Experimenteel melanoom immunotherapiemodel met behulp van tumorvaccinatie met een hematopoëtisch cytokine

Samenvatting

Het protocol presenteert een kankerimmunotherapiemodel met behulp van celgebaseerde tumorvaccinatie met Flt3L-tot expressie brengend B16-F10 melanoom. Dit protocol demonstreert de procedures, waaronder de voorbereiding van gekweekte tumorcellen, tumorimplantatie, celbestraling, meting van tumorgroei, isolatie van intratumorale immuuncellen en flowcytometrie-analyse.

Samenvatting

Fms-achtige tyrosinekinase 3 ligand (Flt3L) is een hematopoëtisch cytokine dat de overleving en differentiatie van dendritische cellen (DC's) bevordert. Het is gebruikt in tumorvaccins om aangeboren immuniteit te activeren en antitumorresponsen te verbeteren. Dit protocol demonstreert een therapeutisch model met behulp van een op cellen gebaseerd tumorvaccin bestaande uit Flt3L-tot expressie brengende B16-F10 melanoomcellen samen met fenotypische en functionele analyse van immuuncellen in de tumormicro-omgeving (TME). Procedures voor kweekcelvoorbereiding, tumorimplantatie, celbestraling, tumorgroottemeting, intratumorale immuuncelisolatie en flowcytometrieanalyse worden beschreven. Het algemene doel van dit protocol is om een preklinisch solide tumorimmunotherapiemodel te bieden en een onderzoeksplatform om de relatie tussen tumorcellen en infiltrerende immuuncellen te bestuderen. Het hier beschreven immunotherapieprotocol kan worden gecombineerd met andere therapeutische modaliteiten, zoals immuuncheckpointblokkade (anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1-antilichamen) of chemotherapie om het kankertherapeutische effect van melanoom te verbeteren.

Inleiding

Kankerimmunotherapie is erkend als een veelbelovende therapeutische strategie op basis van de minder toxische bijwerkingen en duurzamere reacties. Er zijn verschillende soorten immunotherapieën ontwikkeld, waaronder oncolytische virustherapieën, kankervaccins, cytokinetherapieën, monoklonale antilichamen, adoptieve celoverdracht (CAR-T-cellen of CAR-NK) en immuuncheckpointblokkade¹.

Voor kankervaccins zijn er verschillende vormen van therapeutische vaccins, zoals vaccins op basis van hele cellen, eiwit- of peptidevaccins en RNA- of DNA-vaccins. Vaccinatie is afhankelijk van het vermogen van antigeen-presenterende cellen (APC's) om tumorantigeen, waaronder tumorspecifieke antigenen, te verwerken en in een immunogene vorm aan T-cellen te presenteren. Van dendritische cellen (DC's) is bekend dat ze de krachtigste APC's zijn en worden verondersteld een belangrijke rol te spelen in de immuniteit van de antitumor ^2,3. Deze cellen nemen tumorantigenen op en verwerken deze en migreren vervolgens naar de drainerende lymfeklieren (dLN) om tumorspecifieke T-effectorcellen (Teff) te primen en te activeren door betrokkenheid van de T-celreceptor (TCR) en costimulatorische moleculen. Dit resulteert in differentiatie en uitbreiding van tumorspecifieke cytotoxische T-cellen (CTL), die de tumor infiltreren en tumorcellen doden⁴. Bijgevolg vertegenwoordigen activering en rijping van DC's aantrekkelijke strategieën om de immuniteit tegen tumorantigenen te stimuleren.

Van Flt3L is bekend dat het de rijping en uitbreiding bevordert van functioneel volwassen DC's die MHC klasse II, CD11c, DEC205 en CD86 eiwitten tot expressie brengen⁵. Intratumorale, maar niet intraveneuze toediening van een adenovirusvector waarin het Flt3L-gen (Adv-Flt3L) is opgenomen, heeft aangetoond dat het immuuntherapeutische activiteit tegen ortrotopische tumoren bevordert⁶. Flt3L is ook gebruikt in op tumorcellen gebaseerde vaccins bestaande uit bestraalde B16-F10-cellen die stabiel retroviraal getransduceerde Flt3L tot expressie brengen als een manier om de kruispresentatie van tumorantigenen door DC's te verbeteren en zo de antitumorresponsen te verhogen. Het protocol van B16-Flt3L tumorvaccinatie dat hier wordt beschreven, is gebaseerd op een studie gepubliceerd door Dr. James Allison's groep⁷. In dit artikel meldden ze dat een B16-Flt3L-vaccin in combinatie met CTLA-4-blokkade synergetisch de afwijzing van vastgesteld melanoom veroorzaakte, wat resulteerde in een verhoogde overleving.

Het doel van dit protocol is om een preklinisch immunotherapiemodel voor melanoom te bieden. Hier worden gedetailleerde procedures beschreven voor het bereiden en implanteren van tumorvaccins en het analyseren van de samenstelling en functie van intratumorale immuuncellen van solide tumoren.

Protocol

Alle muizen die in de studie werden gebruikt, werden onderhouden en gehuisvest in het vivarium van het La Jolla Institute for Immunology (LJI) onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden met gecontroleerde temperatuur en vochtigheid. Dierproeven werden uitgevoerd met 8-14 weken oude vrouwelijke C57BL/6 muizen volgens richtlijnen en protocollen goedgekeurd door de LJI Animal Care Committee.

1. Voorbereiding van gekweekte tumorcellen voor implantatie

1. Kweek B16-F10 melanoomcellen in Iscove's Modified Dulbecco's medium (IMDM) met 10% warmte-geïnactiveerde FBS, 2 mM glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 1 mM MEM niet-essentiële aminozuren en 100 U / ml elk van penicilline en streptomycine. Houd de cellijn op 37 °C onder 5% CO₂.
2. Zaai 1,5-2 x 10⁶ B16-F10 cellen in een 175T kolf en kweek gedurende 2 dagen. Oogst cellen wanneer ze 75% -80% confluent zijn.
3. Verwijder het kweekmedium en was de kolf eenmaal met PBS. Aspirateer PBS en voeg 5 ml 0,25% trypsine-EDTA toe, gevolgd door hard op de rand van de kweekkolf te tikken.
4. Voeg 15 ml kweekmedium toe om de trypsine-EDTA te neutraliseren en giet de inhoud van de kolf in een centrifugebuis van 50 ml. Was het afwasoppervlak met 10 ml PBS en giet in dezelfde buis van 50 ml.
5. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 200 x g. Gooi het supernatant weg en breek de celkorrel door met de vinger op de onderkant van de buis te tikken.
6. Voeg koude 10 ml PBS toe en pipetteer voorzichtig de celsuspensie; tel vervolgens handmatig cellen met behulp van de hemocytometer. Houd de cellen op ijs voor injectie.

2. Tumorimplantatie

1. Gas verdoof muizen met 5% isofluraan bij een gasdebiet van 1,0 l per minuut in de zuurkast. Verander het debiet in de onderhoudsdosis van 2% isofluraan zodra de muizen volledig verdoofd zijn. Voor dit protocol werd anesthesie uitgevoerd door de dierenarts volgens de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van de instelling voor dieren.
2. Scheer het haar op de linkerflank van de muizen en steriliseer de injectieplaats met behulp van alcoholdoekjes. Intradermaal (d.w.z.) implanteren B16-F10 tumorcellen bij 5 x 10⁵ cellen in 50 μL koude PBS in de linkerflank met behulp van een naald van 30 G.
   OPMERKING: De dosis geïmplanteerde B16-F10-tumorcellen moet mogelijk worden aangepast in het bereik van 0,5-5 x 10⁵ cellen voor een succesvolle tumorontwikkeling.
3. Meet na implantatie drie keer per week de lengte en breedte van de tumor met behulp van een elektronische digitale remklauw. Bereken het tumorvolume (mm³) met behulp van de formule:
   Tumorvolume (mm³) = breedte² × lengte × 0,5
   Behandel muizen met tumorvaccin wanneer tumoren een grootte van ≥2 mm hebben bereikt.
   OPMERKING: Tumoren kunnen meestal worden gemeten op dag 3 na implantatie van 5 x 10⁵ tumorcellen. Snellere B16-F10 tumorgroeisnelheid werd waargenomen bij mannelijke C57BL/6, Rag1^-/-, of Rag2-/-γc-/-muizen. Een soortgelijke observatie werd beschreven in andere studies⁸. Het wordt aanbevolen om het geslacht van de muizen consistent te houden. Merk echter op dat de NIH de nadruk legt op seks als een belangrijke biologische variabele in biomedisch onderzoek.

3. Vaccinbereiding en injectie van Flt3L-tot expressie brengende B16-F10 (B16-Flt3L) cellen

1. Onderhoud de B16-Flt3L-cellen in DMEM met 8% warmte-geïnactiveerde FBS, 2 mM glutamine en 100 U / ml elk van penicilline en streptomycine bij 37 ° C onder 5% CO₂.
2. Zaai 1 x 10⁶ B16-Flt3L cellen in een 175T kolf en kweek gedurende 2 dagen. Oogst cellen wanneer ze 75% -80% confluent zijn zoals beschreven in stap 1.3 tot 1.6 en suspensie in 1 ml koude PBS.
3. Bestraal cellen met een dosis gammastraling van 150 Gy met behulp van een röntgenbestralingsapparaat met een parameterinstelling van 160 kV en 25 mA. Tel en controleer de levensvatbaarheid van de cel door trypan blue-kleuring vóór injectie.
4. Gas verdoof muizen zoals eerder beschreven en steriliseer de injectieplaats met behulp van alcoholdoekjes. Injecteer de muizen intradermaal met 1 x 10⁶ bestraalde B16-Flt3L-cellen in 50 μL koude PBS op dezelfde flank als de oorspronkelijke tumorimplantatie, ~ 1 cm verwijderd van de plaats van de primaire tumor op dag 3, 6 en 9 na de eerste celimplantatie.
5. Markeer de injectieplaatsen van het vaccin met een gekleurde pen om deze te onderscheiden van de primaire tumor.
   OPMERKING: Als 0,5 x 10⁵ B16-F10-cellen in eerste instantie worden geïmplanteerd, wordt aanbevolen om een vaccinbehandeling uit te voeren op dag 8, 11 en 14.

4. Intratumorale immuuncelisolatie

1. Offer muizen op met behulp van CO₂ en cervicale dislocatie in de zuurkast aan het einde van het experiment (op dag 15 na tumorimplantatie; Figuur 1).
2. Verwijder de tumor operatief met de huid van elke muis en plaats deze in een 24-well plaat met 1 ml 10% FBS / RPMI-1640 medium. Droog de tumoren af met een papieren handdoek voordat u het weegt.
3. Snijd de tumoren in kleine stukjes. Voeg 2 ml digestiebuffer (100 μg/ml TL Liberase en 200 μg/ml DNase I in RPMI-1640 medium) toe en incubeer gedurende 25 minuten bij 37 °C.
4. Voeg 10 ml 10% FBS/RPMI-1640 medium toe om de spijsvertering te stoppen. Breng de cellen over met een serologische pipet van 25 ml en gebruik de zuiger van een spuit van 1 ml om weefsel op een celzeef van 40 μm te malen.
5. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de pellet in 5 ml van 40% dichtheid gradiëntspecifiek medium in PBS, verdund tot 1x concentratie).
6. Voeg de celsuspensie langzaam toe bovenop 5 ml 80% dichtheidsgradiëntspecifiek medium dat PBS bevat. Centrifugeer de cellen bij 325 x g met lage reminstelling gedurende 23 minuten bij kamertemperatuur (RT).
7. Verzamel na centrifugatie zorgvuldig de leukocytenlaag op het grensvlak tussen 40% en 80% dichtheidsgradiëntspecifiek medium en passeer het door een celzeef van 40 μm. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
8. Incubeer de pellet in 2 ml rode bloedcel (RBC) lysisbuffer gedurende 5 minuten bij RT. Voeg na incubatie 10 ml 10% FBS/RPMI-1640 medium toe om de RBC-lysisbuffer te doven.
9. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de cellen in 0,5 ml van 10% FBS / RPMI-1640 medium en tel het totale aantal cellen voor gebruik voor verdere analyse.
   OPMERKING: Verzamel de milt of dLN als controles voor gating-strategie van immuuncelsubsets door flowcytometrie-analyse. Volg de celisolatiemethode zoals hierboven beschreven met de volgende wijzigingen: Gebruik de zuiger van een spuit van 1 ml om weefsel te malen op een 70 μm mesh-filter. Was het weefsel met 10% FBS/RPMI-1640 medium om eencellige suspensies te krijgen. Lyse de RBC zoals beschreven.

5. Flowcytometrie analyse

OPMERKING: Cellen verzameld uit de leukocytenlaag bevatten immuuncellen en tumorcellen. Twee onafhankelijke kleuringspanelen worden aanbevolen.

1. Oppervlaktevlekken
   1. Breng de cellen over in een 96-well V-shape-bottom plaat. Was de cellen met PBS en kleur ze met cel levensvatbaarheidskleurstof (50-100 μL / put) gedurende 15 minuten op RT.
   2. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Kleur de oppervlaktemarkers met gemengde antilichamen (gedetailleerde verdunning is opgenomen in de tabel met materialen) in FACS-buffer (1% FBS en 0,05% NaN₃ in PBS) gedurende 30 minuten op ijs (50-100 μL / put).
   3. Centrifugeer de cellen op 500 x g gedurende 5 minuten en was ze tweemaal met FACS-buffer.
   4. Bevestig de cellen met celfixatiebuffer (50-100 μL/ putje) gedurende 35 minuten op ijs. Centrifugeer de cellen op 500 x g gedurende 5 minuten en was ze twee keer met FACS-buffer.
   5. Bewaar de monsters in FACS-buffer (150-200 μL/buis) bij 4 °C en bescherm tegen licht. Verkrijg de monsters op een flowcytometer. Volg voor dc's en T-cellenpopulatie de gatingstrategieën in figuur 2B en figuur 3A.
      OPMERKING: Voor het kleuren van myeloïde DC's wordt aanbevolen om FC-blocker (Rat anti-muis CD16/CD32) gedurende 15 minuten op ijs te incuberen voordat oppervlakteantistoffen incubatie (stap 5.1.2) worden aanbevolen.
2. Cytokine-analyse bij ex vivo herstimulatie
   1. Plaats de cellen in volledig medium (RPMI-1640 aangevuld met 10% FBS, 10 mM HEPES, pH 7,2-7,6, 0,1 mM niet-essentieel aminozuur, 1 mM natriumpyruvaat, 100 U/ml per penicilline en streptomycine, 50 μM 2-mercaptoethanol en 2 mM L-glutamine) en stimuleer met 50 ng/ml PMA plus 1 μM ionomycine in aanwezigheid van eiwittransportremmer gedurende 4 uur bij 37 °C onder 5% CO₂.
   2. Voer oppervlaktekleuring uit voor oppervlaktemarkers zoals hierboven beschreven in stap 5.1.
   3. Voeg de permeabilisatieoplossing (50-100 μL/put) toe en incubeer gedurende 5 minuten bij RT voor intracellulaire kleuring. Incubeer de cellen met antilichamen die specifiek zijn voor cytokines of nucleaire eiwitten in permeabilisatieoplossing (50-100 μL/put) gedurende 60 minuten op ijs of een nacht bij 4 °C.
   4. Centrifugeer de cellen op 500 x g gedurende 5 minuten en was ze tweemaal met FACS-buffer. Bewaar de monsters bij 4 °C en bescherm tegen licht. Verkrijg de monsters op een flowcytometer.
      OPMERKING: Antilichaamverdunning moet mogelijk indien nodig worden aangepast om optimale kleuring te bereiken.

Resultaten

Een zichtbare zwarte stip van de geïmplanteerde B16-F10-cellen wordt meestal waargenomen op het huidoppervlak ~ 3 dagen na tumorimplantatie. Muizen worden behandeld met het tumorvaccin 3, 6 en 9 dagen nadat de tumorknobbel een grootte van ≥2 mm heeft bereikt. We zagen een significante vermindering van tumorgroei in gevaccineerde muizengroep ~ 2 weken na tumorimplantatie (figuur 1). Aan het einde van het experiment isoleerden we de intratumorale immuuncellen en analyseerden we hun aantal en c...

Discussie

Het hier beschreven protocol is gebaseerd op de studie van allison's groep. Ze toonden aan dat de combinatie van B16-Flt3L-vaccin met CTLA-4-blokkade een synergetisch effect had op de overlevingskans en tumorgroei, terwijl er geen vermindering van tumorgroei werd gezien bij muizen die alleen het B16-Flt3L-vaccin of anti-CTLA-4-antilichaambehandeling^{kregen 7}. Recente studies hebben een nieuwe Treg-intrinsieke CTLA4-PKCη signaleringsroute onthuld die een belangrijke verplichte rol speelt bij het reg...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
10% heat-inactivated FBS	Omega Scientific	FB-02	Lot# 209018
30G naald	BD Biosciences	305106
96 well V-vormige bodem plaat	SARSTEDT	83.3926.500
B16-cellijn die Fms-achtige tyrosine kinase 3 ligand tot expressie brengt (B16-Flt3L)	Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI		Flt3L cDNA's werden gekloneerd in de pMG-Lyt2 retrovirale vector, zoals in refernce 5, Aanvullende Figuur 1
B16-F10-cellijnen	ATCC	CRL-6475
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Cytofix fixatie buffer	BD Biosciences	BDB554655	Cel fixatie buffer (4,2% PFA)
Cytofix/Cytoperm kit	BD Biosciences	554714	Fixatie/Permeabilisatie oplossing kit
DNase I	Sigma	11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)	Corning	10013CV
Elektronische digitale schuifmaat	Fisherbrand	14-648-17
FlowJo software	Tree Star		Flow cytometer data analyse
GolgiStop (eiwittransport remmer)	BD Biosciences	554724	1:1500 verdunning
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Ionomycin	Sigma	I0634
Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium (IMDM)	Thermo Fisher	12440053
LSR-II cytometers	BD Biosciences		Flow cytometer
MEM niet-essentiële aminozuren	Gibco	11140-050
penicilline en streptomycine	Gibco	15140-122
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	GE17-0891-02	dichtheidsgradiënt specifiek medium
PMA	Sigma	P1585
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid	Sigma	R7757-100ML
RPMI 1640 medium	Corning	10-040-CV
RS2000 X-ray Irradiator	Rad Source Technologies
natriumpyruvaat	Gibco	11360-070
Steriele celzeef 40 μm	Fisherbrand	22-363-547
Steriele celzeef 70 μm	Fisherbrand	22-363-548
TL Liberase	Roche	477530
Zombie Aqua fixable viability kit	BioLegend	423101
Antilichamen
Anti-mCD45	BioLegend	103135	Clone: 30-F11 Fluorofoor: BV570 Verdunning: 1:200
Anti-mCD3ε	BioLegend	100327	Clone: 145-2C11 Fluorofoor: PerCP-Cy5.5 Verdunning: 1:200
Anti-mCD8	BioLegend	100730 100724	Clone: 53-6.7 Fluorofoor: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Verdunning: 1:200
Anti-mCD4	BioLegend	100414	Clone: GK1.5 Fluorofoor: APC-Cy7 Verdunning: 1:200
Anti-mFoxp3	Thermo Fisher Scientific	11577382	Clone: FJK-16s Fluorofoor: FITC Verdunning: 1:100
Anti-m/hGzmB	BioLegend	372208	Clone: QA16A02 Fluorofoor: PE Verdunning: 1:100
Anti-mIFNg	BioLegend	505826	Clone: XMG1.2 Fluorofoor: PE-Cy7 Verdunning: 1:100
Anti-mCD19	BioLegend	115543	Clone: 6D5 Fluorofoor: BV785 Verdunning: 1:100
Anti-mGr1	BioLegend	108423	Clone: RB6-8C5 Fluorofoor: APC/Cy7 Verdunning: 1:200
Anti-mCD11b	BioLegend	101223	Clone: M1/70 Fluorofoor: Pacific blue Verdunning: 1:100
Anti-mF4/80	BioLegend	123114	Clone: BM8 Fluorofoor: PECy7 Verdunning: 1:100
Anti-mCD11c	BioLegend	117328	Clone: N418 Fluorofoor: PerCP Cy5.5 Verdunning: 1:100
Anti-mMHCII	BioLegend	107622	Clone: M5/114.15.2 Fluorofoor: AF700 Verdunning: 1:400
Anti-mCD103	BioLegend	121410	Clone: 2E7 Fluorofoor: Alexa Fluor 647 Verdunning: 1:200
Anti-mCD86	BioLegend	105007	Clone: GL-1 Fluorofoor: PE Verdunning: 1:200
FC-blocker (Rat anti-muis CD16/CD32)	BD Biosciences	553141	Clone: 2.4G2 Verdunning: 1:200