Er zijn verschillende diermodellen van longfibrose opgesteld met behulp van bleomycine om de pathogenese van longfibrose te verduidelijken en nieuwe medicijndoelen te vinden. De meeste longfibrosemodellen die gericht zijn op longweefsel hebben echter een ongelijke toediening van geneesmiddelen. Hier stellen we een model voor van uniforme longfibrose geïnduceerd door nasale bleomycine-verneveling.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een muismodel van longfibrose geïnduceerd door nasale bleomycineverneveling
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Longfibrose is kenmerkend voor verschillende menselijke longziekten die door verschillende oorzaken ontstaan. Aangezien de behandelingsopties vrij beperkt zijn, blijven muismodellen een belangrijk hulpmiddel voor het ontwikkelen van nieuwe antifibrotische strategieën. In deze studie wordt intrapulmonale toediening van bleomycine (BLM) uitgevoerd door neusverneveling om een muismodel van longfibrose te creëren dat de klinische ziektekenmerken nauw nabootst. C57BL/6-muizen kregen BLM (7 E/ml, 30 min/dag) door neusverneveling gedurende 3 opeenvolgende dagen en werden op dag 9, 16 of 23 geofferd om inflammatoire en fibrotische veranderingen in longweefsel te observeren. Nasale vernevelde BLM was direct gericht op de longen, wat resulteerde in wijdverspreide en uniforme longontsteking en fibrose. Zo hebben we met succes een experimenteel muismodel gegenereerd van typische menselijke longfibrose. Deze methode kan gemakkelijk worden gebruikt om de effecten van de toediening van verschillende neusaerosolen op de pathofysiologie van de longen te bestuderen en nieuwe ontstekingsremmende en antifibrotische behandelingen te valideren.
Inleiding
Longfibrose is een progressief ziekteproces waarbij overmatige afzetting van extracellulaire matrixcomponenten, voornamelijk type I collageen, in het interstitium van de longen leidt tot een verminderdelongfunctie. De pathofysiologie van longfibrose is complex en de behandelingsopties zijn momenteel vrij beperkt. Muismodellen blijven een belangrijk hulpmiddel om de pathogene mechanismen te bestuderen die bijdragen aan het ontstaan en de progressie van de ziekte, evenals nieuwe strategieën voor de ontwikkeling van geneesmiddelen.
Een verscheidenheid aan diermodellen van longfibrose is gebaseerd op intratracheale instillatie van BLM 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. De verdeling van fibrotische veranderingen die BLM in de longen veroorzaakt, is echter niet uniform en de dieren lopen het risico te stikken tijdens het instillatieproces. Hoewel intraperitoneale injectie van BLM relatief uniforme fibrotische veranderingen in de long induceert, zijn er meerdere doses nodig vanwege onvoldoende doelgerichtheid op het geneesmiddel. Intratracheale aërosoltoediening via een laryngoscoop vereist geen tracheotomie of punctie en de resulterende medicijnverdeling in de long is optimaal. De vernevelde deeltjes zijn echter groot (5-40 μm) en kunnen dus het subpleurale gebied van het longweefsel niet bereiken.
In deze studie wordt intrapulmonale toediening van BLM uitgevoerd door neusverneveling. Tijdens de verneveling ademden de muizen spontaan en inhaleerden ze de medicijndeeltjes. De vernevelde deeltjes waren 2,5-4 μm groot, waardoor ze zich niet alleen gelijkmatig over de long konden verspreiden, maar ook het subpleurale gebied konden bereiken. Bij lage vergroting zijn de meest significante histopathologische kenmerken van de longen van patiënten met idiopathische longfibrose (IPF) de variërende ernst van laesies, inconsistente verdeling, afwisselende verdeling van laesies in verschillende fasen en de aanwezigheid van interstitiële ontsteking, fibrotische laesies en honingraatlongveranderingen, afgewisseld met normaal longweefsel. Deze pathologische veranderingen hebben voornamelijk betrekking op het perifere subpleurale parenchym of lobulair septum rond de bronchioli. Aangezien deze benadering het mogelijk maakt dat BLM-deeltjes het subpleurale gebied van de longen bereiken, simuleert dit model dus nauwkeurig de klinische kenmerken van de ziekte bij mensen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het Animal Studies Committee van het China-Japan Friendship Hospital (Beijing, China) keurde alle procedures met muizen goed die in het kader van deze studie werden uitgevoerd (NO.190108). Muizen werden gehouden in de steriele dierenkamer van het China-Japan Friendship Clinical Medical Research Institute, met een kamertemperatuur van 20-25 °C, relatieve vochtigheid van 40%-70%, dierlijke lichtintensiteit van 15-20 LX en afwisselend licht en donker gedurende 12 uur/12 uur. Dieren hadden vrije toegang tot voedsel en water.
1. Muizen
- Zorg ervoor dat alle dieren 7 dagen voor de verneveling aan de huisvesting zijn geacclimatiseerd.
- Gebruik mannelijke C57BL/6 muizen van 8-10 weken oud voor verneveling.
2. Nasale bleomycine-verneveling
- Bleomycine preparaat
LET OP: BLM is een chemisch gif dat tumoren doodt, maar ook normale cellen en normale weefsels kan beschadigen.- Bereid BLM-oplossing voor op een schone bank.
- Om de werkconcentratie (7 E/ml) te verkrijgen, resuspendeert u 15 E BLM-hydrochloride in 2,14 ml normale zoutoplossing. Meng de geresuspendeerde BLM voorzichtig totdat deze volledig is opgelost.
- Bewaar de werkoplossing bij 4 °C of op ijs en gebruik binnen 1 dag. Breng de BLM-oplossing vóór de verneveling op kamertemperatuur.
- Bereid BLM-oplossing voor op een schone bank.
- Anesthesie
- Bereid u voor op anesthesie door 0,1 g pentobarbital-natrium op te lossen in 10 ml normale zoutoplossing. Bewaar de werkende anesthesieoplossing op een donkere plaats bij 4 °C en gebruik binnen 3 dagen.
- Verdoof de muizen door het pentobarbital-natrium in de buik te injecteren, met behulp van een spuit van 1 ml met een naald van 26 G, in een einddosis van 75 mg/kg lichaamsgewicht.
OPMERKING: In deze studie reageerden de muizen gedurende ten minste 30 minuten niet op deze dosis. Pas indien nodig de dosis in overleg met de dierenarts aan op basis van de reactie van de muis. - Druk na een paar minuten met de wijsvinger en duim op de tenen van de verdoofde muis om ervoor te zorgen dat de terugtrekkingsreflex van de ledematen is verdwenen.
- Voorbereiding van het vernevelingssysteem
- Nadat u het instrument hebt gekalibreerd, zet u de verdoofde muis vast met een zachte gaasafdekking (Figuur 1A), voegt u de werkende BLM-oplossing toe aan de bovenste verstuivingskop van de belichtingstoren met een pipet (Figuur 1B) en laat u de vernevelaar 30 minuten draaien om een stabiele verneveling te bereiken.
OPMERKING: De workflow wordt weergegeven in afbeelding 1C,D. Voor gedetailleerde bedieningsstappen van de software raadpleegt u Aanvullende afbeelding S1 en Aanvullende afbeelding S2, die de stappen 2.3.1.1-2.3.1.9 illustreren.- Dubbelklik op het pictogram flexiWare 8 (aanvullende afbeelding S1A), klik op de experimenteersessie (aanvullende afbeelding S1B) en klik op de knop Nieuwe studie (aanvullende afbeelding S1C).
- Bewerk de naam van het experiment (aanvullende afbeelding S1D) en bewerk de titel en eigenaar (aanvullende afbeelding S1E).
- Kies de IX-4DIO-sjabloon (aanvullende afbeelding S1F), voer de operator in (aanvullende afbeelding S1G), klik op de knop Bevestigen (aanvullende afbeelding S1H) | Volgende knop (aanvullende afbeelding S1I).
- Kies de pomp en klik op volgende (aanvullende afbeelding S1J) | Volgende knop (Aanvullende afbeelding S2A) | Volgende knop (aanvullende afbeelding S2B) | Finish-knop (aanvullende afbeelding S2C).
- Klik op de Instellingen voor Continuous-1Lmin (drie puntjes, aanvullende figuur S2D) | DIO1, stel de inschakelduur (%) in op 25% en klik vervolgens op OK (aanvullende afbeelding S2E).
- Klik op DIO2, stel de inschakelduur (%) in op 25% en klik vervolgens op OK (aanvullende afbeelding S2F).
- Klik op DIO3, stel de inschakelduur (%) in op 25% en klik vervolgens op OK (aanvullende afbeelding S2G).
- Klik op DIO4, stel de inschakelduur (%) in op 25% en klik vervolgens op OK (aanvullende afbeelding S2H).
- Klik op de bovenste groene knop (links) om de werking te starten en klik op de rode knop (rechts) om het werk te stoppen. Klik op de x in de rechterbovenhoek om te stoppen (aanvullende afbeelding S2I).
- Vernevel in de BLM-groep 12 muizen tegelijk, in totaal vier keer, tot een totaal van 48 muizen. Vernevel zes muizen tegelijk in de normale controlegroep met normale zoutoplossing.
- Nadat u het instrument hebt gekalibreerd, zet u de verdoofde muis vast met een zachte gaasafdekking (Figuur 1A), voegt u de werkende BLM-oplossing toe aan de bovenste verstuivingskop van de belichtingstoren met een pipet (Figuur 1B) en laat u de vernevelaar 30 minuten draaien om een stabiele verneveling te bereiken.
- Herstel van dieren
- Verplaats de muis na behandeling in de vernevelaar gedurende 30 minuten naar een herstelkooi die is uitgerust met een verwarmingskussen.
- Observeer de muizen totdat ze volledig bij bewustzijn zijn.
- Zodra is bevestigd dat de muis in goede staat verkeert, wat betekent dat hij vrij kan bewegen, plaatst u hem terug in zijn originele kooi. Plaats het niet bij andere dieren totdat het volledig is hersteld.
- Controleer de fysiologische indexen, waaronder ademhalingsfrequentie, overleving en eventuele symptomen, tweemaal gedurende de 24 uur na de behandeling met BLM.
3. Verwerking van longweefsel
- Offer 9, 16 en 23 dagen na toediening van BLM zes muizen op door ze in de buik te injecteren met pentobarbitalnatrium (einddosis 100 mg/kg lichaamsgewicht).
- Verwijder de luchtpijp en longen en spoel onmiddellijk met koude, met fosfaat gebufferde zoutoplossing.
- Fixeer de linkerlong gedurende 24 uur in een 10% neutrale formalinebuffer voordat paraffine wordt ingebed.
- Hematoxyline-eosine kleuring (H&E kleuring)
- Dehydrateer het gefixeerde longweefsel in een dehydrator.
- Plaats het gedehydrateerde longweefselblok gedurende 1 uur in een wasoplossende doos bij 56 °C.
- Giet voor het inbedden de gesmolten paraffine in de vormdoos en plaats vervolgens snel het met paraffine geïmpregneerde tissueblok op de bodem van de vormdoos, koel af en stol.
- Bevestig het ingebedde wasblok op de microtoom, stel de snijtafel op en neer in een geschikte positie, duw op het mes, pas de schaal aan en snijd een plak met een dikte van 4 μm. Gebruik een pincet om de plak in een displaydoos gevuld met water te plaatsen om te ontkrullen (voorkant naar boven).
- Lap en bak de plakjes. Nadat het wasschijfje volledig is ontkruld, plaatst u het glasplaatje in een hoek van 135° tegen het wasplaatje, gebruikt u een pincet om het wasplaatje op het glasplaatje te verplaatsen, tilt u het glasplaatje op en past u de positie van het wasplaatje indien nodig aan. Leg de objectglaasjes met gemonteerde wasschijfjes 1 minuut op een tafel met constante temperatuur bij 47 °C om de plakjes weer te laten ontkrullen; zodra de plakjes helemaal plat zijn, plaatst u de glaasjes gedurende 1 uur in een incubator van 62 °C.
- Voor het ontharen van was plaatst u de gebakken glaasjes twee keer 20 minuten in xyleen.
- Voor rehydratatie plaatst u de objectglaasjes in een reeks graduele alcohol om de plakjes longweefsel te rehydrateren: 100% alcohol gedurende 2 min, 95% alcohol gedurende 1 minuut, 90% alcohol gedurende 1 minuut, 85% alcohol gedurende 1 minuut, 75% alcohol gedurende 1 minuut en gedestilleerd water gedurende 3 min.
- Kleur de secties gedurende 5 minuten in hematoxyline. Was twee keer 1 minuut, doe het vervolgens 5 s in een 0,5% zoutzuuralcoholdifferentiatieoplossing, was twee keer met water, plaats 8-10 s in blauwe kleuringsoplossing, spoel twee keer af met kraanwater en beits met eosine gedurende 30 s.
- Voor uitdroging en ontkleuring plaatst u de bevlekte secties in 75% alcohol gedurende 1 minuut, 85% alcohol gedurende 1 minuut, 90% alcohol gedurende 1 minuut, 95% alcohol gedurende 1 minuut, 100% alcohol gedurende 1 minuut en vervolgens tweemaal xyleen, en verwijder alle resterende vloeistof met absorberend papier.
- Leg voor de montage een druppel neutrale gomafdichtingsoplossing in het midden van de plak en monteer een dekglaasje.
- Morfologische beoordelingsstandaard van longweefsel van muizen
- Laat met behulp van de methode beschreven door Ashcroft et al., een onderzoeker die blind is voor de experimentele groep willekeurig drie microscopische velden uit elk monster selecteren en de mate van longfibrose observeren bij een vergroting van 100x: graad 0, normale long; graad 1, licht gezwollen longblaasjes, gelokaliseerde milde fibrose; graad 2, duidelijke fibrose (dikte van de alveolaire wand groter dan drie keer normaal), met fibreuze haarden; graad 3, continue gebieden van fibrose (dikte van de alveolaire wand drie keer groter dan normaal); graad 4, fusie van fibreuze haarden, waarbij het fibrotische gebied minder dan 10% van het longweefsel uitmaakt; graad 5, de fibreuze foci zijn versmolten, het fibrosegebied is 10% tot 50% en de alveolaire structuur is aanzienlijk beschadigd; graad 6, grote continue fibreuze haarden (meer dan 50% van het longweefsel); graad 7, de alveolaire ruimte is gevuld met vezelig weefsel, pulmonale bullae zijn aanwezig; graad 8, volledige fibrose.
- Ken een score toe die overeenkomt met het cijfer aan elk gezichtsveld (bijv. cijfer 4 is gelijk aan vier punten) en scoor elke groep van zes steekproeven afzonderlijk.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Longbeschadiging werd veroorzaakt door vernevelde BLM en de controledieren werden verneveld met dezelfde hoeveelheid normale zoutoplossing. De muizen werden eenmaal per dag gedurende 3 dagen, 30 minuten per dag verneveld, met een BLM-concentratie van 7 E/ml. Muizen werden op dag 9, 16 en 23 na toediening van BLM geofferd voor H&E-kleuring (Figuur 2B). Diffuse pneumonische laesies met verlies van de normale alveolaire architectuur, verdikking van het septum, vergrote long...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Intratracheale injectie van bleomycine resulteert in een acute inflammatoire en fibrotische respons in beide longen en kan worden beschouwd als een effectieve benadering om een experimenteel muismodel van menselijke interstitiële longziekte op te zetten. Intratracheale toediening is de meest gebruikte toedieningsroute 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 92068108).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| bleomycin | Bioway/Nippon Kayaku Co Ltd | DP721 | Fibrosis model drugs |
| 0.9% saline voor injectie | Baxter Healthcare(Tianjin)Co.,Ltd. | Bleomycine bereiding | |
| 1 mL spuit | BD | 300481 | Verdoven van dieren |
| 10% neutraal formaline buffer | TechaLab Biotech Company | Bevestig longweefsel | |
| 15 mL centrifugeerbuis | corning | 430790 | Voorbereiding voor anesthesie |
| 20 °C koelkast | New-fly group | BCD-213K | Opslag van geneesmiddelen |
| 4 °C koelkast | New-fly group | BCD-213K | Opslag van geneesmiddelen |
| Adobe illustrator cc2020 | Adobe | Verwerking van afbeeldingen | |
| blauwe rug vloeistof | Beijing Chemical Works | weefselkleuring | |
| schoon bank | Suzhou Sujie Purifying Equipment Co.,Ltd. | Bleomycine bereiding | |
| differentiatie vloeistof | Beijing Chemical Works | weefselkleuring | |
| Elektronische weegschaal | METTLER TOLEDO | AA-160 | Voorbereiding voor anesthesie |
| eosine kleuring | Beijing Yili Fine Chemicals Co,Ltd. | weefselkleuring | |
| Verwarmingspad | HIDOM | Muizen incubatie | |
| hematoxyline kleuring | Beijing Yili Fine Chemicals Co,Ltd. | weefselkleuring | |
| fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer | Hyclone | SH30256.01 | Reinigen longweefsel |
| Photoshop tekensoftware | Adobe | Verwerking van afbeeldingen | |
| SCIREQ INEXPOSE | EMKA Biotech Beijing Co.,Ltd. | Verstuivingsapparaat | |
| Rechtopstaande fluorescentiemicroscoop | Olympus | BX53 | Observatie van de plak |
Referenties
- Raghu, G., et al. Diagnosis of idiopathic pulmonary fibrosis. An official ATS/ERS/JRS/ALAT clinical practice guideline. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 198 (5), e44-e68 (2018).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (2), L152-L160 (2008).
- Degryse, A. L., et al. Repetitive intratracheal bleomycin models several features of idiopathic pulmonary fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (4), L442-L452 (2010).
- Sueblinvong, V., et al. Predisposition for disrepair in the aged lung. The American Journal of the Medical Sciences. 344 (1), 41-51 (2012).
- Peng, R., et al. Bleomycin induces molecular changes directly relevant to idiopathic pulmonary fibrosis: a model for "active" disease. PLoS One. 8 (4), e59348(2013).
- Izbicki, G., et al. Time course of bleomycin-induced lung fibrosis. International Journal of Experimental Pathology. 83 (3), 111-119 (2002).
- Aguilar, S., et al. Bone marrow stem cells expressing keratinocyte growth factor via an inducible lentivirus protects against bleomycin-induced pulmonary fibrosis. PLoS One. 4 (11), e8013(2009).
- Ortiz, L. A., et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (14), 8407-8411 (2003).
- Rojas, M., et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells in repair of the injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 33 (2), 145-152 (2005).
- Ortiz, L. A., et al. Interleukin 1 receptor antagonist mediates the antiinflammatory and antifibrotic effect of mesenchymal stem cells during lung injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (26), 11002-11007 (2007).
- Foskett, A. M., et al. Phase-directed therapy: TSG-6 targeted to early inflammation improves bleomycin-injured lungs. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), L120-L131 (2014).
- Hecker, L., et al. Reversal of persistent fibrosis in aging by targeting Nox4-Nrf2 redox imbalance. Science Translational Medicine. 6 (231), 231ra47(2014).
- Taooka, Y., et al. Effects of neutrophil elastase inhibitor on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice. American Journal of Respiratory & Critical Care Medicine. 156 (1), 260-265 (1997).
- Gharaee-Kermani, M., Ullenbruch, M., Phan, S. H. Animal models of pulmonary fibrosis. Methods in Molecular Medicine. , 251-259 (2005).
- Orlando, F., et al. Induction of mouse lung injury by endotracheal injection of bleomycin. Journal of Visualized Experiments. (146), e58902(2019).
- Moore, B. B., et al. Animal models of fibrotic lung disease. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 167-179 (2013).
- Gauldie, J., Kolb, M. Animal models of pulmonary fibrosis: how far from effective reality. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (2), L151(2008).
- Jenkins, R. G., et al. An official American thoracic society workshop report: use of animal models for the preclinical assessment of potential therapies for pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (5), 667-679 (2017).
- Moeller, A., et al. The bleomycin animal model: A useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (3), 362-382 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
