. Confocal- and electron-microscopic localization of FITC-albumin in H2O2-induced pulmonary edema. Journal of Applied Physiology. 80 (1), 182-190 (1996).
  19. Honeycutt, S. E., O'Brien, L. L. Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature. Biotechniques. 70 (3), 181-185 (2021).
  20. Wu, J. H., et al. Inhibition of Sema4D/PlexinB1 signaling alleviates vascular dysfunction in diabetic retinopathy. European Molecular Biology Organization (EMBO) Molecular Medicine. 12 (2), 10154(2020).
  21. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062(2013).
  22. Vinores, S. A. Assessment of blood-retinal barrier integrity. Histology and Histopathology. 10 (1), 141-154 (1995).
  23. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
  24. Wang, Z., et al. Wnt signaling activates MFSD2A to suppress vascular endothelial transcytosis and maintain blood-retinal barrier. Science Advances. 6 (35), (2020).
  25. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  26. Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods in Enzymology. 443, 137-153 (2008).
  27. Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340(2014).
  28. Feng, Y., et al. VEGF-induced permeability increase is mediated by caveolae. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (1), 157-167 (1999).
  29. Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S., Chen, J. Wnt signaling in vascular eye diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 70, 110-133 (2019).
  30. Suarez, S., et al. Modulation of VEGF-induced retinal vascular permeability by peroxisome proliferator-activated receptor-beta/delta. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (12), 8232-8240 (2014).
  31. Tomita, Y., et al. Long-acting FGF21 inhibits retinal vascular leakage in in vivo and in vitro models. International Journal of Molecular Science. 21 (4), 1188(2020).
  32. Tuma, P., Hubbard, A. L. Transcytosis: Crossing cellular barriers. Physiological Reviews. 83 (3), 871-932 (2003).
  33. Moleiro, A. F., Conceicao, G., Leite-Moreira, A. F., Rocha-Sousa, A. A critical analysis of the available in vitro and ex vivo methods to study retinal angiogenesis. Journal of Ophthalmology. 2017, 3034953(2017).
  34. Tucker, S. P., Melsen, L. R., Compans, R. W. Migration of polarized epithelial cells through permeable membrane substrates of defined pore size. European Journal of Cell Biology. 58 (2), 280-290 (1992).
  35. Butor, C., Davoust, J. Apical to basolateral surface area ratio and polarity of MDCK cells grown on different supports. Experimental Cell Research. 203 (1), 115-127 (1992).
  36. Villars, F., et al. Ability of various inserts to promote endothelium cell culture for the establishment of coculture models. Cell Biology and Toxicology. 12 (4-6), 207-214 (1996).
  37. Liu, F., Soares, M. J., Audus, K. L. Permeability properties of monolayers of the human trophoblast cell line BeWo. American Journal of Physiology. 273 (5), 1596-1604 (1997).
  38. Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30 (3), 228-234 (2003).
  39. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  40. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  41. Antonetti, D. A., Barber, A. J., Hollinger, L. A., Wolpert, E. B., Gardner, T. W. Vascular endothelial growth factor induces rapid phosphorylation of tight junction proteins occludin and zonula occluden 1. A potential mechanism for vascular permeability in diabetic retinopathy and tumors. Journal of Biological Chemistry. 274 (33), 23463-23467 (1999).
  42. Argaw, A. T., Gurfein, B. T., Zhang, Y., Zameer, A., John, G. R. VEGF-mediated disruption of endothelial CLN-5 promotes blood-brain barrier breakdown. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1977-1982 (2009).
  43. Penn, J. S., et al. Vascular endothelial growth factor in eye disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 331-371 (2008).
  44. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  45. Roberts, R. L., Fine, R. E., Sandra, A. Receptor-mediated endocytosis of transferrin at the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 104, 521-532 (1993).
  46. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Malik, A. B. Molecular determinants of endothelial transcytosis and their role in endothelial permeability. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (4), 823-842 (2007).
  47. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  48. Pulgar, V. M. Transcytosis to cross the blood brain barrier, new advancements and challenges. Frontiers in Neuroscience. 12, 1019(2018).
  49. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  50. Maurissen, T. L., et al. Microphysiological neurovascular barriers to model the inner retinal microvasculature. Journal of Personalized Medicine. 12 (48), 148(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Endotheliale transcytoseHRMECsTEER-metingcaveolae-gemedieerd transportclathrine-gemedieerde transcytoseWnt-signaleringmierikswortelperoxidasetransferrine-opname
Endotheelceltranscytosetest als een in vitro model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.