Methodenartikel

Het genereren van een reproduceerbaar model van mid-gestationele maternale immuunactivatie met behulp van Poly (I: C) om gevoeligheid en veerkracht bij nakomelingen te bestuderen

DOI:

10.3791/64095

⸱

17 augustus 2022

 , 
1Center for Neuroscience, UC Davis

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Maternale infectie is een risicofactor voor neurologische ontwikkelingsstoornissen. Muismodellen van maternale immuunactivatie (MIA) kunnen de impact van infectie op de ontwikkeling en functie van de hersenen ophelderen. Hier worden algemene richtlijnen en een procedure gegeven om betrouwbaar veerkrachtige en gevoelige nakomelingen te produceren die zijn blootgesteld aan MIA.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Maternale immuunactivatie (MIA) tijdens de zwangerschap is consequent gekoppeld aan een verhoogd risico op neurologische en neuropsychiatrische stoornissen bij nakomelingen. Diermodellen van MIA worden gebruikt om causaliteit te testen, mechanismen te onderzoeken en diagnostiek en behandelingen voor deze aandoeningen te ontwikkelen. Ondanks hun wijdverbreide gebruik lijden veel MIA-modellen aan een gebrek aan reproduceerbaarheid en bijna allemaal negeren ze twee belangrijke aspecten van deze risicofactor: (i) veel nakomelingen zijn veerkrachtig tegen MIA en (ii) gevoelige nakomelingen kunnen verschillende combinaties van fenotypen vertonen. Om de reproduceerbaarheid te vergroten en zowel de gevoeligheid als de veerkracht voor MIA te modelleren, wordt de baseline immunoreactiviteit (BIR) van vrouwelijke muizen vóór de zwangerschap gebruikt om te voorspellen welke zwangerschappen zullen resulteren in veerkrachtige nakomelingen of nakomelingen met gedefinieerde gedrags- en moleculaire afwijkingen na blootstelling aan MIA. Hier wordt een gedetailleerde methode voor het induceren van MIA via intraperitoneale (i.p.) injectie van de dubbelstrengs RNA (dsRNA) virale mimic poly (I: C) na 12,5 dagen zwangerschap verstrekt. Deze methode induceert een acute ontstekingsreactie in de dam, wat resulteert in verstoringen in de hersenontwikkeling bij muizen die in kaart worden gebracht op vergelijkbare beïnvloede domeinen in menselijke psychiatrische en neurologische ontwikkelingsstoornissen (NDD's).

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epidemiologisch bewijs koppelt maternale infectie aan een verhoogd risico op psychiatrische en NDD's, waaronder schizofrenie (SZ) en autismespectrumstoornis (ASS)1,2,3,4,5,6,7. Het MIA-muismodel werd ontwikkeld om de causaliteit en de mechanistische rol van MIA in de etiologie van deze aandoeningen te testen, evenals om moleculaire biomarkers te identificeren en zowel diagnostische als therapeutische hulpmiddelen te ontwikkelen 4,6. Ondanks het nut van dit model en de toenemende populariteit ervan, is er een aanzienlijke variabiliteit in MIA-inductieprotocollen binnen het veld, waardoor het moeilijk is om resultaten tussen studies te vergelijken en bevindingen te repliceren 8,9. Bovendien onderzoeken de meeste iteraties van het model twee belangrijke translationele aspecten van MIA niet: (i) veel nakomelingen zijn bestand tegen MIA, en (ii) gevoelige nakomelingen kunnen verschillende combinaties van fenotypen8 vertonen.

Om een reproduceerbaar MIA-model te genereren, moeten onderzoekers ten minste één kwantitatieve meting rapporteren van de omvang van MIA geïnduceerd in dammen. Om MIA tijdens de zwangerschap te induceren, voert ons laboratorium intraperitoneale (i.p.) injecties uit van de dubbelstrengs RNA-virale mimiek polyinositisch: polycytidilic acid [poly(I:C)]. Poly(I:C) induceert een immuuncascade vergelijkbaar met influenzavirussen omdat het wordt herkend door toll-like receptor 3 (TLR3)10. Als gevolg hiervan activeert poly(I:C) de acute faserespons die resulteert in een snelle verhoging van pro-inflammatoire cytokines 8,11,12. Eerdere studies hebben aangetoond dat de verhoging van pro-inflammatoire cytokines, waaronder interleukine-6 (IL-6), noodzakelijk is om gedragsafwijkingen en neuropathologie bij nakomelingen te produceren als gevolg van MIA11,12,13. Het niveau van IL-6 in maternale serum verzameld tijdens de piek op 2,5 uur na poly (I: C) -injectie is dus een overtuigende kwantitatieve maat voor MIA die kan worden gebruikt om resultaten te vergelijken tussen laboratoria in het veld.

Om een MIA-model te genereren dat de translationeel essentiële elementen van veerkracht en gevoeligheid aanpakt met een enkel inductieprotocol 8,14, kunnen onderzoekers typische inductiebenaderingen combineren met karakterisering van de baseline immunoreactiviteit (BIR) van de moeder vóór zwangerschap8. Onlangs werd ontdekt dat maagdelijke vrouwelijke C57BL / 6-muizen een breed scala aan IL-6-reacties vertonen op een lage dosis blootstelling aan poly (I: C) vóór zwangerschap8. Het is slechts een subset van deze vrouwtjes die gevoelige nakomelingen produceren, en alleen bij bepaalde niveaus van immuunactivatie zoals gedicteerd door de combinatie van BIR en poly (I: C) dosis8. MIA induceert fenotypen in een omgekeerd U-patroon; Nakomelingen vertonen de grootste gedrags- en moleculaire afwijkingen wanneer moederdieren matig immunoreactief zijn en de omvang van maternale ontsteking een kritisch bereik8 bereikt, maar niet overschrijdt. Hier wordt een gedetailleerde methode gegeven voor het betrouwbaar creëren van zowel veerkrachtige als gevoelige nakomelingen met uiteenlopende gedragsfenotypen als gevolg van mid-gestationele injectie van poly (I: C).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle protocollen worden uitgevoerd onder de goedkeuring van de University of California-Davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Voorbereiding van dieren

  1. Houd bij het verkrijgen van dieren de volgende parameters consistent om maximale reproduceerbaarheid te garanderen.
    1. Locatie van leverancier en leverancier: zoals eerder gemeld, vertonen wildtype C57BL/6J-muizen verschillende reacties op dezelfde dosis poly (I: C), afhankelijk van de leverancier8. Kies een leverancier en muisstam die een consistente respons laten zien. Voor de experimenten hier vertoonden C57BL / 6-muizen verkregen van Charles River consistente gedragsveranderingen na blootstelling aan mid-gestationele MIA, terwijl die gekocht van Taconic een grotere magnituderespons vertonen, met enkele verschillen tussen behandelingsgroepen in vergelijking met Charles River-muizen8.
    2. Stam: C57BL/6J-muizen worden het meest gebruikt, maar BTBR-muizen en andere stammen vertonen differentiële reacties op mid-gestational MIA9. Let op deze differentiële responsen, omdat deze de reproduceerbaarheid van de methode verbeteren en een potentiële variabele kunnen zijn bij het bijdragen aan differentiële uitkomsten bij nakomelingen.
    3. Om minimale variabiliteit te garanderen, gebruikt u alleen maagdelijke vrouwen voor MIA-onderzoeken8 en noteert u duidelijk details in methoden.
    4. Leeftijd bij verzending en acclimatisatieperiode: muizen die vóór 7 weken zijn verzonden, vertonen ontregelde endocriene systemen15. Laat de dieren minimaal 48 uur16,17 acclimatiseren. Bestel muizen om te worden verzonden op 7 weken (± 2 dagen) en injecteer voor BIR op 8 weken (± 2 dagen).
    5. Leeftijd bij paring: het immuunsysteem van dieren is dynamisch gedurende hun levensduur. Zorg ervoor dat de variabiliteit wordt geminimaliseerd door de leeftijd bij paring / injectie zo consistent mogelijk te houden18,19,20. Paar vrouwelijke muizen na 9 weken (± 2 dagen). Gebruik geen mannetjes ouder dan 6 maanden voor de paring.

2. Poly (I: C) partij testen en voorbereiding

  1. Bereid poly (I:C) met een hoog molecuulgewicht zoals hieronder beschreven.
    1. Autoclaaf 1,5 ml microcentrifugebuizen voor opslag. Geresuspendeerd poly (I:C) kan worden bewaard bij -20 °C, maar herhaalde vriesdooien kunnen de potentie beïnvloeden. Verwarm het waterbad tot 70 °C.
    2. Voeg met behulp van een steriele techniek 10 ml steriele fysiologische zoutoplossing (NaCl 0,9%) toe aan gelyofiliseerde poly (I: C) met behulp van een spuit. Verwarm in een waterbad van 70 °C gedurende 15 minuten om volledig gloeien mogelijk te maken. Verwijder en laat afkoelen tot kamertemperatuur.
    3. Voeg in een steriele kap een extra 40 ml fysiologische zoutoplossing toe aan de fles en keer meerdere keren om om te mengen. Verwijder de bovenkant van de poly(I:C)-fles of gebruik een spuit om in microcentrifugebuizen van 1,5 ml te aliquoteren. Bewaren bij -20 °C.
  2. Bereid gemengd molecuulgewicht poly(I:C) zoals hieronder beschreven.
    1. Autoclaaf 1,5 ml microcentrifugebuizen voor opslag. Geresuspendeerd poly (I:C) kan worden bewaard bij -20 °C, maar herhaalde vriesdooien kunnen de potentie beïnvloeden. Stel het waterbad in op 50 °C.
    2. Voeg met behulp van een steriele techniek 10 ml steriele 0,9% NaCl toe aan gelyofiliseerde poly (I: C) en zet het deksel vast. Verwarm in een waterbad van 50 °C gedurende 25 minuten om volledig gloeien mogelijk te maken. Verwijder en laat afkoelen tot kamertemperatuur.
    3. Met behulp van steriele techniek, aliquot in 1,5 ml microcentrifugebuizen en bewaren bij -20 °C.
  3. Dien poly(I:C) toe via intraperitoneale (i.p.) injecties zoals hieronder beschreven.
    1. Weeg de muis om de juiste dosering te bepalen. Gebruik een insulinenaald van 0,5 cc om geresuspendeerd poly (I: C) op te trekken. Krab de muis en draai zodat de buik bloot komt te liggen.
    2. Steek met de andere hand de naald in tot een diepte van ongeveer 0,5 cm tussen de voorste twee tepels onder een hoek van ongeveer 45°.
    3. Trek op om te bepalen of er geen bloed of urine in de spuit komt voordat u injecteert. Als een van beide zich voordoet, verplaatst u de naald en probeert u het opnieuw. Injecteer langzaam. Als de poly(I:C) uitborrelt, was de injectie waarschijnlijk subcutaan. Een succesvolle injectieplaatsing zal ertoe leiden dat er niets wordt opgetrokken zodra de naald is ingebracht en niet lekt zodra deze is verwijderd.
  4. Test mmw poly(I:C) partij potentie zoals hieronder beschreven8.
    1. Verkrijg de gewenste vorm van poly (I: C). Sommige fabrikanten zullen onderzoekers toestaan om een volledige of gedeeltelijke partij vast te houden terwijl de potentie wordt getest, zodat later meerdere flessen tegelijkertijd kunnen worden verkregen. Meestal kunnen deze gelyofiliseerd worden bewaard bij -20 °C gedurende meerdere jaren als vries-dooi wordt vermeden.
    2. Verkrijg of fok 30 zwangere moederdieren om te testen. Voer bij E12.5 i.p.-injecties uit van 20, 30 en 40 mg/kg in minimaal 10 muizen per dosis.
    3. Verzamel 2,5 uur na de injectie bloed via een staartbloeding. Merk op dat perifeer bloed en stambloed kunnen verschillen in cytokineniveaus, dus houd de verzamelmethode consistent binnen een onderzoek.
    4. Laat het bloed een nacht stollen bij kamertemperatuur. Spin na 12-24 uur bloedmonsters af bij 3.768 x g bij 4 °C gedurende 8 minuten. Verzamel serum en bewaar bij -80 °C totdat het is geanalyseerd.
    5. Isoleer serum en meet IL-6-niveaus via ELISA of Luminex. Houd meetinstrumenten consistent, omdat er een aanzienlijke variabiliteit is in de totale concentratie gemeten met verschillende modaliteiten en fabrikanten. Bepaal de omvang van de IL-6-respons die nodig is om fenotypes te induceren met behulp van een pilotcohort.

3. Baseline immunoreactiviteit (BIR) testen

OPMERKING: Figuur 1 toont het schema van de stappen. Gebruik een ander molecuulgewicht poly (I: C) voor BIR-testen in vergelijking met zwangerschap, om de kans op adaptieve immuunresponsen op de verbinding te verlagen.

  1. Bestel maagdelijke vrouwelijke muizen om te worden verzonden op 7 weken oud. Bij aankomst, groep en huis vier tot vijf muizen in een kooi en houd groep gehuisvest totdat gedekt. Gebruik een inkeping van het oor of een ander identificatiesysteem.
  2. Injecteer vrouwtjes intraperitoneaal met 5 mg/kg poly(I:C) 1 week na aankomst. 2,5 uur na injectie, wanneer de circulerende IL-6 het hoogst is6, verzamelt u volbloed van geïnjecteerde dieren via staartsnip.
  3. Laat het bloed een nacht stollen bij kamertemperatuur. Spin na 12-24 uur bloedmonsters af bij 3.768 x g bij 4 °C gedurende 8 minuten.
  4. Verzamel minimaal 32 μL serum van elk monster. Bevries bij -80 °C totdat u klaar bent om te testen op cytokines. Om IL-6-niveaus zo consistent mogelijk te meten, gebruikt u een multiplextest zoals Luminex. Houd meetinstrumenten consistent, omdat er een aanzienlijke variabiliteit is in de totale concentratie gemeten met verschillende modaliteiten en fabrikanten.
    1. Voor luminex assay protocol, refereer je naar Bruce et al.21.
  5. Gebruik relatieve IL-6-niveaus en verdeel dieren in lage (onderste kwartiel), gemiddelde (middelste twee kwartielen) en hoge (hoogste kwartiel) BIR-groepen.

4. Staartbloedingsmethode voor bloedafname

OPMERKING: Om het gebruik van potentieel immunomodulerende sedativa te voorkomen, gebruikt u de staartbloedingsmethode van bloedafname.

  1. Om op te zetten, plaatst u een soldeerstandaard en een bevestigingsbeker op een oppervlak aan de zijkant van de niet-dominante hand. Voeg in een petrischaal van 35 mm 1-2 ml eetbare olie van voedingskwaliteit toe. Verwijder de dop van de snelle bloedstopper en plaats deze in de buurt van de opstelling.
  2. Plaats een paar lagen keukenpapier op de soldeerstandaard en de eerste capillaire buis in een clip, plaats deze in de buurt van waar de staartpunt van de muis wordt vastgehouden en parallel aan het oppervlak van de tafel wordt gehouden. Houd een scheermesje bij de hand.
  3. Voer de volgende stappen uit om het bloed te verzamelen.
    1. Verwijder op het gewenste moment de muis uit de kooi en plaats deze onder de beker met de staart die uit de inkeping aan de basis komt. Knip met een vers scheermesje het uiteinde (1-2 mm) van de staart eraf en vang de eerste druppel bloed op in de capillaire buis die aan de soldeerstandaard is vastgeklemd.
    2. Dompel vingers van de dominante hand in de eetbare olie en gebruik om van de basis van de staart naar de punt te knijpen, waarbij de staartpunt naar de capillaire buis wordt geleid om de resulterende druppels bloed te verzamelen. Ga door totdat ~200 μL bloed is verzameld.
    3. Plaats een kleine einddop op het taps toelopende uiteinde van de capillaire buis vóór de bovenste dop. Als de bovenste dop eerst wordt geplaatst, wordt het monster uit het taps toelopende uiteinde van de buis verwijderd. Plaats de buis in de beschermende buitenschaal.
    4. Laat een nacht stollen bij kamertemperatuur. Koel een microcentrifuge af tot 4 °C en spin het bloed af zoals vermeld in stap 3.3.

figure-protocol-1
Figuur 1. De tijdlijn voor het testen van de baseline immunoreactiviteit en paring van maagdelijke vrouwtjes. Bestel muizen om 7 weken oud te worden en laat ze 1 week wennen aan de faciliteit. Injecteer dieren met 5 mg/kg poly(I:C) en 2,5 uur later bloed afnemen. Laat het bloed een nacht stollen, centrifugeer vervolgens bij 3.768 x g, 4 °C gedurende 8 minuten. Verzamel serum en beoordeel relatieve IL-6-niveaus via ELISA of Multiplex. Stel op 9 weken oud paringsparen in. Gemaakt met BioRender.com Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Op gewicht gebaseerde methode voor paring en zwangerschapsinjectie E12.5

OPMERKING: Figuur 2 toont het schema van de stappen. Er kunnen twee methoden worden gebruikt om paringsparen in te stellen en het E12.5-tijdstip te bepalen. De eerste, getimede paring, wordt elders beschreven22. Op gewicht gebaseerde berekeningen kunnen ook worden gebruikt om te beoordelen op een E12.5-zwangerschap23. Het voordeel van deze aanpak is dat het tijdvergrendeling van de leeftijd van de moeder bij de paring mogelijk maakt, waardoor de variabiliteit in de immuunrespons afneemt. Deze procedure wordt hier gebruikt.

  1. Plaats mannetjes in schone kooien en laat ze minimaal 2 uur acclimatiseren. Dit vermindert de kans op vrouwelijke agressie, omdat mannetjes al een dominante geur in de kooi zullen vormen.
  2. Stel enkele mannelijke, enkele vrouwelijke broedparen in door het vrouwtje aan de kooi van het mannetje toe te voegen. Voordat u haar in de kooi plaatst, weegt u haar en noteert u het gewicht. Voeg een klein handjevol zonnebloempitten toe aan elke kooi om de paringsefficiëntie te verhogen.
  3. Voer de volgende stappen uit om het bereik van de gewichtstoename te bepalen.
    1. Verkrijg een testgroep van vrouwtjes en stel paringsparen in, waarbij het gewicht wordt geregistreerd op het moment van paring.
    2. Wanneer vrouwtjes zichtbaar zwanger beginnen te lijken, weeg ze dan en verdeel ze in subsets van 8,5 g, 9,5 g, 10,5 g en 11,5 g gewichtstoename. Foetussen op E12.5 zijn net begonnen met het ontwikkelen van verschillende cijfers in hun poten. Gebruik foetale morfologie om de gemiddelde gewichtstoename te bepalen om E12.5 te bereiken.
  4. Weeg 12 dagen na de paring vrouwtjes en bepaal de gewichtstoename. In een testfaciliteit krijgen vrouwtjes consequent 9,5-10,5 g vanaf het moment van paring tot E12,5. Injecteer via i.p. de dosis opgeloste poly(I:C) bepaald in stap 2.3.2 wanneer de gewichtstoename van de vrouw binnen het vooraf bepaalde bereik valt.
  5. Observeer de respons op MIA in dammen met behulp van de volgende parameters.
    1. Ziektegedrag: Verzamel subjectieve scores op een schaal van 1-3 voor hoe actief dammen worden als reactie op het hanteren, waarbij 1 weinig of geen beweging is als reactie op het hanteren en 3 een normale reactie is op vastleggen en terughoudendheid. Dieren met een grotere immuunrespons zullen minder weerstand vertonen tegen hantering8.
    2. Koortsrespons: Verzamel met behulp van een IR-thermometer de temperaturen vóór de injectie en 2,5 uur na de injectie. Dieren met een grotere immuunrespons vertonen vaak onderkoeling als reactie op een grotere immuunactiviteit8.
    3. Gewichtsverandering: Weeg de dieren 24 uur na de injectie. Dieren met een grotere immuunrespons verliezen over het algemeen meer gewicht8.
    4. Meet zwangerschaps-IL-6-niveaus als volgt8.
      1. Verzamel 2,5 uur na de injectie bloed met de voorkeursmethode. Laat het bloed een nacht stollen bij kamertemperatuur. Spin na 12-24 uur bloedmonsters af bij 3.768 x g bij 4 °C gedurende 8 minuten.
      2. Verzamel serum en bewaar bij -80 °C totdat het is geanalyseerd. Isoleer serum en meet IL-6-niveaus via ELISA of Luminex. Houd meetinstrumenten consistent, omdat er een aanzienlijke variabiliteit is in de totale concentratie gemeten met verschillende modaliteiten en fabrikanten.
      3. Salone huisvesten de dam na injectie met de juiste verrijking zoals nestjes en verrijkingsapparaten. Houd alle verrijking consistent, omdat veranderingen in verrijking aanzienlijke gevolgen kunnen hebben voor het gedrag van knaagdieren 24,25,26,27,28,29.
  6. De draagtijd voor C57-muizen varieert van 18,5-20,5 dagen. Voer strooiselcontroles uit om te bepalen of dieren binnen dit bereik zijn geboren om ervoor te zorgen dat de injectie op het juiste tijdstip is uitgevoerd. Verstoor bij het controleren op nesten de kooi zo min mogelijk. Stress direct nadat het nest is geboren, kan het risico op kannibalisatie verhogen.

figure-protocol-2
Figuur 2. MIA inductie. MIA-inductie vereist beoordeling van zwangerschap, i.p. injectie van poly (I: C) en nestcontroles om de juiste timing van maternale ontsteking te garanderen. Na het beoordelen van de zwangerschapsdag, hetzij via getimede paring of de gewichtstoenamemethode, een i.p. injectie van poly (I: C) bij E12.5. Verzamel een bloedmonster 2,5 uur na injectie om de immuunactivering te bevestigen en het niveau van IL-6-activering te bepalen. Nesten worden geboren op ongeveer E18.5-E20.5. Gemaakt met BioRender.com Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Onderzoek naar gedragsveranderingen bij volwassen MIA en controle-nakomelingen (optioneel)

  1. Vanaf P60 en voordat gedragstests worden uitgevoerd, moeten dieren gedurende 3 opeenvolgende dagen 1 minuut per dag acclimatiseren aan menselijk contact met zachte hantering. Zorg ervoor dat kooiwisseldagen niet plaatsvinden op dezelfde dag dat gedragstests worden uitgevoerd.
  2. Laat muizen altijd 30-60 minuten wennen aan de testruimte voordat ze met gedragstests beginnen. Gebruik slecht verlichte (15-20 lux) kamers om angst te minimaliseren.
  3. Voor repetitieve verzorging, plaats muizen alleen in schone, beddengoedvrije kooien met deksels. Neem met behulp van een camera de muizen in deze kooien gedurende 20 minuten vast. De eerste 10 minuten fungeren als een acclimatisatieperiode, de laatste 10 minuten zijn de testperiode.
  4. Gebruik opgeslagen video's en een stopwatch om de cumulatieve verzorgingstijd voor elke muis te scoren tijdens de testperiode van 10 minuten. Andere gedragingen die uit deze video's kunnen worden gescoord, zijn onder meer opfokken (op achterpoten staan), bevriezen en springen8.
  5. Gebruik andere veelgebruikte tests voor het MIA-model, zoals prepulse inhibition (PPI) 14,30,31,32, open veld12,33,34, 3-kamer sociale benadering 13,35,36, nieuwe objectherkenning 37, y-doolhof 30, verhoogd plus doolhof33 en context/cued angstconditionering 38.
  6. Postnatale immunoblotting8 (optioneel)
    1. Onthoofd bij P0 snel en ontleed foetaal hersenweefsel in HBSS, vries in vloeibare stikstof in en bewaar bij −80 °C.
    2. Verstoor monsters met behulp van een sonde-sonicator met een amplitude van 20% gedurende 5 s in 2x Laemmli-buffer en denatureer vervolgens bij 85 °C gedurende 5 minuten. Centrifugeer lysaat bij 16.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verzamel supernatant en bewaar bij -80 °C.
    3. Meet het totale eiwitgehalte met behulp van een commerciële BCA-eiwittestkit, volgens de instructies van de fabrikant, en gebruik runderserumalbumine als kalibratiestandaard.
    4. Voeg dithiothreitol als reductiemiddel toe aan de monsters als een eindconcentratie van 100 mM. Verwarm tot 85 °C gedurende 2 minuten voordat u op een gel laadt.
    5. Voer 5 μg/lane eiwit uit onder reducerende omstandigheden op 7,5% TGS-gels en breng elektroforetisch over op PVDF-membranen. Blokkeer membranen met blokkerende buffer en incubeer met gekozen antilichamen.
    6. Was drie keer met TBS + 0,05% Tween 20 en incubeer de membranen gedurende 45 minuten met fluorescerende secundaire antilichamen.
    7. Was nog eens vier keer in TBS/Tween 20 en afbeeldingsresultaten. Standaardiseer resultaten met behulp van β-tubuline, gedetecteerd met anti-β-tubuline.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niet alle dieren die worden blootgesteld aan 30 mg/kg poly(I:C) bij E12,5 produceren nakomelingen met consistente gedragsafwijkingen 8,31. Hoewel zowel 30 mg/kg als 40 mg/kg poly(I:C) op betrouwbare wijze ziektegedrag bij moederdieren produceren, waaronder verminderde activiteitsniveaus, hypothermische reacties en gewichtsverlies, en ook significante verhogingen in IL-6 veroorzaken, zal slechts een subset van nesten blootgesteld aan MIA gedragsafwijkingen ontwikk...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Maternale infectie verandert het verloop van de hersenontwikkeling bij mensen en bij zowel knaagdieren als niet-menselijke primaten 4,5,7. Hier wordt een procedure beschreven om MIA bij muizen te induceren op een punt halverwege de zwangerschap met behulp van poly (I: C). Deze methode omvat de beoordeling van BIR vóór de zwangerschap, wat de reproduceerbaarheid verhoogt en de kans biedt om mechanistisch mechanismen te onderzoeke...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Dr. Myka Estes voor haar volharding in het aanpakken van variabiliteit in het muis MIA-model en alle bijdragers in Estes et al.8 voor hun werk dat heeft geleid tot de ontwikkeling van het hier beschreven methodenprotocol. Het hier gerapporteerde onderzoek werd ondersteund door NIMH 2P50 MH106438-06 (A.K.M.) en NIMH T32MH112507 (K.P.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.9% NaCl fysiologische endotoxin-vrije zoutoplossingSigma-Aldrich7647-14-5Controle en voertuig voor Poly(I:C)
35mm petrischaalThomas Scientific1219Z45Gebruikt om olie vast te houden tijdens staartbloeding
7.5% TGX gelsBio-rad4561084Optioneel
Ancare NestletsFisher ScientificNC9365966Optioneel
anti-β-tubulineMilliporeMAB3408Optioneel
Bio-Plex Pro Muis Cytokine Standaard Groep IBio-rad171I50001
Bio-Plex Pro Reagens Kit met Platte PlaatBio-rad171304070M
Bovine Serum AlbumineThermoFisher23209Optioneel
CentrifugeEppendorf5810ROptioneel
Covidien Monoject 1/2 mL Insuline Spuit met 28G x 1/2 in. NaaldSpectrum552-58457-083
DithiothreitolSigma-AldrichD9779-10GOptioneel
OmgevingsverrijkingBio-servK3327 en K3322Optioneel
EthovisionNoldusEthovisionOptioneel
Fluorescent-gelabelde secundaire antilichamenLi-cor925-32213 en 925-68072Optioneel
Voedselkwaliteit eetbare olie (zoals olijfolie, koolzaad of druivenpit)Verschillende leveranciersGebruik om staart te smeren tijdens staartbloedingen
HBSSThermoFisher14060040Optioneel
Polyinositisch:polycytidylzuur met hoog molecuulgewichtInvivogen#tlrl-pic-5Gebruikt om BIR van vrouwtjes vast te stellen
Humane MuisbegrenzerAIMS1000Gebruikt om muis vast te houden tijdens staartbloedingen
Image Studio SoftwareLicor5.2Optioneel
Laemmli bufferBio-rad1610737EDUOptioneel
Luminex200ThermoFisherAPX10031
Microvette CB300 300μl Serum capillaire buisSarstedt16.440.100
Polyinositisch:polycytidylzuur met gemengd molecuulgewichtSigma-Aldrich#P0913Gestationele inductie van MIA
monoklonaal anti-MEF2AAbCamab76063Optioneel
monoklonaal anti-STAT3Cell signaling12640SOptioneel
ObserverNoldusObserverOptioneel
Odyssey blokkerende buffer (TBS)Li-cor927-50003Optioneel
Odyssey CLx beeldvormingssysteemLi-cor9140Optioneel
Omnipure PBSMillipore65054LOptioneel
Pierce BCA Eiwit Assay KitThermoFisher23227Optioneel
polyklonaal anti_THPel-FreezP4101-150Optioneel
PVDF membraanBio-rad162-0177Optioneel
Qsonica Sonicator Q500Fisher Scientific15-338-282Optioneel
Snelle bloedstopperPetco17140
Seal-Rite 1,5 ml microcentrifugebuis, natuurlijk niet-sterielUSA Scientific1615-5500
SoldeerstandAmazonB08Y12QC73Gebruikt om capillaire buis vast te houden tijdens staartbloedingen
ZonnebloempittenBio-servS5137-1Gebruik om kweekefficiëntie te verhogen
De Bio-Plex Pro Muis IL-6 set,Bio-rad171G5007M
Tris baseFisher ScientificBP152-1Optioneel
Tween 20Bio-rad23209Optioneel

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Adams, W., Kendell, R. E., Hare, E. H., Munk-Jørgensen, P. Epidemiological evidence that maternal influenza contributes to the aetiology of schizophrenia. An analysis of Scottish, English, and Danish data. The British Journal of Psychiatry: The Journal of Mental Science. 163 (4), 522-534 (1993).
  2. Brown, A. S., et al. Serologic evidence of prenatal influenza in the etiology of schizophrenia. Archives of General Psychiatry. 61 (8), 774-780 (2004).
  3. Brown, A. S., Derkits, E. J. Prenatal infection and schizophrenia: a review of epidemiologic and translational studies. The American Journal of Psychiatry. 167 (3), 261-280 (2010).
  4. Patterson, P. H. Immune involvement in schizophrenia and autism: etiology, pathology and animal models. Behavioural Brain Research. 204 (2), 313-321 (2009).
  5. Patterson, P. H. Maternal infection and immune involvement in autism. Trends in Molecular Medicine. 17 (7), 389-394 (2011).
  6. Estes, M. L., McAllister, A. K. Immune mediators in the brain and peripheral tissues in autism spectrum disorder. Nature Reviews. Neuroscience. 16 (8), 469-486 (2015).
  7. Estes, M. L., McAllister, A. K. Maternal immune activation: Implications for neuropsychiatric disorders. Science. 353 (6301), 772-777 (2016).
  8. Estes, M. L., et al. Baseline immunoreactivity before pregnancy and poly(I:C) dose combine to dictate susceptibility and resilience of offspring to maternal immune activation. Brain, Behavior and Immunity. 88, 619-630 (2020).
  9. Kentner, A. C., et al. Maternal immune activation: reporting guidelines to improve the rigor, reproducibility, and transparency of the model. Neuropsychopharmacology. 44 (2), 245-258 (2019).
  10. Zhou, Y., et al. TLR3 activation efficiency by high or low molecular mass poly I:C. Innate Immunity. 19 (2), 184-192 (2013).
  11. Hsiao, E. Y., Patterson, P. H. Activation of the maternal immune system induces endocrine changes in the placenta via IL-6. Brain, Behavior and Immunity. 25 (4), 604-615 (2011).
  12. Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  13. Choi, G. B., et al. The maternal interleukin-17a pathway in mice promotes autism-like phenotypes in offspring. Science. 351 (6276), 933-939 (2016).
  14. Meyer, U. Neurodevelopmental resilience and susceptibility to maternal immune activation. Trends in Neurosciences. 42 (11), 793-806 (2019).
  15. Laroche, J., Gasbarro, L., Herman, J. P., Blaustein, J. D. Reduced behavioral response to gonadal hormones in mice shipped during the peripubertal/adolescent period. Endocrinology. 150 (5), 2351-2358 (2009).
  16. Aguila, H. N., Pakes, S. P., Lai, W. C., Lu, Y. S. The effect of transportation stress on splenic natural killer cell activity in C57BL/6J mice. Laboratory Animal Science. 38 (2), 148-151 (1988).
  17. Landi, M. S., Kreider, J. W., Lang, C. M., Bullock, L. P. Effects of shipping on the immune function in mice. American Journal of Veterinary Research. 43 (9), 1654-1657 (1982).
  18. Menees, K. B., et al. Sex- and age-dependent alterations of splenic immune cell profile and NK cell phenotypes and function in C57BL/6J mice. Immunity & Ageing. 18 (1), 3(2021).
  19. Shaw, A. C., Goldstein, D. R., Montgomery, R. R. Age-dependent dysregulation of innate immunity. Nature Reviews Immunology. 13 (12), 875-887 (2013).
  20. Starr, M. E., Saito, M., Evers, B. M., Saito, H. Age-associated increase in Cytokine production during systemic inflammation-II: the role of IL-1beta in age-dependent IL-6 upregulation in adipose tissue. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 70 (12), 1508-1515 (2015).
  21. Bruce, M., et al. Acute peripheral immune activation alters cytokine expression and glial activation in the early postnatal rat brain. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 200(2019).
  22. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Animal. 38 (9), 305-310 (2009).
  23. Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
  24. Hutchinson, E., Avery, A., VandeWoude, S. Environmental enrichment for laboratory rodents. ILAR Journal. 46 (2), 148-161 (2005).
  25. Bayne, K. Environmental enrichment and mouse models: Current perspectives. Animal Models and Experimental Medicine. 1 (2), 82-90 (2018).
  26. Toth, L. A., Kregel, K., Leon, L., Musch, T. I. Environmental enrichment of laboratory rodents: the answer depends on the question. Comparative Medicine. 61 (4), 314-321 (2011).
  27. Sparling, J. E., Barbeau, K., Boileau, K., Konkle, A. T. M. Environmental enrichment and its influence on rodent offspring and maternal behaviours, a scoping style review of indices of depression and anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 197, 172997(2020).
  28. Xiao, R., Ali, S., Caligiuri, M. A., Cao, L. Enhancing effects of environmental enrichment on the functions of natural killer cells in mice. Frontiers in Immunology. 12, 695859(2021).
  29. Girbovan, C., Plamondon, H. Environmental enrichment in female rodents: considerations in the effects on behavior and biochemical markers. Behavioural Brain Research. 253, 178-190 (2013).
  30. Mueller, F. S., Polesel, M., Richetto, J., Meyer, U., Weber-Stadlbauer, U. Mouse models of maternal immune activation: Mind your caging system. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 643-660 (2018).
  31. Mueller, F. S., et al. neuroanatomical, and molecular correlates of resilience and susceptibility to maternal immune activation. Molecular Psychiatry. 26 (2), 396-410 (2021).
  32. Nyffeler, M., Meyer, U., Yee, B. K., Feldon, J., Knuesel, I. Maternal immune activation during pregnancy increases limbic GABAA receptor immunoreactivity in the adult offspring: implications for schizophrenia. Neuroscience. 143 (1), 51-62 (2006).
  33. Babri, S., Doosti, M. H., Salari, A. A. Strain-dependent effects of prenatal maternal immune activation on anxiety- and depression-like behaviors in offspring. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 164-176 (2014).
  34. Vigli, D., et al. Maternal immune activation in mice only partially recapitulates the autism spectrum disorders symptomatology. Neuroscience. 445, 109-119 (2020).
  35. Malkova, N. V., Yu, C. Z., Hsiao, E. Y., Moore, M. J., Patterson, P. H. Maternal immune activation yields offspring displaying mouse versions of the three core symptoms of autism. Brain, Behavior, and Immunity. 26 (4), 607-616 (2012).
  36. Shin Yim, Y., et al. Reversing behavioural abnormalities in mice exposed to maternal inflammation. Nature. 549 (7673), 482-487 (2017).
  37. Ito, H. T., Smith, S. E., Hsiao, E., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters nonspatial information processing in the hippocampus of the adult offspring. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (6), 930-941 (2010).
  38. Zuckerman, L., Weiner, I. Maternal immune activation leads to behavioral and pharmacological changes in the adult offspring. Journal of Psychiatric Research. 39 (3), 311-323 (2005).
  39. Mueller, F. S., Polesel, M., Richetto, J., Meyer, U., Weber-Stadlbauer, U. Mouse models of maternal immune activation: Mind your caging system. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 643-660 (2018).
  40. Careaga, M., Murai, T., Bauman, M. D. Maternal immune activation and autism spectrum disorder: from rodents to nonhuman and human primates. Biological Psychiatry. 81 (5), 391-401 (2017).
  41. Lazic, S. E., Essioux, L. Improving basic and translational science by accounting for litter-to-litter variation in animal models. BMC Neuroscience. 14, 37(2013).
  42. Spencer, S. J., Meyer, U. Perinatal programming by inflammation. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 1-7 (2017).
  43. Mouihate, A., Kalakh, S. Maternal Interleukin-6 hampers hippocampal neurogenesis in adult rat offspring in a sex-dependent manner. Developmental Neuroscience. 43 (2), 106-115 (2021).
  44. Zhang, Z., van Praag, H. Maternal immune activation differentially impacts mature and adult-born hippocampal neurons in male mice. Brain, Behavior, and Immunity. 45, 60-70 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Poly I C modelneurodevelopmentale stoornissenmuiszwangerschapsmodelvatbaarheid van nakomelingenveerkracht van nakomelingenbaseline immunoreactiviteitintraperitoneale injectieacute inflammatoire responshersenontwikkeling

Gerelateerde artikelen