Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Microtensiometer voor confocale microscopie visualisatie van dynamische interfaces

2.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64110

⸱

9 september 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Minnesota, 2Department of Chemical Engineering, Carnegie Mellon University

In dit artikel

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft het ontwerp en de werking van een microtensiometer / confocale microscoop om gelijktijdige metingen van interfaciale spanning en oppervlaktedilatationale reologie uit te voeren terwijl de interfaciale morfologie wordt gevisualiseerd. Dit biedt de real-time constructie van structuur-eigenschap relaties van interfaces die belangrijk zijn in technologie en fysiologie.

Samenvatting

Adsorptie van oppervlakte-actieve moleculen aan vloeistof-vloeistof interfaces is alomtegenwoordig in de natuur. Het karakteriseren van deze interfaces vereist het meten van adsorptiesnelheden van oppervlakteactieve stoffen, het evalueren van evenwichtsoppervlakspanningen als een functie van de bulkoppervlakteactieve stofconcentratie en het relateren van hoe oppervlaktespanning verandert met veranderingen in het interfaciale gebied na equilibratie. Gelijktijdige visualisatie van de interface met behulp van fluorescentiebeeldvorming met een snelle confocale microscoop maakt de directe evaluatie van structuur-functierelaties mogelijk. In de capillaire drukmicrotensiometer (CPM) wordt een hemisferische luchtbel aan het einde van het capillair vastgepind in een vloeistofreservoir met een volume van 1 ml. De capillaire druk over de belleninterface wordt geregeld via een commerciële microfluïdische stroomregelaar die modelgebaseerde druk, bubbelkromming of bubbelgebiedregeling mogelijk maakt op basis van de Laplace-vergelijking. In vergelijking met eerdere technieken zoals de Langmuir trog en hanger drop, zijn de meet- en regelprecisie en responstijd sterk verbeterd; capillaire drukvariaties kunnen in milliseconden worden toegepast en geregeld. De dynamische respons van de bubbelinterface wordt gevisualiseerd via een tweede optische lens terwijl de bel uitzet en samentrekt. De bubbelcontour is geschikt voor een cirkelvormig profiel om de krommingsradius van de bel, R, te bepalen, evenals eventuele afwijkingen van circulariteit die de resultaten ongeldig zouden maken. De Laplace-vergelijking wordt gebruikt om de dynamische oppervlaktespanning van de interface te bepalen. Na equilibratie kunnen kleine drukoscillaties worden opgelegd door de computergestuurde microfluïdische pomp om de bubbelradius (frequenties van 0,001-100 cycli / min) te oscilleren om de dilatatiemodulus te bepalen De totale afmetingen van het systeem zijn zo klein dat de microtensiometer onder de lens van een snelle confocale microscoop past, waardoor fluorescerend gelabelde chemische soorten kwantitatief kunnen worden gevolgd met submicron laterale resolutie.

Inleiding

Lucht-water interfaces bedekt met oppervlakteactieve films zijn alomtegenwoordig in het dagelijks leven. Oppervlakteactieve waterinjecties worden gebruikt om de oliewinning uit uitgeputte velden te verbeteren en worden gebruikt als hydraulische breukoplossingen voor schaliegas en -olie. Gas-vloeistof schuimen en vloeistof-vloeistof emulsies zijn gebruikelijk voor veel industriële en wetenschappelijke processen als smeermiddelen en reinigingsmiddelen en komen veel voor in voedsel. Oppervlakteactieve stoffen en eiwitten op interfaces stabiliseren antilichaamconformaties tijdens verpakking, opslag en toediening 1,2,3,4,5, scheurfilmstabiliteit in het oog 6,7,8 en longmechanica 9,10,11,12,13,14, 15.

De studie van oppervlakteactieve stoffen of oppervlakteactieve stoffen die adsorberen aan interfaces en hun eigenschappen heeft een lange geschiedenis met veel verschillende experimentele technieken 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Een recente ontwikkeling is de capillaire drukmicrotensiometer (CPM), die het onderzoek van interfaciale eigenschappen op sterk gekromde interfaces mogelijk maakt, op veel kleinere lengteschalen, terwijl aanzienlijk minder materialen worden gebruikt dan andere gangbare methoden 9,23,24,25. Confocale fluorescentiemicroscopie (CFM) kan worden gebruikt om de morfologie van lipiden en eiwitten te bestuderen op de lucht-waterinterfaces in de CPM22 of op Langmuir-troggen 20,26,27,28,29. Hier zijn een CPM en CFM gecombineerd om morfologische verschijnselen te verbinden met dynamische en evenwichtsinterfaciale eigenschappen om structuur-functierelaties te ontwikkelen voor biologische en technologische interfaces.

Er zijn tal van parameters van belang in interfaciale oppervlakteactieve systemen die toegankelijk zijn voor de CPM-CFM. In de CPM wordt een luchtbel met een diameter van 30-200 μm vastgepind aan de punt van een glazen capillaire buis. In eerdere versies van de CPM werd het capillaire drukverschil tussen de binnen- en buitenkant van de bel geregeld via een waterkolom en een oscillerende spuitpomp 9,30 ; de hier beschreven nieuwe versie vervangt deze door een hogere precisie, computergestuurde microfluïdische pomp. De oppervlaktespanning (γ) wordt bepaald via de Laplace-vergelijking, ΔP = 2γ/R, uit de drukval over het door de pomp ingestelde interface, ΔP, en optische analyse van de kromtestraal van de bel, R. De dynamische oppervlaktespanning van de interface kan worden bepaald met een tijdresolutie van 10 ms na het genereren van een nieuwe bel in contact met een bulkvloeistof die een oplosbare oppervlakteactieve stof bevat. De adsorptiedynamiek van oppervlakteactieve stoffen kan worden beschreven met de klassieke Ward-Tordai-vergelijking10,31 om essentiële eigenschappen van de oppervlakteactieve stof te bepalen, waaronder de diffusiviteit, oppervlaktedekking en de relatie tussen bulkconcentratie en evenwichtsoppervlaktespanning. Zodra een evenwichtsoppervlaktespanning is bereikt, kan het interfaciale gebied worden geoscilleerd om de dilatatiemodulus te meten, figure-introduction-1door de veranderingen in oppervlaktespanning te registreren, geïnduceerd door kleine veranderingen in het beloppervlak, A32. Voor complexere interfaces die hun eigen interne structuren ontwikkelen, zoals verstrengelde polymeren of eiwitten, wordt de oppervlaktespanning, , vervangen door een meer algemene oppervlaktespanning 4,33, figure-introduction-2.

Longstabiliteit tijdens de ademhaling kan direct worden gekoppeld aan het handhaven van zowel een lage oppervlaktespanning als een hoge dilatatiemodulus op de alveolaire lucht-vloeistofinterface 9,10. Alle interne longoppervlakken zijn bekleed met een continue, micron dikke film van epitheliale voeringvloeistof om weefselhydratatie te behouden34. Deze epitheliale voeringvloeistof is voornamelijk water, met zouten en verschillende andere eiwitten, enzymen, suikers en longsurfactant. Zoals het geval is voor elke gebogen vloeistof-dampinterface, wordt een capillaire druk geïnduceerd met de druk hoger aan de binnenkant van de alveolus (of bel). Als de oppervlaktespanning echter overal in de longen constant was, laat de Laplace-vergelijking, ΔP = 2γ / R, zien dat kleinere longblaasjes een hogere interne druk zouden hebben ten opzichte van grotere longblaasjes, waardoor het gasgehalte van de kleinere longblaasjes naar grotere longblaasjes met lagere druk zou stromen. Dit staat bekend als "Laplace Instability"9,35. Het nettoresultaat is dat de kleinste longblaasjes zouden instorten en gevuld zouden worden met vloeistof en moeilijk opnieuw op te blazen, waardoor een deel van de long zou instorten, en andere delen zouden over-inflateren, die beide typische symptomen zijn van acute respiratory distress syndrome (ARDS). In een goed functionerende long verandert de oppervlaktespanning echter dynamisch als de lucht-epitheliale vloeistofinterface in het interfaciale gebied van alveolus uitzet en samentrekt tijdens het ademen. Als figure-introduction-3, of figure-introduction-4, neemt de Laplace-druk af met afnemende radius en neemt toe met toenemende radius om de Laplace-instabiliteit te elimineren, waardoor de long wordt gestabiliseerd9. figure-introduction-5Vandaar, en hoe het afhangt van frequentie, monolaag morfologie en samenstelling, en alveolaire vloeistofsamenstelling kan essentieel zijn voor de longstabiliteit. De CPM-CFM heeft ook de eerste demonstraties gegeven van de effecten van interfaciale kromming op oppervlakteactieve adsorptie25, monolaagmorfologie22 en dilatatiemodulus9. Het kleine volume (~ 1 ml) van het reservoir in de CPM maakt de snelle introductie, verwijdering of uitwisseling van de vloeibare fase mogelijk en minimaliseert de vereiste hoeveelheid dure eiwitten of oppervlakteactieve stoffen10.

Contrast in een CPM-CFM-afbeelding is te wijten aan de verdeling van kleine fracties fluorescerend gelabelde lipiden of eiwitten op de interface16,27. Tweedimensionale oppervlakteactieve monolagen vertonen vaak laterale fasescheiding als functie van oppervlaktespanning of oppervlaktedruk, figure-introduction-6 π is het verschil tussen de oppervlaktespanning van een schone vloeistof-vloeistofinterface, γ0, en een met oppervlakteactieve stof bedekte interface, γ. π kan worden beschouwd als de 2D "druk" veroorzaakt door de interacties van oppervlakteactieve moleculen op het grensvlak dat fungeert om de zuivere vloeistofoppervlakspanning te verlagen. Bij lage oppervlaktedrukken bevinden lipide monolagen zich in een vloeistofachtige ongeorganiseerde toestand; dit staat bekend als de vloeistof geëxpandeerde (LE) fase. Naarmate de oppervlaktedruk toeneemt en het gebied per lipidemolecuul afneemt, oriënteren de lipiden zich met elkaar en kunnen ze een eerste orde fase overgang ondergaan naar de lange afstand bestelde vloeistof gecondenseerde (LC) fase 16,20,27. De LE- en LC-fasen kunnen naast elkaar bestaan bij verschillende oppervlaktedrukken en kunnen worden gevisualiseerd als fluorescerend gelabelde lipiden worden uitgesloten van de LC-fase en worden gescheiden naar de LE-fase. De LE-fase is dus helder en de LC-fase is donker wanneer deze wordt afgebeeld met CFM16.

Het doel van dit manuscript is om de stappen te beschrijven die nodig zijn om de gecombineerde confocale micro microtensiometer te bouwen en te bedienen. Dit stelt de lezer in staat om adsorptiestudies uit te voeren, oppervlaktespanning, reologisch gedrag te meten en interfaciale morfologie tegelijkertijd te onderzoeken op een lucht / water- of olie / water-interface op micronschaal. Dit omvat een bespreking van het trekken, snijden en hydrofobiëren van de vereiste haarvaten, instructies voor het gebruik van druk-, krommings- en oppervlakteregelingsmodi en interfaciale overdracht van onoplosbare oppervlakteactieve stof naar de microtensiometer gebogen interface.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van capillaire buisjes

  1. Plaats het capillair in een capillaire trekker en voer het gewenste trekprogramma uit om twee taps toelopende haarvaten te maken met een buitendiameter (OD) van ~ 1 μm aan de punt.
    OPMERKING: De OD van het capillair voordat u gaat trekken, moet de OD zijn die is gespecificeerd om in de capillaire houder in de microtensiometercel te passen. De binnendiameter (ID) van het capillair kan variëren, maar heeft invloed op de kritische straal van het capillair na het trekken. Er wordt gekozen voor een pulling-programma, zodat de resulterende taper in eerste instantie de capillaire OD en ID snel vermindert, vervolgens een straal bereikt in de buurt van de gewenste capillaire OD en ID en vervolgens langzamer in diameter afneemt. Dit zal een grotere capillaire lengte creëren die kan worden gescoord om een bruikbaar capillair van 30-100 μm in ID op te leveren.
  2. Scoor de punt van het capillair op de gewenste plek om een ID van 30-100 μm te verkrijgen en breek de punt af. Het capillair heeft nu een OD en ID van de gewenste straal aan de punt (figuur 1A). De haarvaten kunnen worden bewaard tot stap 2.
    OPMERKING: De snijrand van het capillair moet een 90° schone breuk hebben. Elk defect in de snijrand zal leiden tot een slechte pinning van de bel aan het capillair en slechte oppervlakte-eigenschapsmetingen. Taps toelopende capillaire uiteinden zijn zeer delicaat. Ze zullen worden vernietigd als ze in contact komen met iets anders dan de oplossingen (bijv. Injectieflaconwanden, luchtmondstuk).

2. Hydrofobisatie van haarvaten

  1. Verzamel getrokken glazen haarvaten, zure reinigingsoplossing, plastic pincet, gedeïoniseerd (DI) water, hydrofobisatie-oplossing (2% silaan in ethanol), vacuümpomp en ethanoloplossing. Zie Materiaaltabel voor meer informatie.
    LET OP: Zure reinigingsoplossing is acutly giftig, veroorzaakt huid- en oogcorrosie / irritatie, oxideert. Hydrofobisatie-oplossing is een huid/oog/ademhalingsirritant. Draag oogbescherming, laboratoriumjassen en handschoenen en werk met oplossingen in een zuurkast.
  2. Zuur-reinig het capillair
    OPMERKING: Zuurreiniging van het capillair verwijdert alle organische resten in het capillair en bereidt het glasoppervlak voor op de silanisatiereactie die het capillaire hydrofoob maakt.
    1. Pak een capillair stevig in de buurt van het brede uiteinde met het pincet.
    2. Dompel de taps toelopende punt in de zure reinigingsoplossing terwijl u de slang van de vacuümpomp aan het brede uiteinde van het capillair bevestigt. Dit zuigt de oplossing in het capillair.
      OPMERKING: Een pipetpunt kan aan het uiteinde van de capillaire slang worden bevestigd om een betere pasvorm met het capillaire uiteinde mogelijk te maken.
    3. Stop wanneer de zure reinigingsoplossing ongeveer de helft van het capillair heeft gevuld.
      OPMERKING: Na verwijdering van de capillaire punt uit de zure reinigingsoplossing, vormt de oplossing aan de buitenkant van het capillair vaak een kraal in de buurt van de capillaire punt. Raak het capillair voorzichtig aan in de hals van de injectieflacon met oplossing om overtollige oplossing te verwijderen.
    4. Laat de zure reinigingsoplossing ten minste 30 minuten in de haarvaten blijven zitten en zorg ervoor dat de plug van de vloeistof aan het taps toelopende uiteinde van het capillair blijft.
    5. Verwijder de zure reinigingsoplossing uit het capillair door het capillair stevig vast te houden met het pincet en de vacuümslang te gebruiken om de vloeistof uit het grote uiteinde van het capillair te trekken.
  3. Spoel het capillair af
    1. Dompel het taps toelopende uiteinde van het capillair onder in DI-water en zorg ervoor dat het diep genoeg wordt ondergedompeld om elke buitenkant te bedekken die is ondergedompeld in de zure reinigingsoplossing. Terwijl de punt onder water staat, gebruikt u de vacuümslang om DI-water door het capillair te trekken. Haal het capillair uit het water en verwijder het resterende water met de vacuümslang.
    2. Herhaal de bovenstaande stap minstens 4x.
  4. Voer stap 2.3 opnieuw uit door ethanol te vervangen door DI-water.
  5. Zuig continu aan totdat de ethanol volledig uit de binnenkant van het capillair verdampt. Het capillair wordt troebel en koel om aan te raken als de ethanol begint te verdampen, maar zal na 30 tot 45 s verdwijnen.
  6. Bedek het capillair met de hydrofobisatieoplossing
    1. Dompel het brede uiteinde van het capillair kort in het ~ 2% silaan in ethanoloplossing. Capillaire werking zal ervoor zorgen dat de coatingoplossing in het capillair stijgt. Verwijder het capillair uit de oplossing zodra een ~1 cm grote plug in het capillair is gestegen.
    2. Richt het capillair zo dat de taps toelopende punt naar beneden is gericht, waardoor de coatingoplossing met de zwaartekracht naar de taps toelopende punt kan vallen.
    3. Laat de coatingoplossing minstens 3 min in het capillair blijven.
      OPMERKING: Er mogen geen luchtbellen in de plug van de coatingoplossing zitten die in contact staat met de binnenkant van de taps toelopende punt. Als er een luchtbel is, is het capillaire binnenste waarschijnlijk niet voldoende gedroogd in stap 2.5. Om dit te verhelpen, herhaalt u stap 2.4-2.6 indien nodig.
  7. Spoel de haarvaten met ethanol 1x op dezelfde manier als stap 2.3.
  8. Plaats de hydrofobe coating op het capillair
    1. Plaats schone en droge scintillatieflacons in een vacuümoven op 120 °C. Plaats gecoate haarvaten in de injectieflacons (idealiter één capillair per injectieflacon) met brede uiteinden die op de basis van de injectieflacon rusten. Laat haarvaten minstens 6 uur in de oven blijven (bij voorkeur een nacht) om een permanente hechting van de hydrofobe silaanlaag aan de haarvaten te bereiken. De haarvaten kunnen worden bewaard tot stap 4.

3. Monstervoorbereiding en -opslag

  1. Meng en bewaar oppervlakteactieve en fluorofooroplossingen in schone, met zuur gewassen injectieflacons om besmetting te voorkomen.
    OPMERKING: In de handel verkrijgbare lipiden moeten van de hoogste zuiverheid zijn en tussen gebruik bij - 20 °C worden bewaard. Oude of vervuilde lipiden zorgen er vaak voor dat de resultaten moeilijk te reproduceren zijn.

4. De microtensiometer instellen

  1. Stel de CPM-cel samen zoals beschreven in figuur 2.
    1. Plaats de grote kant van het capillair in de bovenkant van de CPM-cel totdat deze doordringt naar de onderkant van de cel.
    2. Draai de PEEK-plug voorzichtig vast om het capillair vast te zetten en bevestig vervolgens de buis van de microfluïdische pomp aan de grote kant van het capillair. Zorg ervoor dat u de taps toelopende capillaire punt niet aanraakt.
  2. Bevestig indien nodig de reservoirwissel- en/of temperatuurregelingsslangen aan de respectieve in- en uitgangen van de CPM-cel (figuur 2); sluit anders de ongebruikte in- en uitgangen aan.
  3. Bevestig de CPM-cel aan de confocale microscooptrap en lijn deze ruwweg uit met het CFM-objectief, de CPM-camera en de CPM-lichtbron (figuur 3).
  4. Open de gasstroom naar de microfluïdische pomp bij de aanbevolen bedrijfsdruk van de pomp (150 mbar voor de hier gebruikte microfluïdische pomp) en zorg ervoor dat de stroom naar het capillair open is.
  5. Begin met het uitvoeren van de virtuele CPM-interface (Supplemental Coding File 1: Microtensiometer Virtual Interface.vi) in de modus Drukregeling met de capillaire drukoscillatiefrequentie en amplitude ingesteld op nul (figuur 4-7). Figuur 4 toont een screenshot van de virtuele interface. Voor DI-water en een capillaire straal van ~35 μm zorgt een druk van ~20 mbar ervoor dat er geen water in het capillair komt.
  6. Vul de CPM-cel met water met behulp van een pipet.
  7. Focus op de capillaire punt met behulp van de microtensiometer camera.
  8. Focus op de capillaire tip met de CFM. Als het moeilijk is om het capillair te vinden, gebruikt u de CPM-camera om het CFM-objectief te vinden. Dit zal helpen bij het benaderen van de afstand tussen de CFM-doelstelling en de bubbel, waardoor de juiste werkafstand wordt bereikt.
  9. Nadat de annulus (groene sectorprojectie) op de bel is gecentreerd, past u de focus handmatig aan zodat de rand van de bubbel duidelijk zichtbaar is (figuur 4-3).
    OPMERKING: De positie, begin- en eindhoek en binnen- en buitenradii van de annulus kunnen worden aangepast via het menu onder het weergavevenster.
  10. Klik op Bubbel opnieuw instellen en zorg ervoor dat er een nieuwe bubbel wordt gevormd (men kan de oude bel horen knallen en de nieuwe bel kan worden waargenomen vanuit het weergavevenster van het bedieningspaneel; Figuur 4-3). Als de bel niet klapt, verhoogt u de Resetdruk of verhoogt u de Resetvertragingstijd op het tabblad Bellen opnieuw instellen onder het weergavevenster. Controleer of de oppervlaktespanning ongeveer 73 mN/m is (voor zoutoplossing of water/luchtbellen) (figuur 4-9).
  11. Haal het water eruit via de direct-to-cell spuit (figuur 3-13), leeg het en bevestig het opnieuw. Het monster is klaar om te worden geladen om het experiment uit te voeren.

5. Adsorptieonderzoek

  1. Vul de cel met het gewenste monster met behulp van een geautoclaveerde pipet die de CPM-software in de drukregelingsmodus houdt. Zorg ervoor dat de initiële oppervlaktespanning ongeveer 73 mN/m is wanneer een nieuwe belleninterface wordt gemaakt.
  2. Bepaal de straal van de nieuw gevormde bel en voer die waarde in het middenlijngebiedbesturingselement in (figuur 4-7) en wijzig het besturingstype in gebiedsbesturingselement door op het tabblad Gebiedsbesturingselement te klikken (figuur 4-8).
    OPMERKING: Constante drukregeling kan ook worden gebruikt, maar dit zorgt ervoor dat de bubbelradius continu verandert als de oppervlaktespanning van de interface verandert. Dit veranderende gebied kan de analyse van adsorptiepercentages van oppervlakteactieve stoffen bemoeilijken en ervoor zorgen dat de bubbel tijdens het onderzoek opduikt.
  3. Begin met het opnemen van de confocale video.
  4. Klik op Reset Bubble (Figuur 4-5) en klik direct op Collect Data (Figuur 4-6). Het signaallampje op de knop wordt groen.
  5. Pas de gegevensregistratiesnelheid aan de concentratie van het monster aan door de in figuur 4-6 weergegeven balk te schuiven. Voor langzamere adsorpties gebruikt u een langzamere opnamesnelheid. Dit kan in het midden van een run worden aangepast als een hogere opnamesnelheid vroeg gewenst is, maar een langzamere snelheid heeft de voorkeur voor lange studies om de bestandsgrootte te verkleinen.
  6. Sla het bestand na het einde van het experiment (wanneer een laatste oppervlaktespanningsplateau is bereikt) op door het juiste bestandspad te kiezen (figuur 4-1) en op de knop Opslaan te klikken (figuur 4-2).
  7. Stop en sla de opname ook op de CFM op.

6. Oscillatie/ontspanningsstudie

  1. Vul de cel met het monster met behulp van een geautoclaveerde pipet die de CPM-software in de drukregelingsmodus houdt. Zorg ervoor dat de oppervlaktespanning ongeveer 73 mN/m is wanneer een nieuwe belleninterface wordt gemaakt.
  2. Wacht tot het monster volledig is geadsorbeerd aan de interface. Dit kan direct na een adsorptieonderzoek worden uitgevoerd in plaats van opnieuw te beginnen met een nieuwe belleninterface.
  3. Bepaal of oscillatie een drukoscillatie, gebiedsoscillatie of krommingsoscillatie zal zijn door het juiste tabblad te selecteren (figuur 4-8) en de gewenste basislijnwaarde, oscillatie% en oscillatiefrequentie in te voeren (figuur 4-7).
    OPMERKING: Zaagtand-, vierkante en driehoekige golfgebiedoscillaties zijn ook toegankelijk via het vervolgkeuzemenu op het tabblad Oscillatie in ander gebied.
  4. Start de opname van de confocale video en klik op Gegevens verzamelen (figuur 4-6) in de CPM-software.
  5. Start de oscillatie. Zorg ervoor dat u ten minste zeven cycli opneemt voor de beste resultaten. Kies een data-acquisitiesnelheid (figuur 4-6) om een voldoende aantal gegevenspunten voor elke oscillatiecyclus te geven.
  6. Als andere oscillatieamplitudes of frequenties gewenst zijn, wijzigt u de waarden tijdens het experiment.
  7. Sla de resultaten op zoals in stap 5.6 en 5.7.

7. Onderzoek naar de uitwisseling van oplosmiddelen

  1. Vul de cel met het monster met behulp van een geautoclaveerde pipet die de CPM-software in de drukregelingsmodus houdt. Zorg ervoor dat de oppervlaktespanning ongeveer 73 mN/m is wanneer een nieuwe belleninterface wordt gemaakt.
    OPMERKING: Adsorptie- en/of oscillatiestudies kunnen voorafgaand aan het oplosmiddeluitwisselingsonderzoek worden uitgevoerd.
  2. Sluit de inlaatbuis aan op de fles met de gewenste vervangingsoplossing (figuur 3-11) op de peristaltische pomp (figuur 3-10).
  3. Start de opname van de video in confocale software en klik op Gegevens verzamelen (figuur 4-6) in de CPM-software.
  4. Stel de snelheid van de peristaltische pomp in. Dit regelt de vloeistofuitwisselingssnelheid en moet worden gekozen op basis van de vereisten voor het experiment, d.w.z. hoe snel het oplosmiddel moet worden vervangen.
  5. Als er meerdere vloeistoffen moeten worden uitgewisseld, stopt u de peristaltische pomp en sluit u de inlaat aan op een andere uitwisselingsoplossing.
  6. Nadat de uitwisseling is voltooid (~ 20 min), slaat u de resultaten op zoals in stap 5.6 en 5.7.

8. Onoplosbare adsorptie van oppervlakteactieve stoffen

OPMERKING: Als de te adsorberen oppervlakteactieve stof niet oplosbaar is in de reservoirvloeistof, kan deze methode worden gebruikt om een monolaag van de lucht/water-interface van de cel naar het bubbeloppervlak over te brengen. Veel dubbellaagvormende lipiden zijn bijna onoplosbaar in een zoutoplossing en absorberen niet spontaan in de bel wanneer ze in de reservoiroplossing worden gesuspendeerd.

  1. Vul de cel met het monster met behulp van een geautoclaveerde pipet die de CPM-software in de drukregelingsmodus houdt. Zorg ervoor dat de oppervlaktespanning ongeveer 73 mN/m is wanneer een nieuwe belleninterface wordt gemaakt.
  2. Deponeer een monolaag van onoplosbare oppervlakteactieve stof op de lucht-waterinterface van de cel van een oplossing in een vluchtige organische oplossing. Deponeer met behulp van een spuit kleine druppeltjes op het grensvlak en laat het oplosmiddel verdampen en laat het lipide achter als een dunne film.
    LET OP: Chloroform wordt gebruikt als oplosmiddel voor fosfolipiden zoals fosfatidylcholines en vetzuren. Verspreidingsoplossingen zijn meestal 0,01-0,02 mg lipide per ml van het oplosmiddel. Chloroform is acuut giftig, kan huid- en oogirritatie veroorzaken en is kankerverwekkend. Draag de juiste oogbescherming, laboratoriumjas en handschoenen en maak de oplossing in een zuurkast.
  3. Verklein het oppervlak via de middellijndrukregeling (figuur 4-7) van de bel totdat deze bijna vlak is. Dit voorkomt dat de bel knalt nadat de oppervlakteactieve stof is geadsorbeerd.
  4. Verwijder de reservoirvloeistof uit de cel via de direct-to-cell spuit totdat de lucht/water interface langs de punt van het capillair beweegt. Hoewel een spuitpomp kan worden gebruikt, kan deze stap worden bereikt door de spuit handmatig te gebruiken.
  5. Verhoog de vloeistofhoogte van het reservoir tot het oorspronkelijke niveau.
    OPMERKING: Nadat de tip opnieuw is ondergedompeld, zal de bel groter zijn vanwege de oppervlakteactieve stof die nu op de interface is geadsorbeerd. De monolaag zal nu klaar zijn voor oscillatie- of oplosmiddeluitwisselingsexperimenten.

9. Opruimen

  1. Schakel de CFM uit.
  2. Schakel over naar de modus Drukregeling .
  3. Verwijder het monster uit de cel met een pipet. Laad de cel met DI-water en verhoog de druk tot ~ 50 mbar om ervoor te zorgen dat bubbels constant uit het capillair ontsnappen en de capillaire punt reinigen. Herhaal dit proces 2x.
  4. Sluit de veiligheidsklep en schakel de CPM uit door op de rode knop in de linkerbovenhoek te klikken, schakel het licht- en blauwe drukbedieningspaneel uit en sluit de drukbron af.
  5. Verwijder de cel uit het confocale microscoopstadium. Spoel de cel uit met ethanol en DI-water. Verwijder de capillaire buis uit de CPM-cel.

10. De cel schoonmaken

  1. Demonteer de cel. Poets de binnenwand met een tandenborstel tijdens het spoelen onder DI-water. Dompel de onderdelen onder in ethanol en soniceer het gedurende ~ 30 minuten.
  2. Spoel alle onderdelen een paar keer af met DI-water. Droog de onderdelen door ze te blazen met stikstofgas of ze te drogen in een vacuümoven.

11. Oscillatie analyse

  1. Voer de Dilatational_Rheology_Analysis.m-code (Supplemental Coding File 2) uit en kies het gewenste bestand dat is opgeslagen in de virtuele CPM-interface. Voorbeeldgegevens worden opgenomen in de aanvullende bestanden.
  2. De druk versus tijdplot wordt weergegeven zoals weergegeven in aanvullende figuur 1. Klik met de linkermuisknop op het punt waar de oscillatie begint en klik nogmaals met de linkermuisknop op de plaats waar de oscillatie eindigt. Als de gegevens meerdere oscillaties bevatten, herhaalt u dit proces voor alle oscillaties.
    1. Wanneer alle begin- en eindpunten met de linkermuisknop zijn geklikt, klikt u met de rechtermuisknop ergens anders op de muis. Zoals bijvoorbeeld wordt weergegeven in aanvullende figuur 1, kan men met de linkermuisknop klikken op de punten 1, 2, 3 en 4, gevolgd door een klik met de rechtermuisknop.
      OPMERKING: De code berekent de dilatatiemodulus en fasehoek en de resultaten worden naar een nieuw .csv bestand op de oorspronkelijke bestandslocatie geschreven. De resultaten voor de voorbeeldgegevens zijn te zien in de coderesultaten in het aanvullende coderingsbestand 2. MATLAB zal ook verschillende grafische weergaven van de gegevens genereren, zoals weergegeven in aanvullende figuur 2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een belangrijke bron van meetfouten ontstaat door de haarvaten met defecten van het snijproces (figuur 5A, B) of het coatingproces (figuur 5D). Beide soorten defecten leiden tot fouten bij het bepalen van de vorm en grootte van de bel door het optische beeldanalysesysteem, wat leidt tot onnauwkeurige oppervlaktespanningswaarden. Het is belangrijk om elk nieuw capillair zorgvuldig te onderzoeken nadat het is getrokken en gecoat onder de optische ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De gecombineerde CPM/CFM is een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van interfaciale dynamica, evenwichten en morfologie. Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor het verkrijgen van gegevens met CPM/CFM.

Figuur 2 toont het celontwerp met kanalen voor het capillair, oplosmiddel en warmte-uitwisseling aangegeven. De inlaat voor oplosmiddeluitwisseling moet zich aan de onderkant van de cel bevinden, terwijl de uitlaat zich aan de bovenkant moet bev...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Alle confocale microscopiebeelden zijn verkregen met behulp van de Nikon A1RHD Multiphoton rechtopstaande confocale microscoop. We erkennen de begeleiding en hulp van het ondersteunend personeel, met name Guillermo Marques, in het University Imaging Center aan de Universiteit van Minnesota. Dit werk werd ondersteund door NIH Grant HL51177. SI werd ondersteund door een Ruth L. Kirschstein NRSA Institutional Research Training Grant F32 HL151128.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 O.D. Tygon tubingFischer ScientificTubing
A1RHD Multiphoton upright confocal microscopeNikonConfocal Microscope
Acid Cleaning SolutionZwavelzuur en Alnochromix verdund met water 50% vol, wacht tot het helder is voordat je verder verdunt
AlnochromixAlconox2510Gemengd met zwavelzuur volgens pakketinstructies en verdund om zure reinigingsoplossing te maken
Ceramic glass cutterSutter Instruments
ChloroformSigma-Aldrich650471HPLC Plus
CurosurfChiesi Longoppervlakteactieve stof
Di Water18.5 MΩ-cm
Ethanolany200 proof gebruikt voor hydrofobiëring, gedenatureerd gebruikt voor reiniging
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminatorDolan-Jenner Industries Inc.281900100Lichtbron; andere lichtbronnen zouden ook moeten werken
Flow EZ F69 mbar w/Link ModuleFluigentLU-FEZ-0069Microfluidische pomp
Fluigent SDK VIsFluigentVereist voor CPM virtuele interface
Fluoroelastomer gasketsGefreesd uit 1 mm dik Viton-blad, zie figuur 3
Gas filterNorgrenF07-100-A3TGGeplaatst tussen microfluïdische pomp en drukregelaar
Gas regulatorNorgren10R0400RVerlaagt de druk van de bron naar het bereik van de pomp, verbonden met gasfilter bereik 2-120 psi
Glass CapilarySutter InstrumentsB150-86-10Boorsilicaatglas O.D. 1,5 mm I.D. 0,86 mm
Glass Slideany75 mm x 25 mm
Glass SyringeHamilton8487825 µL glazen spuit
Hydrophobizing AgentSigma-Aldrich6674201H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilaan 98%, andere hydrofobe triethoxysilaan kan worden vervangen
Insoluble surfactantAvanti850355C-200mg16:0 DPPC in chloroform
LabVIEW SoftwareNational Instruments2017
Longpass FilterThorLabsFEL0650650 nm Longpass filter, golflengte moet excitatie laserfrequentie verwijderen
Lyso-PCAvanti855675P16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-fosfocholine
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/  Easy-Load II pump headMasterflexHV-77916-20Peristaltiekpomp
MATLABMathworksR2019
Micropipette Puller P-1000Sutter InstrumentsCapillairtrekker
Microtensiometer Cell and HolderCel gemaakt uit PEEK, houder gemaakt uit aluminium, zie Figuur 3 en 4
Microtensiometer ObjectiveNikonFluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2,0 mm
NI Vision Development ModuleNational InstrumentsVereist voor CPM virtuele interface
PEEK finger tight fittingsIDEXF-120x10-32 Kegelpoorten
PEEK plugIDEXP-55110-31 Kegelpoorten
pippette tipsEppendorf22492225100 µL - 1000 µL, Autogeklaard
Plastic ForcepsThermo Scientific6320-0010
Plastic SyringeFischer Scientific14-955-45910 mL
Plumbing partsFischer Scientific3-weg kleppen en andere sanitaire onderdelen om slangen aan te sluiten.
Research Plus 1-channel 100 µL–1000 µLEppendorf3123000063Micropipetter
Sulfuric AcidanyGebruikt voor zure reinigingsoplossing
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mmNikonConfocal Microscope Objectief
Texas Red DHPE triethylammonim saltThermo Fischer Scientific1395MPFluorofoor
Vaccum PumpGastDOA-P704-AA

Referenties

  1. Freer, E. M., Yim, K. S., Fuller, G. G., Radke, C. J. Interfacial rheology of globular and flexible proteins at the hexadecane/water interface: Comparison of shear and dilatation deformation. Journal of Physical Chemistry B. 108 (12), 3835-3844 (2004).
  2. Freer, E. M., Yim, K. S., Fuller, G. G., Radke, C. J. Shear and dilatational relaxation mechanisms of globular and flexible proteins at the hexadecane/water interface. Langmuir. 20 (23), 10159-10167 (2004).
  3. Kannan, A., Shieh, I. C., Fuller, G. G. Linking aggregation and interfacial properties in monoclonal antibody-surfactant formulations. Journal of Colloid and Interface Science. 550, 128-138 (2019).
  4. Kannan, A., Shieh, I. C., Leiske, D. L., Fuller, G. G. Monoclonal antibody interfaces: Dilatation mechanics and bubble coalescence. Langmuir. 34 (2), 630-638 (2018).
  5. Li, J. J., et al. Interfacial stress in the development of biologics: Fundamental understanding, current practice, and future perspective. The AAPS Journal. 21 (3), 44(2019).
  6. Bhamla, M. S., Giacomin, C. E., Balemans, C., Fuller, G. G. Influence of interfacial rheology on drainage from curved surfaces. Soft Matter. 10 (36), 6917-6925 (2014).
  7. Fuller, G. G., Vermant, J. Complex fluid-fluid interfaces: Rheology and structure. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 3, 519-543 (2012).
  8. Rosenfeld, L., et al. Structural and rheological properties of meibomian lipid. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (4), 2720-2732 (2013).
  9. Barman, S., Davidson, M. L., Walker, L. M., Anna, S. L., Zasadzinski, J. A. Inflammation product effects on dilatational mechanics can trigger the Laplace instability and acute respiratory distress syndrome. Soft Matter. 16 (29), 6890-6901 (2020).
  10. Barman, S., et al. Recent Advances in Rheology: Theory, Biorheology, Suspension and Interfacial Rheology. Ramachadran, A., et al. , chap. 7 (2022).
  11. Alonso, C., Zasadzinski, J. A. A brief review of the relationship between monolayer viscosity, phase behavior, surface pressure and temperature using a simple monolayer viscometer. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (44), 22185-22191 (2006).
  12. Alonso, C., et al. More than a monolayer: Relating lung surfactant structure and mechanics to composition. Biophysical Journal. 87 (6), 4188-4202 (2004).
  13. Alonso, C., Bringezu, F., Brezesinski, G., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Modifying calf lung surfactant by hexadecanol. Langmuir. 21 (3), 1028-1035 (2005).
  14. Alonso, C., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Keeping lung surfactant where it belongs: Protein regulation of two-dimensional viscosity. Biophysical Journal. 89 (1), 266-273 (2005).
  15. Zasadzinski, J. A., et al. Inhibition of pulmonary surfactant adsorption by serum and the mechanisms of reversal by hydrophilic polymers: Theory. Biophysical Journal. 89 (3), 1621-1629 (2005).
  16. McConnell, H. M. Structures and transitions in lipid monolayers at the air-water-interface. Annual Reviews of Physical Chemistry. 42, 171-195 (1991).
  17. McConnell, H. M., Moy, V. T. Shapes of finite two-dimensional lipid domains. Journal of Physical Chemistry. 92 (15), 4520-4525 (1988).
  18. Zasadzinski, J. A., Stenger, P., Shieh, I., Dhar, P. Overcoming rapid inactivation of lung surfactant: analogies between competitive adsorption and colloid stability. Biochemica et Biophysica Acta. 1798 (4), 801-828 (2010).
  19. Zasadzinski, J. A., et al. Surfactant Progress. Nag, K. , New York. (2008).
  20. Valtierrez-Gaytan, C., et al. Spontaneous evolution of equilibrium morphology in phospholipid-cholesterol monolayers. Science Advances. 8 (14), (2022).
  21. Williams, I., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial rheology and direct imaging reveal domain-templated network formation in phospholipid monolayers penetrated by fibrinogen. Soft Matter. 15 (44), 9076-9084 (2019).
  22. Sachan, A. K., Zasadzinski, J. A. Interfacial curvature effects on the monolayer morphology and dynamics of a clinical lung surfactant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (2), 134-143 (2018).
  23. Alvarez, N. J., Anna, S. L., Saigal, T., Tilton, R. D., Walker, L. M. Intefacial dynamics and rheology of polymer grafter nanoparticles at air-water and xylene-water interfaces. Langmuir. 28 (21), 8052-8063 (2012).
  24. Alvarez, N. J., Vogus, D. R., Walker, L. M., Anna, S. L. Using bulk convection in a microtensiometer to approach kinetic-limited surfactant dynamics at fluid-fluid interfaces. Journal of Colloid and Interface Science. 372 (1), 183-191 (2012).
  25. Alvarez, N. J., Walker, L. M., Anna, S. L. Diffusion-limited adsorption to a spherical geometry: The impact of curvature and competitive time scales. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82, 011604(2010).
  26. Shieh, I., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Visualizing the analogy between competitive adsorption and colloid stability to restore lung surfactant function. Biophysical Journal. 102 (4), 777-786 (2012).
  27. Shieh, I., Zasadzinski, J. A. Visualizing monolayers with a water-soluble fluorophore to quantify adsorption, desorption and the double-layer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (8), 826-835 (2015).
  28. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Takamoto, D. Y., Zasadzinski, J. A., Waring, A. J. Coexistence of buckled and flat monolayers. Physical Review Letters. 81, 1650-1653 (1998).
  29. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. Fluorescence, polarized fluorescence, and Brewster angle microscopy of palmitic acid and lung surfactant protein B monolayers. Biophysical Journal. 72 (6), 2783-2804 (1997).
  30. Alvarez, N. J., Walker, L. M., Anna, S. L. A microtensiometer to probe the effect of radius of curvature on surfactant transport to a spherical interface. Langmuir. 26 (16), 13310-13319 (2010).
  31. Ward, A. F. H., Tordai, L. Time dependents of boundary tensions of solutions. 1. The role of diffusion in time-effects. Journal of Chemical Physics. 14, 453-461 (1946).
  32. Lucassen, J., Vanden Tempel, M. Dynamic measurements of dilatational properties of a liquid interface. Chemical Engineering Science. 27 (6), 1283-1291 (1972).
  33. Lin, G. L., et al. Interfacial dilatational deformation accelerates particle formation in monoclonal antibody solutions. Soft Matter. 12 (14), 3293-3302 (2016).
  34. Bastacky, J., et al. Alveolar lining layer is thin and continuous: low temperature scanning electron microscopy of rat lung. Journal of Applied Physiology. 79 (5), 1615-1628 (1995).
  35. Adamson, A. W., Gast, A. P. Physical Chemistry of Surfaces, Sixth ed. , Wiley-Interscience. New York. 784(1997).
  36. del Rio, O. I., Kwok, D. Y., Wu, R., Alvarez, J. M., Neumann, A. W. Contact angle measurements by axisymmetric drop shape analysis and an automated polynomial fit program. Colloids and Surfaces A Physicochemical and Engineering Aspects. 143 (2-3), 197-210 (1998).
  37. Kanthe, A., et al. No ordinary proteins: Adsorption and molecular orientation of monoclonal antibodies. Science Advances. 7 (5), 14(2021).
  38. Manikantan, H., Squires, T. M. Surfactant dynamics: hidden variables controlling fluid flows. Journal of Fluid Mechanics. 892, 115(2020).
  39. Narayan, S., et al. Dilatational rheology of water-in-diesel fuel interfaces: effect of surfactant concentration and bulk-to-interface exchange. Soft Matter. 17 (18), 4751-4765 (2021).
  40. Meng, G. N., Paulose, J., Nelson, D. R., Manoharan, V. N. Elastic instability of a crystal growing on a curved surface. Science. 343 (6171), 634-637 (2014).
  41. Kotula, A. P., Anna, S. L. Insoluble layer deposition and dilatational rheology at a microscale spherical cap interface. Soft Matter. 12 (33), 7038-7055 (2016).
  42. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Zasadzinski, J. A., Waring, A. J. Phase and morphology changes in lipid monolayers induced by SP-B protein and its amino-terminal peptide. Science. 273 (5279), 1196-1199 (1996).
  43. Pocivavsek, L., et al. Stress and fold localization in thin elastic membranes. Science. 320 (5878), 912-916 (2008).
  44. Pocivavsek, L., et al. Lateral stress relaxation and collapse in lipid monolayers. Soft Matter. 4 (10), 2019-2029 (2008).
  45. Kim, K., Choi, S. Q., Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. Cholesterol nanodomains: their effect on monolayer morphology and dynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 3054-3060 (2013).
  46. Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface. Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).
  47. Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Nonlinear chiral rheology of phospholipid monolayers. Soft Matter. 14 (13), 2476-2483 (2018).
  48. Kotula, A. P., Anna, S. L. Regular perturbation analysis of small amplitude oscillatory dilatation of an interface in a capillary pressure tensiometer. Journal of Rheology. 59, 85-117 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Microtensiometervisualisatieoppervlaktespanningmetingcapillaire druksurfactantadsorptiebeeldvorming van bel interfacesdilatatiemoduluslongsurfactantvloeistof vloeistofinterfaces
Microtensiometer voor confocale microscopie visualisatie van dynamische interfaces
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.