De Peel-Blot-techniek: een cryo-EM-monstervoorbereidingsmethode om enkele lagen te scheiden van meerlagige of geconcentreerde biologische monsters

Samenvatting

De peel-blot-techniek is een cryo-EM-rastervoorbereidingsmethode die het mogelijk maakt om meerlagige en geconcentreerde biologische monsters in enkele lagen te scheiden om de dikte te verminderen, de monsterconcentratie te verhogen en de beeldverwerking te vergemakkelijken.

Samenvatting

De peel-blot cryo-EM grid preparation techniek is een significant gewijzigde back-injection methode met als doel het bereiken van een vermindering van lagen van meerlagige monsters. Deze verwijdering van lagen voorafgaand aan het bevriezen van de duik kan helpen bij het verminderen van de dikte van het monster tot een niveau dat geschikt is voor cryo-EM-gegevensverzameling, het verbeteren van de vlakheid van het monster en het vergemakkelijken van beeldverwerking. De peel-blot-techniek maakt het mogelijk om multilamellaire membranen in enkele lagen te scheiden, van gelaagde 2D-kristallen in individuele kristallen en van gestapelde, plaatachtige structuren van oplosbare eiwitten die eveneens in enkele lagen moeten worden gescheiden. De hoge monsterdikte van dit soort monsters levert vaak onoverkomelijke problemen op voor cryo-EM-gegevensverzameling en cryo-EM-beeldverwerking, vooral wanneer de microscoopfase moet worden gekanteld voor gegevensverzameling. Bovendien kunnen rasters van hoge concentraties van elk van deze monsters worden voorbereid voor efficiënte gegevensverzameling, omdat de monsterconcentratie voorafgaand aan de rastervoorbereiding kan worden verhoogd en de peel-blot-techniek kan worden aangepast om te resulteren in een dichte verdeling van eenlaags monster.

Inleiding

De peel-blot-techniek is ontwikkeld om gestapelde tweedimensionale kristallen van membraaneiwitten in enkele lagen te scheiden om voldoende dunne monsters te verkrijgen voor cryo-EM 2D- en 3D-gegevensverzameling en beeldverwerking^{te vergemakkelijken 1}. Het protocol is ook geschikt voor andere soorten multilamellaire monsters en voor het bereiken van hoge monsterconcentraties van beide monstertypen op het rooster zonder de dikte in Z te vergroten.

Reductie van monsterlagen tot één laag wordt bereikt door een combinatie van capillaire druk en schuifkrachten toe te passen in een protocol dat de teruginjectiemethode aanzienlijk verlengt en wijzigt². Een eerste blotting-stap resulteert in strakke sandwiching en hechting aan de koolstoffilm en een rasterbalk aan weerszijden van het meerlagige monster tijdens het blotting op submicron in plaats van de 20-25μm filterpapierporiëngrootte in de back-injectiemethode. De scheiding, of peeling, van een individuele laag vindt plaats bij het forceren van de scheiding van de ingeklemde lagen zodra het raster verticaal op een trehalosedruppel wordt gedrukt, waardoor de koolstoffilm weg wordt gedwongen van de rasterbalk (figuur 1). Het verplaatsen van de koolstoffilm weg van het oorspronkelijke contactpunt met de rasterbalk vindt plaats in de volgende stap, wanneer het raster opnieuw wordt uitgeveegd op submicronfilterpapier. Het aantal iteraties van deze stappen kan worden geoptimaliseerd voor specifieke voorbeelden. Bovendien kan het protocol worden gebruikt om de monsterconcentraties te verhogen en tegelijkertijd aggregatie in Z te vermijden. Vanwege de afhankelijkheid van de naleving van de rasterbalk en koolstoffilm en krachtige scheiding, is deze aanpak mogelijk niet geschikt voor zeer fragiele moleculen zoals bepaalde delicate en / of onstabiele eiwitten en eiwitcomplexen.

De peel-blot techniek vereist geen gespecialiseerde apparatuur of dure benodigdheden. Toepasbaarheid op specifieke monsters vereist echter zorgvuldige overwegingen van biologische parameters. De beslissing is gemakkelijker voor 2D-kristallen omdat koolstoffilm nodig is om vlakheid te garanderen, maar manipulatie via de peel-blot-techniek kan de biologische integriteit van het monster of de kristallijne volgorde beïnvloeden. De geschiktheid van de peel-blot-techniek voor afzonderlijke deeltjes is beperkt tot en kan worden getest voor deeltjes die koolstoffilm nodig hebben en stabiel zijn voor manipulatie. Specimens met kritische biologische interacties tussen lagen zijn mogelijk niet geschikt voor karakterisering met behulp van de peel-blot-techniek vanwege de verstoring van dergelijke interacties.

De peel-blot techniek ("peel-blot") wordt het snelst geoptimaliseerd door testen en screenen met negatieve vlekken of niet-gekleurde monsters door TEM bij kamertemperatuur. Zodra het optimale aantal peel-blot iteraties is geïdentificeerd, kan de tijd om de dikte vóór de vitrificatie te regelen worden bepaald.

Protocol

1. Voorbereidingsstappen voor de peel-blot techniek

OPMERKING: Voorbereiding vereist dat de volgende items naast elkaar worden geplaatst.

1. Stapel twee stukken filterpapier van 20-25 μm porieformaat (zie Materiaaltabel).
2. Plaats een paraffinefilm van ~8 cm x 10 cm lang naast het filtreerpapier met het papier naar boven gericht.
3. Leg een stuk submicronfilterpapier op twee extra stukken #4-filterpapier (figuur 1-1).
4. Plaats de anti-capillaire tang met het gebogen been naar boven en het rechte been naar beneden. Selecteer vervolgens een raster met 600 mazen met de gladde / glanzende kant naar boven. Plaats de tang op een petrischaaltje of een ander verhoogd oppervlak om contact van het schone rooster met andere items te voorkomen.
5. Verwijder het papier van de paraffinefilm en trek aan de zijkanten (~5 mm) om een kleine rand te creëren. Pipetteer twee druppels van 150 μL van 4% trehalose-oplossing ~ 1-2 cm van een korte kant van de paraffinefilm en ~ 1 cm uit elkaar op de paraffinefilm.
6. Giet op een aparte bank of op de vloer vloeibare stikstof in een kleine polystyreenschuimcontainer (zie materiaaltabel).
   LET OP: Ontvang training voor de juiste behandeling met handschoenen en een gezichtsscherm om vorstbeet te voorkomen.
7. Plaats een kleine cryo-EM roostercontainer in de vloeibare stikstof en bedek de polystyreenschuimcontainer met pluisvrije doekjes.

2. De koolstoffilm op het rooster plaatsen

1. Gebruik de Dumont #5-tang (zie Materiaaltabel) om de koolstoffilm van het mica te laten zweven door één kant van het mica in een lichte hoek naar beneden (~20°-40°) op een van de druppels trehalose-oplossing aan te raken en laat de waterspanning langzaam van de koolstoffilm afstijgen door het mica naar beneden te bewegen. Laat de mica los zodra de koolstoffilm op het oppervlak van de druppel drijft.
2. Inspecteer de koolstoffilm visueel om te voorkomen dat koolstof wordt gebruikt met schade in de vorm van breuken.
3. Plaats het rooster dat door de anti-capillaire tang onder een hoek (~ 20 ° -30 °) wordt vastgehouden in een trehalosedruppel op een positie naast en vervolgens gecentreerd onder de koolstoffilm. Pak de koolstoffilm op (figuur 1-2).
4. Houd het rooster in dezelfde richting en laat het langzaam op het oppervlak van de tweede druppel trehalose zakken zonder de oppervlaktespanning van de druppel te breken om onnodige koolstoffilm te verwijderen die zich mogelijk rond de rand van het rooster naar de ruwe kant heeft gewikkeld.

3. Scheiding van meerlaagse 2D-kristallen in enkele lagen

1. Draai de anti-capillaire tang (zie Materiaaltabel) en plaats ze op een petrischaaltje met de koolstofzijde van het rooster naar beneden gericht (figuur 1-3).
2. Pipetteer 1,3 μL van het monster in de lichte trehalose meniscus bovenop het rooster. Pipetteer de oplossing ~ 8-10 keer om de trehalose en het monster aan beide zijden van het rooster te mengen en te verdelen.
3. Pipetteer tijdens het incuberen van de oplossing gedurende 1 min een of meer druppels trehalose-oplossing van 1,7 μL op de paraffinefilm.
4. Draai het raster terug in zijn oorspronkelijke positie met de koolstoffilm naar boven gericht.
5. Gebruik de anti-capillaire tang om het raster op het submicronfilterpapier te drukken (figuur 1-4). Zodra de oplossing door het filterpapier is geabsorbeerd en de koolstoffilm plat ligt, wacht u 3 seconden voordat u het rooster optilt en verticaal op de druppel trehaloseoplossing van 1,7 μL beweegt (figuur 1-5).
   OPMERKING: Herhaal deze stap meerdere keren voor sterk gestapelde monsters, of het raster wordt voorbereid voor vitrificatie in de volgende stappen.
6. Dep het raster op de twee stukken filterpapier en til het raster vervolgens van het filterpapier (figuur 1-6). Na ongeveer 13 s, afhankelijk van vochtigheid en monsterbuffer, dompelt u het rooster in de vloeibare stikstof in de kleine piepschuimcontainer en plaatst u het rooster in de cryo-EM-rastercontainer of draagt u het rechtstreeks over voor cryo-EM-screening of gegevensverzameling.
   OPMERKING: Om het protocol snel te optimaliseren, moet u het geschilde rooster bij deze stap negatief kleuren in plaats van het in vloeibare stikstof te storten. Kleur het monster negatief door 3 μL 1% uranylacetaat op het rooster aan te brengen, incubeer het rooster gedurende 30 s en dep het met een gescheurd stuk filterpapier van 20-25 μm porieformaat. Rasters van 2D-kristallen verglaasd in trehalose, tannine of glucose worden routinematig met de hand gedompeld voor verglazing, omdat trehalose, tannine en glucose de vorming van kristallijn ijs voorkomen met snelheden die worden gebruikt voor het met de hand storten².

Resultaten

Een succesvol peel-blot experiment zal resulteren in enkele lagen monsters in vaak hoge concentraties. Het is te verwachten dat sommige regio's in de meeste rastervierkanten nog steeds meerdere lagen zullen bevatten, vooral bij minder iteraties van de peel-blot-stappen. De meerderheid van de rastervierkanten zal echter uitgebreide gebieden van enkele lagen bevatten, zoals waargenomen voor 2D-kristallen van humaan leukotrieen C_4-synthase (figuur 2) en liposomen (toegevoegd in stap ...

Discussie

De peel-blot is een krachtige methode om stapeling en dikte van meerlaagse 2D-kristallen en soortgelijke monsters voor cryo-EM-gegevensverzameling en beeldverwerking te overwinnen. Een beslissing over het gebruik van de peel-blot zal gebaseerd zijn op biologische parameters van het monster en zal ook moeten worden beoordeeld zodra een 3D cryo-EM-model beschikbaar is. Het biologische belang van contacten en de potentiële flexibiliteit van contactregio's zullen bij deze beoordeling bijzonder belangrijk zijn.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
600-mesh grids	SPI	2060-C-XA
Anti-capillary forceps	Ted Pella	510-5
Carbon om mica te coaten
Cryo-EM			Cryo-EM roosters kunnen worden gescreend bij 120 kV of 200 kV.  Hoge resolutie gegevens worden verzameld bij 300 kV.
Dumpont #5 forceps	Ted Pella	5622
Grid box voor cryo-EM opslag	Ted Pella	160-40
Kim Wipes
Vloeibare stikstof
Mica	Ted Pella	56	De mica is met koolstof gecoat en gesneden in vierkanten die iets groter zijn dan een TEM rooster.  De dikte van de koolstof kan moeten worden geoptimaliseerd om dunne koolstof die gemakkelijk breekt bij meerdere peel blots te vermijden.
Negatieve kleuring			1-2% uranylacetaat is geschikt voor veel monsters.  Andere kleurstoffen zoals fosfowolfraamzuur kunnen worden vervangen.
Parafilm
Polystyreen container			Gebruikt voor het glasvormen van het peel-blot rooster. Een polystyreen verzendcontainer kan voor dit doel worden gerecycled en bekleed met aluminiumfolie.
Submicron filterpapier	MilliporeSigma	DAWP04700
Transmissie-elektronenmicroscoop	JEOL	JEM-1400	Elke TEM die wordt gebruikt met een versnellingsspanning van 80-120 kV is geschikt voor het screenen van negatief gekleurde roosters.
Trehalose			Bereid een 4% trehalose-oplossing.
Whatman #4 filterpapier	MilliporeSigma	WHA1004150	Dit komt overeen met het filterpapier met een poriëngrootte van 20-25 μm in het protocol.