Method Article

Visualisatie van subcellulaire lokalisatie van een eiwit in het hart met behulp van Quantum Dots-Gemedieerde immuno-labeling gevolgd door transmissie-elektronenmicroscopie

DOI:

10.3791/64085

⸱

September 16th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Translational Pathobiology, Louisiana State University Health Sciences Center-Shreveport, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, Louisiana State University Health Sciences Center-Shreveport

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft een methode voor het immuno-labelen van een eiwit in de hartweefselsecties met behulp van quantum dots. Deze techniek biedt een handig hulpmiddel om de subcellulaire lokalisatie en expressie van elk eiwit op ultrastructureel niveau te visualiseren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De subcellulaire lokalisatie is van cruciaal belang voor het afbakenen van de juiste functie en het bepalen van de moleculaire mechanismen van een bepaald eiwit. Verschillende kwalitatieve en kwantitatieve technieken worden gebruikt om de subcellulaire lokalisatie van eiwitten te bepalen. Een van de opkomende technieken bij het bepalen van de subcellulaire lokalisatie van een eiwit is quantum dots (QD) -gemedieerde immunolabeling van een eiwit gevolgd door beeldvorming met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). QD is een halfgeleider nanokristal met een dubbele eigenschap van kristallijne structuur en hoge elektronendichtheid, waardoor ze toepasbaar zijn op elektronenmicroscopie. Deze huidige methode visualiseerde de subcellulaire lokalisatie van Sigma 1 receptor (Sigmar1) eiwit met behulp van QD-TEM in het hartweefsel op ultrastructureel niveau. Kleine blokjes van de hartweefselsecties van een wildtype muis werden gefixeerd in 3% glutaaraldehyde, vervolgens gefixeerd, gekleurd met uranylacetaat, gevolgd door sequentiële dehydratie met ethanol en aceton. Deze gedehydrateerde hartweefselsecties werden ingebed in epoxyharsen met een lage viscositeit, gesneden in dunne secties van 500 nm dikte, op het rooster geplaatst en vervolgens onderworpen aan antigeenontmaskering met 5% natriummetaperiodaat, gevolgd door het blussen van de resterende aldehyden met glycine. De weefsels werden geblokkeerd, gevolgd door sequentiële incubatie in primair antilichaam, gebiotinyleerd secundair antilichaam en streptavidin-geconjugeerde QD. Deze bevlekte secties werden vlekkerdroog en bij hoge vergroting in beeld gebracht met TEM. De QD-TEM-techniek maakte de visualisatie van de subcellulaire lokalisatie van Sigmar1-eiwit op ultrastructureel niveau in het hart mogelijk. Deze technieken kunnen worden gebruikt om de aanwezigheid van elk eiwit en subcellulaire lokalisatie in elk orgaansysteem te visualiseren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het menselijk lichaam bestaat uit vele eiwitten die verantwoordelijk zijn voor tal van lichaamsfuncties. De functie van eiwitten hangt grotendeels af van hun lokalisatie in het orgaan en cellulaire organellen. Verschillende technieken, waaronder subcellulaire fractionering, immunofluorescentie en detergent-gemedieerde eiwitextractie, worden vaak gebruikt om de subcellulaire lokalisatie van het eiwit te bepalen 1,2. Microscopie met immunofluorescente kleurstof is de meest gebruikte methode onder deze technieken. De fluorescerende kleurstoffen die bij deze techniek worden gebruikt, zijn echter minder stabiel en vatbaar voor fotobleaching3. Andere technieken omvatten microscopie met hoge resolutie om het eiwit op ultrastructureel niveau te visualiseren door eiwitten te immunolabelen met elektrondichte, zware metalen (goud, ferritine) of quantum dots nanokristallen en gevolgd door ze te visualiseren met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)4,5.

QD is een halfgeleider nanokristal samengesteld uit halfgeleidermetaalverbindingen met controleerbare fotoluminescentie-eigenschappen die een grote betekenis hebben in biologische systemen3. QD-nanokristallen worden gemaakt in een core-shell-formaat waarbij een nanokristal is ingekapseld in de vorming van nanokristallen om hun juiste stabiliteit en werking te garanderen. Veelgebruikte core-shell nanokristallen combinatie zijn CdSe/ZnS, CdSe/CdS CdSe/ZnSe, CdTe/CdS, CdTe/ZnS en CdTe/CdS/ZnS (core/shell/shell)3. Van deze nanokristalcombinaties worden CdSe/ZnS en CdSe/CdS het krachtigst bestudeerd en vaak gebruikt als secundaire antilichaamconjugaten 3,6. Deze QD-nanodeeltjes bezitten ook fluorescerende eigenschappen met andere excitatie- en emissiespectra dan traditionele fluoroforen. QD maakt gebruik van de excitatie van elektronen uit de bulkvalentieband om hogere fluorescentie-kwantumopbrengsten te vertonen in vergelijking met traditionele fluoroforen. De nanokristalschikking van halfgeleidermetalen maakt QD-gemedieerde etikettering stabieler en bestand tegen fotobleaching6. Bovendien zorgt de nanokristalkern in QD en zijn kristallijne structuur ervoor dat QD van verschillende groottes een breed scala aan absorptiespectra en zeer smalle emissiepieken heeft7. Bovendien zijn deze QD-deeltjes groot genoeg om een hoge elektronendichtheid te produceren, waardoor ze nuttig zijn bij microscopietechnieken met hoge resolutie, waaronder transmissie-elektronenmicroscopie 5,8,9. Deze QD nanokristallen zijn ook in de handel verkrijgbaar in meerdere maten met verschillende fluorescentie-emissiespectra en -vormen, waardoor ze een uitstekende kandidaat zijn voor etikettering met meerdere antilichamen10,11.

QD-technologie werd van groot belang in biologisch onderzoek vanwege meerdere functionele eigenschappen, waaronder gebruik in live-cell imaging, de studie van transportmechanismen in de cel, membraantransport van de diffusiebeweging van eiwitten, functionele heterogeniteit van cellen en markering van intracellulair organel 3,12,13,14,15,16 . QD is ook nuttig in moleculaire diagnostiek voor het richten en detecteren van kankerweefsels, het karakteriseren van het moleculaire profiel en de immuunstatus van de tumor en het visualiseren van glasachtig lichaam en epiretinale membranen 3,17,18. Daarnaast kan QD ook worden gebruikt in medische therapieën voor de behandeling van tumormaligniteiten via fotodynamische therapie en oogheelkundige anomalieën door geneesmiddelen aan de ogen toe te dienen 3,17,18,19.

Met behulp van deze zeer nuttige QD-nanokristallen bepaalde de huidige studie de subcellulaire lokalisatie van een eiwit genaamd Sigma 1-receptor (Sigmar1). Sigmar1 is een alomtegenwoordig tot expressie gebracht multitaskend moleculair chaperonne-eiwit. Uitgebreide studies gericht op sigmar1's subcellulaire lokalisatie in verschillende weefsels en organen rapporteerden een cel- en weefseltype specifieke subcellulaire lokalisatie die moleculaire functie uitlokt20. In verschillende cellen (neuronale, fotoreceptor- en immuuncellen) en weefsels (lever en hersenen) met behulp van verschillende biochemische benaderingen, rapporteerden studies de lokalisatie van Sigmar1 op endoplasmatisch reticulum (ER), mitochondria-geassocieerd ER-membraan (MAM), nucleaire envelop, plasmamembraan, nucleoplasmatisch reticulum, kern en mitochondriën. Ondanks al deze studies bleef de subcellulaire lokalisatie van Sigmar1 in het hart onbekend20. Daarom werd de subcellulaire lokalisatie van Sigmar1 in hartweefsel bepaald met behulp van de QD-gemedieerde immunolabeling gevolgd door TEM-beeldvorming.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De procedures voor het hanteren van dieren in dit protocol voldeden aan de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition, National Institutes of Health, Bethesda, MD) en werden goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van Louisiana State University Health Sciences Center-Shreveport. Zes maanden oude mannelijke muizen met FVB/N-achtergrond werden gebruikt voor de huidige studie. De muizen werden verkregen uit commerciële bronnen (zie Tabel van Materialen). De gebruikte muizen werden gehuisvest in een goed gereguleerde omgeving in kooien die een 12 uur licht-donker-cyclus mogelijk maakten, voorzien van water en een regelmatig chow-dieet ad libitum, en werden verzorgd volgens de NIH Guide for the Care and Use of the Laboratory Animals. Het totale proces wordt geïllustreerd in figuur 1.

1. Voorbereiding van dieren

  1. Verdoof de muizen met 3% isofluraan. Open de borst door een horizontale incisie te maken in het gebied boven de middenbuik en aan de huid te trekken. Maak voorzichtig nog een incisie om de borstholte te openen zonder andere organen te doorboren 21,22,23.
    1. Perfuseer24 eerst het hart door de top en vervolgens de rechter ventrikel met behulp van koude 3% glutaaraldehyde in cardioplege oplossing (50 mM KCl, 5% dextrose in PBS, zie aanvullend bestand 1) gedurende 2 minuten om volledige myocardiale ontspanning te garanderen.
  2. Perfuseer het hart met ijskoude 3% glutaaraldehyde in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer (pH 7,4, stap 2.1.1) gedurende nog eens 2 min. Gebruik met behulp van zwaartekrachtdruk een naald van 25 G 5/8" om de fixatieven in het hart te brengen. Onmiddellijk nadat het hart zich begint te vullen met het fixatiemiddel, tilt u de top van het hart op en snijdt u de bloedvaten eronder op 1-2 mm van het hart om de druk te verlichten en de vloeistoffen te laten wegvloeien.
  3. Ontleed het hart, verwijder deboezems 24 en laat de ventrikels in ijskoud 3% glutaaraldehyde / 0,1 M natriumcacodylaat in een petrischaaltje vallen. Maak een vlindersnede na 30-60 minuten fixatie en plaats deze in een petrischaal met 3% glutaaraldehyde/cacodylaat (zie Materiaaltabel). Hak het hart met behulp van een chirurgisch mesje in kleine blokjes van 1 mm3 terwijl het in glutaaraldehyde / cacodylaatoplossing zit.
  4. Fixeer/dompel het ontlede hartweefsel gedurende 24 uur bij 4 °C in glutaaraldehyde/cacodylaatoplossing.

2. Verwerking van hartweefsel

  1. Was na 24 uur fixatie de weefsels in 0,1 M natriumcacrodaatbuffer gedurende 20 minuten.
    1. Bereid 0,1 M cacodylaatbuffer voor volgens de onderstaande stappen.
      1. Om 0,1 M natriumcacodylaatbuffer te bereiden, bereidt u een voorraad van 1 M natriumcacodylaatbuffer door natriumcacodylaat (21,4 g) op te lossen en van 1% calciumchlorideoplossing (3 ml) in 90 ml gedestilleerd water. Volume verhoog de oplossing tot 100 ml door het gedestilleerde water toe te voegen. Roer de oplossing goed door en laat deze een nacht staan om de opgeloste stof op te lossen.
      2. Neem vervolgens 10 ml natriumcacodylaatbouillonoplossing en voeg deze toe aan 80 ml gedestilleerd water. Stel de pH in op 7,4 met HCl en volume tot 100 ml door gedestilleerd water toe te voegen.
  2. Herhaal de wasbeurt in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer gedurende nog eens 20 minuten. Verwijder de weefsels uit de natriumcacrodronidebuffer en dompel ze gedurende 4 uur bij kamertemperatuur onder in 2% osmiumtetroxideoplossing. Dit proces wordt osmicatie genoemd.
    1. Bereid 2% Osmium tetroxide-oplossing volgens de onderstaande stappen.
      1. Om 2% Osmium tetroxide-oplossing te bereiden, neemt u 4% Osmium-tetroxide-oplossing, 4 ml (zie materiaaltabel), 1 M natriumcacodylaatbouillon-stockoplossing (0,8 ml) en gedestilleerd water (3,2 ml) om in totaal 8 ml oplossing te maken.
        OPMERKING: Dit hele proces en de stappen vanaf hier moeten worden uitgevoerd in de zuurkast.
  3. Dompel na osmicatie de weefsels onder in 2% natriumacetaatoplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    1. Bereid 2% natriumacetaatoplossing door 4 g natriumacetaat op te lossen in 20 ml gedestilleerd water.
  4. Dompel vervolgens de weefsels onder in 2% uranylacetaatoplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    1. Bereid 2% uranylacetaatoplossing door 4 g uranylacetaat op te lossen in 20 ml gedestilleerd water.
  5. Na uranylacetaatkleuring de weefsels achtereenvolgens uitdrogen door de gesorteerde alcoholen en aceton in de volgorde vermeld in aanvullend dossier 1.

3. Inbedding van hartweefsel

  1. Integreer de gedehydrateerde weefsels in epoxyhars met lage viscositeit volgens de onderstaande stappen.
    1. Om epoxyhars met een lage viscositeit te maken, mengt u 10,24 ml vinylcyclohexeendioxide (ERL 4221) epoxymonomeer, 6,74 ml diglycidylether van polypropyleenglycol (DER 732) en 30,05 ml non-ylsuccinisch anhydride (NSA) (zie materiaaltabel) in een buis van 50 ml. Roer de suspensie goed met de hand gedurende 2 min.
    2. Voeg 18 druppels 2-dimethylaminoethanol (DMAE, zie Materiaaltabel) epoxyversneller toe en roer de suspensie om de componenten grondig te mengen.
    3. Impregneer de weefsels in epoxyhars in de volgende opeenvolging van mengsel.
      1. Vervang de 100% aceton door 1:1 hars: aceton suspensie en dompel de weefsels er 1 uur in onder bij kamertemperatuur.
      2. Vervang 1:1 hars: aceton suspensie door 6:1 hars: aceton suspensie en dompel de weefsels erin gedurende 3 uur.
      3. Vervang ten slotte de 6: 1-hars: acetonsuspensie door 100% harssuspensie en laat weefsels er 's nachts bij kamertemperatuur in ondergedompeld.
  2. Doe de weefsels in verse hars in microvormen van 8 mm (zie Materiaaltabel) en laat de ingebedde weefsels een nacht uitharden bij 70 °C.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de hars hard is, maar niet broos na het uitharden.

4. Weefselsectie met behulp van een ultramicrotoom

  1. Trim de harsblokken met het weefsel tot niet groter dan 1 mm voor montage op de ultramicrotoom (zie Materiaaltabel). Plaats de mal zo precies mogelijk in de gesegmenteerde arm van de ultramicrotoom en beweeg de monstervorm handmatig naar het diamantmes.
  2. Snijd de secties op een dikte van 500 nm (een halve micron) met een Histo-mes (zie Materiaaltabel) en pak ze met behulp van het EM-lusgereedschap op en plaats ze op een glazen glijbaan.
  3. Plaats de glasplaat op een kookplaat voor toluidineblauwe vlek25 om het interessegebied te vinden.
  4. Nadat u het interessegebied hebt gevonden, gebruikt u een Ultra 45 ° -mes (zie Materiaaltabel) om ultradunne secties van licht goud (100 nm) te produceren. Plaats deze ultradunne secties aan de doffe kant van een koperen rooster van 200 mazen.

5. Ultradunne hartsectie kleuring

  1. Begin de kleuring door het antigeen te ontmaskeren met behulp van een etsoplossing, d.w.z. 5% natriummetaperiodaatoplossing.
    1. Bereid 500 μL 5% natriummetafperiodaatoplossing (zie Materiaaltabel) in gedestilleerd water.
      OPMERKING: Bereid verse oplossing voor gebruik.
    2. Doe 20 μL natriummetaperiodaatoplossing op een schone paraffinefilm. Plaats de volledig gedroogde roosters met weefselsecties op de druppel van de etsoplossing.
      OPMERKING: De doffe kant van het raster met het weefselgedeelte moet naar de etsoplossing gericht zijn.
    3. Laat het sectierooster 30 minuten op de oplossing staan bij kamertemperatuur.
  2. Was het geëtste weefselgedeelte door het gedurende 60 s op een druppel gedestilleerd water te plaatsen.
  3. Blokkeer de resterende aldehyden door de sectieroosters gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een druppel van 0,05 M glycineoplossing te plaatsen. Dep de randen van het rooster op filterpapier om de resterende glycine-oplossing te verwijderen.
    1. Bereid 0,05 M glycine-oplossing (zie materiaaltabel) door 3,75 mg glycine op te lossen in 1 ml 1x PBS (pH 7,4).
  4. Plaats de sectieroosters in 10-20 μL blokkeringsoplossing gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Blokkerende oplossingssamenstelling: 2 μL van 1% normaal geitenserum (NGS) + 20 μL van 1% BSA (eindconcentratie: 10%) + 178 μL van 1x PBS (pH 7,4) om een eindvolume van 200 μL te maken.
  5. Dep de rasterranden op filterpapier en plaats het rastergedeelte op antilichaamverdunningsmiddel voor conditionering bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
  6. Incubeer de roostersecties met primair antilichaam (Sigmar1 in dit geval, zie Tabel van materialen; verdund 1:10 in antilichaamverdunningsmiddel) gedurende 1 uur en 30 minuten in een bevochtigde kamer.
  7. Dep het rooster droog en was de roostersecties twee keer met antilichaamverdunningsmiddel gedurende elk 5 minuten.
  8. Incubeer de rastersecties met gebiotinyleerd secundair antilichaam (in dit geval gebiotinyleerd geiten-antikonijn polyklonaal secundair antilichaam, zie Tabel van materialen; verdund 1:10 in antilichaamverdunningsmiddel) gedurende 1 uur in een bevochtigde kamer.
  9. Dep het rooster droog en was de roostersecties twee keer met antilichaamverdunningsmiddel gedurende elk 5 minuten.
  10. Incubeer de roostersecties in in de handel verkrijgbare streptavidin-geconjugeerde QD (QD655nm, zie Tabel van materialen; verdund 1:10 in antilichaamverdunningsmiddel) gedurende 1 uur in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur. Voorkom blootstelling aan licht door de kamer te bedekken met aluminiumfolie.
  11. Dep de roosterranden droog met filterpapier en was de roostersecties door ze gedurende 2 minuten op waterdruppels te plaatsen.
  12. Dep de randen van het rooster om te drogen.

6. Transmissie Elektronen Microscopie (TEM) beeldvorming

  1. Plaats de ultradunne secties op koperen roosters in een monsterkwartethouder en klem ze in een positie om de selectie van rasters in de elektronenbundel mogelijk te maken.
  2. Plaats de monsterhouder in de microscoopkolom en schakel de pompschakelaar in om de goniometer te evacueren, gevolgd door het volledig inbrengen van de monsterhouder in de microscoopkolom (zie Materiaaltabel).
  3. Stel de spanning in op 80 kV voordat u de bundel genereert voor beeldobservatie.
  4. Focus goed op het gewenste gebied, leg het beeld vast met een snelle digitale camera en sla het bestand op in .tif formaat.
    OPMERKING: De microscoopinstelling om beeld te maken in deze studie was een versnellende spanning of hoogspanningsspanning van 80 kV en een vergroting van 20.000x.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige QD-TEM-methodologie visualiseerde de aanwezigheid van Sigmar1 en de lokalisatie ervan op de subcellulaire hartcompartimenten door anti-Sigmar1 gerichte QD-etikettering uit te voeren op ultradunne hartsecties van volwassen muizen. Elektronendichte anti-Sigmar1 gelabelde QD op mitochondriale membranen (binnen en buiten), lysosomen en het endoplasmatisch reticulum / sarcoplasmatisch reticulum (ER / SR) membraan-mitochondriale interface (figuur 2A, B) werden geïllustreerd door de QD-TEM-afbeeldingen. Daarnaast werden hartsecties ook gelabeld met konijn IgG en QD als een Isotype-controle voor anti-Sigmar1 konijn primair antilichaam (figuur 2C, D). Daarom benadrukte QD-TEM-beeldvorming de lokalisatie van endogene Sigmar1 en de verrijking ervan, voornamelijk op de lysosomen en de mitochondriale membranen.

figure-results-1
Figuur 1: Schematische illustratie met de opeenvolgende stappen en procedures die worden gebruikt om QD-TEM uit te voeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Sigmar1 immuno-gelabelde QD in volwassen muizen hartweefsels. (A,B) Representatieve TEM-beelden met Sigmar1 gelabeld QD op mitochondriën (buiten- en binnenmembraan), mitochondria-geassocieerd endoplasmatisch reticulum (ER) / sarcoplasmatisch reticulum (SR) membranen en lysosomen. (C,D) TEM-afbeelding van de hartsecties van isotypecontrole gelabeld met QD's en konijn IgG. Schaalbalk: 200 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend dossier 1: Samenstelling van PBS en andere oplossingen die worden gebruikt voor weefseluitdroging. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de huidige studie werd QD-gemedieerde immunolabeling gebruikt om de subcellulaire lokalisatie van Sigmar1 onderscheidend aan te tonen. Met behulp van QD werd de lokalisatie van Sigmar1 op het mitochondriale membraan, met name het binnenste mitochondriale membraan, afgebeeld in hartweefsel. Bovendien bleek Sigmar1 zich ook te bevinden op sarcoplasmatisch/endoplasmatisch reticulum (S/ER) en lysosomen op ultrastructureel niveau, zoals weergegeven in figuur 2A-D.

Een cruciale stap in dit protocol is de stap van het etsen of ontmaskeren van antigeen met behulp van sterk geconcentreerde natriummetaperiodaatoplossing om het antigeen te ontmaskeren na glutaaraldehydefixatie en osmicatie. Dit protocol gebruikte een enkele behandeling met een hoge concentratie (5%) natriummetaperiodaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Extra zorg is nodig in deze stap, omdat een langere duur of hogere concentratie voor natriummetaperiodaatincubatie zal resulteren in aggregatie van structuren, verlies van membraandefinitie voor de organellen en perforaties in de sectie zal veroorzaken, waardoor het moeilijk wordt om het eiwit of de structuur te visualiseren. Als alternatief kan ook een lagere concentratie (3%) metaperiodaetoplossing in twee stappen gedurende 30 minuten worden gebruikt in plaats van 5% metaperiodaat. Studies hebben aangetoond dat deze optie vergelijkbare resultaten vertoont als met 5% metaperiodate-oplossing voor eenstaps incubatie van 30 minuten. Een 3% metaperiodate-oplossing voor 30 minuten incubatie gedurende twee keer biedt echter een betere controle over het proces 26,27,28. Aanvankelijk gebruikte dit protocol incubatie van de secties met 10% metaperiodaet-oplossing gedurende 30 minuten. Vanwege te veel perforaties die door deze concentratie in het weefselgedeelte werden gecreëerd, werd de uiteindelijke concentratie en incubatieduur van de metaperiodaatoplossing echter afgebouwd en geoptimaliseerd tot 5% gedurende 30 minuten.

Een andere stap vereiste optimalisatie van de fixatietijd met glutaaraldehyde. Suboptimale fixatie van weefsels resulteert in onvoldoende QD-etikettering, terwijl overfixatie van weefsels resulteert in hogere niet-specifieke etikettering. Daarom moet zorgvuldig worden overwogen bij het bepalen en titreren van een optimaal niveau van weefselfixatie voor een goede en specifieke etikettering van eiwitten. Bij deze methode met hartweefsels werd de fixatietijd met glutaaraldehyde getitreerd met 24 uur en 48 uur als tijdstippen. Op basis van de kleuringsbeelden van de secties die voor beide tijdstippen waren vastgesteld, bleek dat secties die gedurende 24 uur waren vastgesteld, betere resultaten vertoonden. Tot op heden zijn QD nanokristallen verkrijgbaar in meerdere maten, waaronder 525, 565, 585, 605, 655 en 705 nm11,29. Elk van deze QD heeft zijn eigen emissiespectra en zendt fluorescentie uit op verschillende golflengten. Bovendien geven deze in de handel verkrijgbare QD's van verschillende groottes verschillende vormen weer; QD 525, 565 en 585 zijn bijvoorbeeld vrijwel bolvormig met verschillende maten, terwijl QD 605, 655 en 705 onregelmatig langwerpig van vorm zijn. Van deze verschillende QD nanokristallen zijn QD 525, 565 en 655 gemakkelijk van elkaarte onderscheiden 11,29. Deze verschillen in emissiespectra en -vormen maken QD een geweldige kandidaat voor multi-labeling van eiwitten en visualisatie door fluorescentie en elektronenmicroscopie. In deze studie werd een in de handel verkrijgbare QD, QD 655, gebruikt om het Sigmar1-eiwit te labelen om het te onderscheiden van elke niet-specifieke achtergrond in de gekleurde secties.

Een andere tegenhanger van QD voor eiwitetikettering in hoge resolutie microscopie is het immunogouddeeltje. De immunogolddeeltjes worden traditioneel gebruikt om eiwitten te labelen voor microscopie met hoge resolutie. Deze gouddeeltjes zijn zeer elektrondicht en gemakkelijk identificeerbaar in vergelijking met QD-nanokristallen. QD vertoont echter een betere efficiëntie met een betere penetratie in weefsels, een hogere stabiliteit en houdbaarheid en een betere retentie van ultrastructurele componenten, waardoor ze een betere kandidaat zijn voor eiwitetikettering 4,5. QD heeft ook een uniek vermogen om te worden gedetecteerd door zowel licht- als elektronenmicroscopie, wat bijdraagt aan zijn waarde ten opzichte van immunogold-etikettering10.

Een beperking van deze QD-gemedieerde immunolabeling is het gebruik van osmiumtetroxide tijdens de verwerking. Osmiumtetroxide wordt gebruikt om de elektronendichtheid, geleidbaarheid en het contrast van anders minder elektrondichte en minder contrasterende biologische membraanstructuren te verhogen 5,30. Het gebruik van osmiumtetroxide vernietigt echter onmiddellijk en onomkeerbaar de eigenschap van het monster om fluorescentie te creëren wanneer het wordt gelabeld met QD6. Dit beperkt het gebruik van QD in fluorescentiemicroscopie. Een alternatieve benadering waarbij het gebruik van osmiumtetroxide wordt weggelaten, zal voordelig zijn om de fluorescerende eigenschappen te behouden en dus de dubbele toepassing van QD-gemedieerde immunolabeling. Sommige van de nieuwere modellen van TEM hebben de mogelijkheid om het Energy Dispersive X-Ray Analysis (EDX) -systeem te bevestigen dat identificatie van de elementaire samenstelling van materialen mogelijk maakt. Een andere beperking van de studie is het ontbreken van elementaire mapping van een steekproef en beeldanalyse met behulp van EDX. Daarom moeten toekomstige studies zich richten op de EDX-analyse van de QD-spectra om de elementaire samenstelling te analyseren.

QD-etikettering van eiwitten heeft de afgelopen tijd veel aandacht gekregen. QD biedt verschillende toepassingen en voordelen in zowel biologisch onderzoek als medische therapieën. QD wordt bovendien omwikkeld met polydentaatligand en vertoont een verhoogde stabiliteit om de kwantumopbrengst te behouden. Verder verhoogt het inkapselen van QD met deze bio-gunstige middelen ook de biologische beschikbaarheid in weefsels, waardoor het een goede kandidaat is voor potentiële toepassing bij het detecteren van tumoren, live-cell imaging, medicijnafgifte en weefselbeeldvorming 3,31,32.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health-subsidies: R01HL145753, R01HL145753-01S1, R01HL145753-03S1 en R01HL152723; LSUHSC-S CCDS Finish Line Award, COVID-19 Research Award en LARC Research Award aan MSB; LSUHSC-S Malcolm Feist Cardiovasculaire en AHA Postdoctorale Fellowship voor CSA (20POST35210789); en LSUHSC-S Malcolm Feist Pre-doctoral Fellowship aan RA.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
200 Mesh copper gridTed PellaG200HH
6-month-old male mice with FVB/N backgroundJackson Laboratory, Bar Harbor, ME
Acetone 100%Fisher ChemicalsA949
Antibody diluentDakoS3022
anti-Sigmar1 antibodyCell Signaling61994S
Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibodySigma AldrichB7389
BSAc (10%)Electron Microscopy Sciences25557
Calcium chlorideSigma AldrichC7902
Cytoseal XylThermo fisher8312-4
DER 732C36AA10:C33Electron Microscopy Sciences13010
DextroseSigma AldrichG7528
Diamond KnifeDiatomeHisto; Ultra 450
DMAEElectron Microscopy Sciences13300
Electron microscopeJEOLJEOL-1400 Flash
ERL 4221Electron Microscopy Sciences15004
Ethanol 100%Fisher ChemicalsA405P
Glutaraldehyde 3%Electron Microscopy Sciences16538-15
GlycineAlfa AesarA13816
Hydrochloric acidFisher ScientificSA56
MicromoldsTed Pella10505
MicrotomeLeica MicrosystemEM UC7
Normal goat serumInvitrogenPCN5000
NSAElectron Microscopy Sciences19050
Osmium tetroxideElectron Microscopy Sciences19150
ParafilmGenesse Scientific16-101
Potassium ChlorideSigma AldrichP5655
Potassium Phosphate monobasicSigma Aldrich71640
Qdot 655 Streptavidin ConjugateInvitrogenQ10121MP
Sodium AcetateFisher ScientificBP334
Sodium CacodylateElectron Microscopy Sciences12300
Sodium ChlorideFisher ScientificBP358
Sodium metaperiodateSigma Aldrich71859
Sodium Phosphate dibasicSigma AldrichP9541
Surgical blade (size 10)Aspen surgical371110
TEM  image softwareAMT-V700AMT TEM imaging systems
TEM imaging cameraXR80 TEM seriesAMT TEM imaging systems
Toluidine Blue O solution (0.5%)Fisher ScienticS25612
Uranyl acetatePolysciences21447

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Advances in high-resolution imaging - techniques for three-dimensional imaging of cellular structures. Journal of Cell Science. 125 (11), 2571-2580 (2012).">Lidke, D. S., Lidke, K. A. Advances in high-resolution imaging - techniques for three-dimensional imaging of cellular structures. Journal of Cell Science. 125 (11), 2571-2580 (2012).
  2. Tissue fraction-past and present. The Journal of Cell Biology. 50 (1), 20(1971).">de Duve, C. Tissue fraction-past and present. The Journal of Cell Biology. 50 (1), 20(1971).
  3. Cellular and Molecular Toxicology of Nanoparticles. Saquib, Q., Faisal, M., Al-Khedhairy, A. A., Alatar, A. A. , Springer International Publishing. 323-334 (2018).">Pleskova, S., Mikheeva, E., Gornostaeva, E. Cellular and Molecular Toxicology of Nanoparticles. Saquib, Q., Faisal, M., Al-Khedhairy, A. A., Alatar, A. A. , Springer International Publishing. 323-334 (2018).
  4. A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs. Annals of Anatomy - Anatomischer Anzeiger. 191 (2), 153-170 (2009).">Mayhew, T. M., Mühlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs. Annals of Anatomy - Anatomischer Anzeiger. 191 (2), 153-170 (2009).
  5. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Experimental Cell Research. 337 (2), 202-207 (2015).">Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. G. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Experimental Cell Research. 337 (2), 202-207 (2015).
  6. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).">Deerinck, T. J. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  7. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 52 (1), 13-18 (2004).">Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 52 (1), 13-18 (2004).
  8. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 307 (5709), 538-544 (2005).">Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 307 (5709), 538-544 (2005).
  9. Correlative light- and electron microscopy using quantum dot nanoparticles. Journal of Visualized Experiments. (114), e54307(2016).">Killingsworth, M. C., Bobryshev, Y. V. Correlative light- and electron microscopy using quantum dot nanoparticles. Journal of Visualized Experiments. (114), e54307(2016).
  10. Quantum Dots: Applications in Biology. Bruchez, M. P., Hotz, C. Z., Ellisman, M. H. , Humana Press. 43-53 (2007).">Deerinck, T. J., Giepmans, B. N. G., Smarr, B. L., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Quantum Dots: Applications in Biology. Bruchez, M. P., Hotz, C. Z., Ellisman, M. H. , Humana Press. 43-53 (2007).
  11. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nature Methods. 2 (10), 743-749 (2005).">Giepmans, B. N. G., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nature Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
  12. Quantum dot ligands provide new insights into erbB/HER receptor-mediated signal transduction. Nature Biotechnology. 22 (2), 198-203 (2004).">Lidke, D. S., et al. Quantum dot ligands provide new insights into erbB/HER receptor-mediated signal transduction. Nature Biotechnology. 22 (2), 198-203 (2004).
  13. Differences in the functional activity of human neutrophilic granulocytes in their interactions with semiconductor quantum dots. Morfologiia. 135 (3), Saint Petersburg, Russia. 47-49 (2009).">Pleskova, S. N., et al. Differences in the functional activity of human neutrophilic granulocytes in their interactions with semiconductor quantum dots. Morfologiia. 135 (3), Saint Petersburg, Russia. 47-49 (2009).
  14. Quantum dot single molecule tracking reveals a wide range of diffusive motions of membrane transport proteins. Proceedings of SPIE. 7189, (2009).">Crane, J., Haggie, P., Verkman, A. Quantum dot single molecule tracking reveals a wide range of diffusive motions of membrane transport proteins. Proceedings of SPIE. 7189, (2009).
  15. Semiconductor quantum dot/albumin complex is a long-life and highly photostable endosome marker. Biochemical and Biophysical Research Communications. 302 (3), 496-501 (2003).">Hanaki, K. -i, et al. Semiconductor quantum dot/albumin complex is a long-life and highly photostable endosome marker. Biochemical and Biophysical Research Communications. 302 (3), 496-501 (2003).
  16. Selection of quantum dot wavelengths for biomedical assays and imaging. 2, 50-64 (2003).">Lim, Y. T., et al. Selection of quantum dot wavelengths for biomedical assays and imaging. 2, 50-64 (2003).
  17. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).">Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).
  18. Nanocrystal targeting in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (20), 12617-12621 (2002).">Åkerman, M. E., Chan, W. C. W., Laakkonen, P., Bhatia, S. N., Ruoslahti, E. Nanocrystal targeting in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (20), 12617-12621 (2002).
  19. Quantum dots in ophthalmology: A literature review. Current Eye Research. 44 (10), 1037-1046 (2019).">Sarwat, S. A. -O. X., Stapleton, F., Willcox, M., Roy, M. A. -O. Quantum dots in ophthalmology: A literature review. Current Eye Research. 44 (10), 1037-1046 (2019).
  20. Sigmar1's molecular, cellular, and biological functions in regulating cellular pathophysiology. Frontiers in Physiology. 12, 705575(2021).">Aishwarya, R., Abdullah, C. S., Morshed, M., Remex, N. S., Bhuiyan, M. S. Sigmar1's molecular, cellular, and biological functions in regulating cellular pathophysiology. Frontiers in Physiology. 12, 705575(2021).
  21. Processing the mouse temporal bone for gross, cellular and subcellular evaluation poster. , (2004).">Bohne, B., Harding, G. Processing the mouse temporal bone for gross, cellular and subcellular evaluation poster. , (2004).
  22. The effects of acute stress on Apold1 gene expression and blood-brain barrier permeability. , (2014).">Roszkowski, M. The effects of acute stress on Apold1 gene expression and blood-brain barrier permeability. , (2014).
  23. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-protocol. 11 (5), 3988(2021).">Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-protocol. 11 (5), 3988(2021).
  24. Ablation of the murine alpha myosin heavy chain gene leads to dosage effects and functional deficits in the heart. Journal of Clinical Investigation. 98 (8), 1906-1917 (1996).">Jones, W. K., et al. Ablation of the murine alpha myosin heavy chain gene leads to dosage effects and functional deficits in the heart. Journal of Clinical Investigation. 98 (8), 1906-1917 (1996).
  25. Practical Electron Microscopy: A Beginner's Illustrated Guide. , Cambridge University Press. (1993).">Hunter, E. E. Practical Electron Microscopy: A Beginner's Illustrated Guide. , Cambridge University Press. (1993).
  26. A universal post-embedding protocol for immunogold labelling of osmium-fixed, epoxy resin-embedded tissue. Journal of Electron Microscopy. 46 (4), 315-319 (1997).">Morris, R. E., Ciraolo, G. M. A universal post-embedding protocol for immunogold labelling of osmium-fixed, epoxy resin-embedded tissue. Journal of Electron Microscopy. 46 (4), 315-319 (1997).
  27. Deplasticizing or etching of epoxy sections with different concentrations of sodium ethoxide to enhance the immunogold labeling. Micron. 32 (2), 101-105 (2001).">Brorson, S. H. Deplasticizing or etching of epoxy sections with different concentrations of sodium ethoxide to enhance the immunogold labeling. Micron. 32 (2), 101-105 (2001).
  28. Ultrastructural Staining with Sodium Metaperiodate and Sodium Borohydride. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (1), 11-19 (2002).">Lobo, M. V. T., et al. Ultrastructural Staining with Sodium Metaperiodate and Sodium Borohydride. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (1), 11-19 (2002).
  29. Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels. Science. 281 (5385), 2013-2016 (1998).">Bruchez, M., Moronne, M., Gin, P., Weiss, S., Alivisatos, A. P. Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels. Science. 281 (5385), 2013-2016 (1998).
  30. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).">Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  31. Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1226-1240 (2008).">Smith, A. M., Duan, H., Mohs, A. M., Nie, S. Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1226-1240 (2008).
  32. Pharmaceutical applications of quantum dots. AAPS PharmSciTech. 22 (7), 233(2021).">Gour, A., Ramteke, S., Jain, N. K. Pharmaceutical applications of quantum dots. AAPS PharmSciTech. 22 (7), 233(2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Subcellular LocalizationQuantum DotsImmunolabeling TechniqueTransmission Electron MicroscopyHeart TissueSigma 1 ReceptorProtein LocalizationElectron MicroscopyAntigen UnmaskingStreptavidin Conjugated QD

Related Articles