Een bipolaire elektrode gebruiken om een temporale kwab epilepsiemuismodel te maken door elektrische aanmaakhoutjes van de amygdala

Summary

De amygdala speelt een sleutelrol bij temporale kwab epilepsie, die ontstaat in en zich voortplant vanuit deze structuur. Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van de fabricage van diepe hersenelektroden met zowel opname- als stimulerende functies. Het introduceert een model van mediale temporale kwab epilepsie afkomstig van de amygdala.

Abstract

De amygdala is een van de meest voorkomende oorzaken van aanvallen en het amygdala-muismodel is essentieel voor de illustratie van epilepsie. Weinig studies hebben het experimentele protocol echter in detail beschreven. Dit artikel illustreert het hele proces van het maken van amygdala elektrische aanmaakhoutjes epilepsiemodellen, met de introductie van een methode van bipolaire elektrodefabricage. Deze elektrode kan zowel stimuleren als opnemen, waardoor hersenletsel wordt verminderd dat wordt veroorzaakt door het implanteren van afzonderlijke elektroden voor stimulatie en opname. Voor langdurige elektro-encefalogram (EEG) opnamedoeleinden werden slipringen gebruikt om de recordonderbreking veroorzaakt door kabelklitten en vallen te elimineren.

Na periodieke stimulatie (60 Hz, 1 s om de 15 min) van de basolaterale amygdala (AP: 1,67 mm, L: 2,7 mm, V: 4,9 mm) gedurende 19,83 ± 5,742 keer, werd volledige aanmaakhout waargenomen bij zes muizen (gedefinieerd als inductie van drie continue graad V-episodes geclassificeerd door de schaal van Racine). Een intracraniaal EEG werd geregistreerd gedurende het gehele aanmaakhoutproces en een epileptische afscheiding in de amygdala van 20-70 s werd waargenomen na aanmaakhout. Daarom is dit een robuust protocol voor het modelleren van epilepsie afkomstig van de amygdala en is de methode geschikt voor het onthullen van de rol van de amygdala bij temporale kwab epilepsie. Dit onderzoek draagt bij aan toekomstige studies naar de mechanismen van mesiale temporale kwab epilepsie en nieuwe anti-epileptogene geneesmiddelen.

Introduction

Temporale kwab epilepsie (TLE) is de meest voorkomende vorm van epilepsie en heeft een hoog risico op omzetting in geneesmiddelresistente epilepsie. Chirurgie, zoals selectieve amygdalohippocampectomie, is een effectieve behandeling voor TLE en de epileptogenese en ictogenese van de ziekte worden nog onderzocht ^1,2. Pathogenese van TLE blijkt niet alleen in de hippocampus voor te komen, maar ook uitgebreid in de amygdala ^3,4. Bijvoorbeeld, zowel amygdala sclerose en amygdala vergroting zijn vaak gemeld als de oorsprong van TLE aanvallen ^5,6. Het belang van de amygdala is niet te onderschatten; Een amygdala-model is essentieel voor de studie van epileptogenese en een duidelijke illustratie van dit model is dringend nodig.

Er zijn verschillende benaderingen voorgesteld om aanvallen in diermodellen te induceren. In het verleden werden convulsieve geneesmiddelen intraperitoneaal geïnjecteerd in een vroeg stadium⁷. Hoewel deze methode handig was, was de locatie van epileptische foci onzeker. Met de ontwikkeling van stereotactische technologie en een gedetailleerde dierenhersenatlas werd intracraniële medicijninjectie toegepast om het probleem van lokalisatie op te lossen⁸. Een gebrek aan interventie voor ernstige aanvallen tijdens de acute fase resulteerde echter in een hoog sterftecijfer en chronische spontane aanvallen gingen gepaard met het probleem van onstabiele interictale en aanvalsfrequentie ^9,10. Ten slotte werd de elektrische aanmaakhoutmethode ontwikkeld; Deze methode stimuleert periodiek specifieke hersengebieden meerdere keren, waardoor aanvallen kunnen worden geïnduceerd met duidelijke controle over zowel de locatie als de aanvangstijd¹¹.

Een voordeel van deze methode is dat de intracraniale implantatie van elektroden minimaal invasief is¹². Bovendien is de ernst van de aanval beheersbaar door de beëindiging van de stimuli, waardoor de mortaliteit veroorzaakt door de aanvallen wordt verminderd. Deze veranderingen losten de tekortkomingen van de vorige benaderingen op. Met name kan dit model menselijke aanvallen adequaat nabootsen en is het vooral geschikt voor de studie van status epilepticus (SE) vanwege het vermogen om SE snel te induceren¹³. Het kan ook worden gebruikt voor anti-epileptica screening¹⁴ en in studies over het mechanisme van epilepsie. Ten slotte is het bekend dat de amygdala nauw verbonden is met geheugenmodulatie, beloningsverwerking en emotie¹⁵. Stoornissen van deze mentale functies worden vaak aangetroffen bij epileptische patiënten en daarom kan het amygdala-epilepsiemodel een betere keuze zijn voor het bestuderen van emotionele problemen bij epilepsie¹⁶.

Protocol

Dit experiment werd goedgekeurd door de Experimental Animal Ethics Committee van het Xuanwu Hospital, Capital Medical University. Alle muizen werden gehouden in het dierenlaboratorium van het Xuanwu-ziekenhuis, Capital Medical University. Dit protocol is verdeeld in vier delen. De eerste twee delen introduceren de methode voor het bouwen van de elektrode en het elektrische circuit met behulp van een sleepring om de elektroden en de EEG-opname- / stimulatieapparatuur aan te sluiten. Het derde deel beschrijft de operatiemethode van elektrode-implantatie en het vierde deel presenteert de EEG-opname- en stimulatieparameters die worden gebruikt voor het amygdala-epilepsiemodel.

1. Fabricage van elektroden

1. Houd de volgende eerder geprepareerde materialen klaar: twee 3 cm lange stukken teflon-gecoate wolfraamdraad (kale diameter: 76,2 μm), één stuk zilverdraad (kale diameter: 127 μm) van dezelfde lengte en één set van 2 x 2 gauged rijpennen.
2. Gebruik een aansteker om het ene uiteinde van elke wolfraamdraad te branden om 5 mm van de isolatiecoating te verwijderen.
   OPMERKING: De wolfraamdraad met de isolatie verwijderd wordt zwart; Dit deel van de wolfraamdraad wordt het bovenste uiteinde genoemd.
3. Schil een stuk ultrafijne meerstrengsdraad en wikkel het van de onderkant naar het bovenste uiteinde waar het donker begint te worden en doorgaat naar de bovenkant. Combineer deze superfijne draad (heeft een zachte textuur) met de wolfraamdraad door het ene uiteinde te knijpen en het andere uiteinde voorzichtig te draaien, waardoor de twee materialen gemakkelijk met elkaar kunnen worden verstrengeld.
4. Trek er voorzichtig aan om ervoor te zorgen dat ze stevig zijn ingepakt en knip overtollige superfijne draad af. Probeer de wolfraamdraad gedurende het hele proces recht te houden.
5. Bevestig de rijpen aan de klem op de lastafel met de langere zijde van de pennen naar buiten gericht. Gebruik de naald van de spuit om wat soldeerpasta op te pakken en op de pinnen aan te brengen. Verwarm de lastoorts tot 320 °C; Smelt en smeer wat loodvrij tindraad in met de toortspunt.
6. Overlap het bovenste uiteinde van de wolfraamdraad met één naald van de rijpennen en gebruik het soldeer op de toorts om de wolfraamdraad aan de pen te hechten.
   OPMERKING: Het zou erg moeilijk zijn om de wolfraamdraad direct met de pinnen te lassen zonder de hulp van de superfijne draad.
7. Las een andere wolfraamdraad en een andere zilverdraad op dezelfde manier aan de rijpen, zodat elke draad overeenkomt met een naald (zie figuur 1,i).
8. Knip twee krimpkousen iets langer dan het bovenste uiteinde van de wolfraamdraad. Plaats ze op de soldeerverbinding van twee wolfraamdraden en zorg ervoor dat het geleidende deel volledig in de buis is bedekt, zodat het circuit van de twee wolfraamdraden niet in serie wordt geplaatst.
   OPMERKING: Hoewel er drie draden zijn, als twee van hen geïsoleerd zijn, zullen de drie draden niet in serie zijn; Aan het zilverdraad kan ook een buis worden toegevoegd.
9. Verwijder de elektrode van de lastafelklem en houd de elektrode voorzichtig vast met een grote tang, omdat het gemakkelijk is voor elektroden om hun vorm te verliezen bij het verwarmen van de krimpbare buis, met behulp van een goede thermische geleidbaarheidsklem met iets meer kracht.
10. Zet het luchtkanaal aan en verwarm tot een temperatuur van 320 °C is bereikt. Blaas de krimpkous enkele seconden door totdat deze is aangedraaid (zie figuur 1,ii).
11. Als de naalden tijdens het lasproces loskomen van de kunststofbehuizing, splitst u het lasgedeelte en de kunststofbehuizing met een smeltlijm (zie figuur 1,iii). Zorg ervoor dat u het niet op de interface smeert, omdat dit de interface-invoeging zou beïnvloeden.
12. Houd de twee wolfraamdraden vast en draai ze samen, waarbij ze de uiteinden uit elkaar houden (zie figuur 1,iv). Knip de gedraaide wolfraamdraden af tot ongeveer 10 mm lang, zodat de scheiding aan de uiteinden niet groter is dan 0,5 mm.
    OPMERKING: Deze stap kan ook worden uitgevoerd vóór de implantatie van de elektrode om flexibele aanpassing van de elektrodelengte mogelijk te maken.
13. Verwarm het lijmpistool en breng de lijm gelijkmatig rond de elektrode aan.
14. Controleer de elektroden met een multimeter: plaats een staaf van de multimeter aan de niet-gelaste kant van de rijpennen en raak voorzichtig het uiteinde van wolfraamdraad of zilverdraad aan op de andere staaf, controleer of het circuit glad is. Zorg ervoor dat de lijnen niet in serie worden geplaatst.

2. Slipringaansluiting en circuitbeschrijving

OPMERKING: Wanneer de elektroden op de muizen via kabels in een vrij bewegende toestand op een EEG-apparaat worden aangesloten, kunnen de kabels in de knoop raken als de muizen bewegen en ronddraaien. Dit zorgt ervoor dat de kabels korter worden, waardoor de muizen uiteindelijk niet kunnen bewegen of waardoor de kabels van hun kop vallen. In de hier beschreven methode wordt een vierkanaals sleepring geïntroduceerd om te voorkomen dat de kabels eraf vallen. De vier kanalen zijn in figuur 1B in vier kleuren weergegeven.

1. Verwijder 5 mm van de isolatiehuid aan elk uiteinde om de metalen draad binnenin bloot te leggen.
2. Voeg een gedeelte van de krimpkous toe aan elke statordraad.
3. Las elke draad met de stekker van de EEG-apparaatconnector.
4. Verklein de krimpbare buis met hete lucht.
5. Voeg een deel van de krimpkous toe aan elke rotordraad.
6. Schroef de geleidende delen van de rode en oranje draden aan elkaar en last ze aan een verbinding in de kop om op de rijpen te passen.
7. Las de andere twee draden op de kop aan elke verbinding.
   OPMERKING: Het bruine kanaal dat overeenkomt met de zilverdraad is verbonden met het EEG-apparaat voor aarding. De rode en oranje kanalen ontvangen signalen van dezelfde wolfraamdraad en het oranje kanaal dient als referentie voor het EEG-apparaat. De signalen in het rode kanaal zijn betekenisloos, maar ze moeten naast het zwarte kanaal bestaan om een stroomprikkel te vormen. De signalen in het zwarte kanaal zijn de echte elektrische signalen in de hersenen. Verschillende circuits kunnen worden ontworpen met meerkanaals sleepringen voor verschillende apparaten.

3. Operatie voor implantatie

1. Dieren
   1. Gebruik 8 weken oude C57BL / 6 wild-type mannelijke muizen, met een gewicht van 24-26 g, voor operaties.
   2. Plaats ze met een licht-donkercyclus van 12 uur (lichttijd: 8:00-20:00) in een temperatuurgecontroleerde omgeving (22 ± 1 °C) en geef water en voer ad libitum.
   3. Gebruik een extra warmtemat om de dieren warm te houden tijdens de operatie.
   4. Injecteer meloxicam na de operatie subcutaan (10 mg/kg) als eerste toediening van analgetica. Plaats de dieren vervolgens in aparte kooien om het herstel te optimaliseren. Voeg meloxicam toe aan het dieet van het dier gedurende de eerste week na de operatie.
   5. Na het experiment, infundeer de linker ventrikels van de muizen met 4% paraformaldehyde onder anesthesie en verzamel de hersenweefsels voor histologische verificatie van het elektrodedoelwit.
2. Weeg de muis en verdoof deze door intraperitoneale injectie van 1% pentobarbital-oplossing. Steriliseer alle te gebruiken chirurgische instrumenten en verbruiksartikelen, inclusief boren, elektroden, tandheelkundig cement, enz., Door autoclaveren.
3. Wanneer de muis volledig is verdoofd, scheer je het haar van het oog naar het oorgebied met een scheermes.
4. Bevestig de muis op het stereotaxische frame. Plaats de voorste boventanden in de snijtand en steek beide oorbalken even diep in de oren. Breng erytromycine oogzalf aan op de ogen om droogheid en blindheid veroorzaakt door een fel licht tijdens de operatie te voorkomen.
5. Desinfecteer het operatiegebied met drie afwisselende wattenstaafjes jodofor en 75% alcohol in een cirkelvormige beweging. Maak vervolgens een sagittale incisie naar voren vanuit het midden van deze incisie en snijd de huid aan weerszijden van de incisie af om een driehoekig venster te creëren.
6. Rol een klein stukje katoen in een bal en maak het nat met 3% waterstofperoxide. Verwijder het zachte weefsel dat aan de schedel is bevestigd door zachtjes over het blootgestelde gebied te wrijven met een klein watje totdat de voorste en achterste fontanel duidelijk zichtbaar zijn.
7. Stel de voorste en achterste hoogte zo in dat de voorste en achterste fontanel zich in de horizontale positie bevinden. Beschouw de positie van de voorste fontanel als de oorsprong van de assen.
8. Bevestig een roestvrijstalen schroef aan de linker cerebellaire schedel met behulp van een boor om een plat oppervlak te creëren. Zorg ervoor dat de schroef halverwege de schedel uitsteekt.
9. Zorg ervoor dat de coördinaten voor de amygdala aanmaakhout -1,67 mm achteraan, −2,7 mm lateraal en −4,9 mm ventraal van de bregma zijn. Pas het stereotaxische apparaat aan om deze plek te lokaliseren en te markeren.
10. Boor een gat op de gemarkeerde plek met een schedelboor met een diameter van 0,5 mm.
11. Bevestig de elektroden aan de lokalisatiestaaf van het stereotaxische apparaat, plaats de elektrode verticaal boven het gat en laat de positie langzaam zakken tot −4,9 mm. Wikkel de zilverdraad drie keer rond de schroef en zorg ervoor dat u het elektrodelichaam tijdens het gebruik niet schudt.
12. Meng het tandcement en breng het voorzichtig aan op de elektrode en het schedeloppervlak. Wanneer het tandcement uithardt, wijzigt u de buitenkant totdat het cement dat de vaste elektrode omsluit in een kegel verandert.
13. Wanneer het cement is uitgehard, laat u de elektrode los van het stereotaxische apparaat. Dien meloxicam 10mg/kg subcutaan toe om ongemak veroorzaakt door pijn bij dieren te verlichten. Dien meloxicam toe aan dierlijk voedsel voor een analgetisch effect in de eerste week na de operatie. Verwijder de muis en plaats hem terug in de kooi, houd hem gescheiden van de andere muizen.

4. Elektrische aanmaakhoutjes

1. Laat de muizen minstens 1 week rusten na de operatie voordat ze worden aangemaakt om postoperatief herstel mogelijk te maken en de ontsteking te laten verdwijnen.
   OPMERKING: Over het algemeen reageren muizen die niet voldoende zijn hersteld niet goed op aanmaakhout.
2. Plaats de muis in een aangepaste doos met sleepringkabels die de elektrode op het hoofd van de muis en het EEG-apparaat verbinden. Laat de kabel door een gat in het deksel van de doos lopen en pas de lengte van de linker in de doos aan zodat de muis vrij kan bewegen.
3. Schakel het EEG-apparaat in en controleer of het goed werkt. Stel de stimulator in om monofasische blokgolfpulsen van 1 ms te leveren bij 60 Hz gedurende een treinduur van 1 s.
4. Begin met een huidige intensiteit van 50 μA voor de eerste stimulatie; controleer het EEG op na-ontlading, die wordt gekenmerkt door hoogfrequente pieken. Als er geen na-ontlading wordt waargenomen, voeg dan 25 μA toe aan de volgende stimulus en ga door met dit proces om de 10 minuten totdat een na-ontlading wordt waargenomen en 5 s duurt.
   OPMERKING: Als het experiment geen ontlading vereist, kan stap 4.4 worden overgeslagen; 300 μA is sterk genoeg voor aanmaakhout.
5. Stimuleer de muis met de huidige intensiteit bepaald in stap 4.3 elke 15 minuut, niet meer dan 20 keer per dag.
6. Monitor de gedragsreacties op de stimulus.
   OPMERKING: Het optreden van drie opeenvolgende afleveringen van graad V wordt beschouwd als volledige aanmaakhout, gecombineerd met Racine-rangstandaard¹⁷.

Results

De elektrode en het circuit maken het mogelijk om het EEG te registreren en te functioneren als een stimulatie (figuur 1); Deze opstelling vermijdt de complexiteit van het afzonderlijk implanteren, opnemen en stimuleren van elektroden en minimaliseert schade aan het hersenweefsel. De toepassing van sleepringen maakt elektrodeverbinding met alle soorten apparaten mogelijk.

We voerden elektrode-implantatiechirurgie uit op zes gezonde volwassen mannelijke C57BL / 6-m...

Discussion

Epilepsie is een groep ziekten met meerdere manifestaties en diverse oorzaken¹⁸; Opgemerkt moet worden dat geen enkel model kan worden gebruikt voor alle soorten epilepsie en dat onderzoekers een geschikt model moeten selecteren voor hun specifieke studie. De huidige studie introduceert een van de meest toegankelijke methoden voor elektrodefabricage. Verschillende onderdelen van deze methode kunnen worden aangepast aan verschillende experimentele omstandigheden.

Deze me...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488-geconjugeerd Donkey anti-Rabbit IgG	invitrogen	A-21206
c-Fos antilichaam		ab222699
Craniale boor	SANS	SA302
Tandheelkundig cement	NISSIN
EEG-opname- en stimulatieapparatuur	Neuracle Technology (Changzhou) Co., Ltd	NSHHFS-210803
loodvrije tindraad	BAKON
Pin header/Vrouwelijke header	XIANMISI		afstand van 1,27 mm
Zilverdraad	A-M systemen	786000
Slip ring	Senring Electronics Co.,Ltd	SNM008-04
Wolfraamdraad	A-M systemen	796000
Ultrafijne meervoudige standdraad	Shenzhen Chengxing draad en kabel	UL10064-FEP
Lasapparatuur	BAKON	BK881