Methodenartikel

Handdissectie van Caenorhabditis elegans Darmen

5.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64120

⸱

13 september 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Colorado State University

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft een procedure voor het isoleren van darmen van volwassen Caenorhabditis elegans nematodewormen met de hand voor input in genomica, proteomica, microbioom of andere testen.

Samenvatting

De Caenorhabditis elegans darm bestaat uit slechts 20 cellen en is de nexus van vele levensondersteunende functies, waaronder spijsvertering, metabolisme, veroudering, immuniteit en omgevingsrespons. Kritische interacties tussen de C. elegans-gastheer en zijn omgeving komen samen in de darm, waar de darmmicrobiota zich concentreren. Daarom is het vermogen om darmweefsel te isoleren weg van de rest van de worm noodzakelijk om darmspecifieke processen te beoordelen. Dit protocol beschrijft een methode voor het met de hand ontleden van volwassen C. elegans darmen. De procedure kan worden uitgevoerd in fluorescerend gelabelde stammen voor gemak of trainingsdoeleinden. Zodra de techniek is geperfectioneerd, kunnen darmen worden verzameld van niet-gelabelde wormen van elk genotype. Deze microdissectiebenadering maakt het mogelijk om tegelijkertijd darmweefsel en darmmicrobiota van de gastheer te vangen, een voordeel voor veel microbioomstudies. Als zodanig kunnen downstream-toepassingen voor de darmpreparaten die door dit protocol worden gegenereerd, RNA-isolatie van darmcellen en DNA-isolatie van gevangen microbiota omvatten, maar zijn ze niet beperkt tot. Over het algemeen biedt handdissectie van C. elegans-darmen een eenvoudige en robuuste methode om kritieke aspecten van de darmbiologie te onderzoeken.

Inleiding

De Caenorhabditis elegans nematodeworm, met slechts 959 cellen en een levenscyclus van 4 dagen, is een ideaal modelsysteem voor veel genetica, genomica en ontwikkelingsstudies 1,2. Het gemak van voorwaartse en omgekeerde genetische screening, de prevalentie van gemanipuleerde fluorescerende markers, het vermogen om nucleotide-specifieke genoombewerking uit te voeren en de vele gemeenschapsbrede bronnen hebben allemaal bijgedragen aan belangrijke ontdekkingen en inzichten in het C. elegans-systeem. Een belangrijk nadeel is echter de moeilijkheid om zuivere populaties van cellen, weefsels of organen te verkrijgen, die klein, fragiel en onderling verbonden kunnen zijn. Omdat zuivere populaties van cellen belangrijk zijn voor genomics-assays zoals RNA-seq, ChIP-seq en ATAC-seq, zijn er verschillende benaderingen ontstaan om pure preparaten van C. elegans-cellen, weefsels en organen te verkrijgen. Hier wordt een methode beschreven voor het met de hand ontleden van darmen, in grote delen, van volwassen C. elegans-wormen. De resulterende preparaten zijn geschikt voor downstream genomics assays (figuur 1).

De hier beschreven fijnmazige weefseldissectiemethode (figuur 2) is slechts één benadering. Andere alternatieve technieken - zoals moleculaire tagging, het uitsplitsen van wormen en het zuiveren van celtypen van belang met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en post hoc analyse - zijn ook met succes gebruikt om de weefselspecifieke kenmerken van C. elegans moleculaire biologie te onderzoeken. Een voordeel van handdissectie ten opzichte van deze andere benaderingen is echter dat het kan worden gebruikt om tegelijkertijd de kenmerken van de C. elegans-darm en zijn bacteriële inhoudte onderzoeken 3,4,5. Dit maakt 16S rRNA-gensequencing mogelijk en vergemakkelijkt microbioomstudies binnen het C. elegans-systeem. Een belangrijke beperking is echter dat darmcellen niet individueel geïsoleerd worden.

Moleculaire tagging verleent een celtypespecifieke tag alleen aan moleculen binnen het opgegeven weefsel of de cellen van belang. Deze tags kunnen vervolgens worden geïsoleerd uit totale wormpreparaten. Op deze manier hebben weefselspecifieke promotors die een gelabeld polyA-bindend eiwit of gesplitste leider aansturen, weefselspecifieke transcriptoomprofilering 6,7,8,9,10 en 3'UTR mapping11,12 mogelijk gemaakt. Evenzo zijn weefselspecifieke transcriptiefactorprofielen uitgevoerd met behulp van ChIP-seq en DamID, waarbij promotorspecifieke transcriptiefactorvarianten werden toegevoegd met tags of enzymfusies13,14.

FACS maakt het mogelijk om celtypen van belang te isoleren van gedissocieerde wormen op basis van hun intrinsieke cellulaire kenmerken en fluorescerende eigenschappen. Deze benadering heeft weefselspecifieke transcriptomen gegenereerd uit diverse organen 8,15,16 en individuele neuronale celtypen 8,9,15,16,17,18 en is gebruikt om een expressiekaart van het gehele C. elegans zenuwstelsel te maken19,20 . FACS, en zijn neef fluorescentie-geactiveerde kernensortering (FANS), zijn ook gebruikt om celspecifieke chromatineprofielen21,22 te genereren.

Ten slotte kan post-hoc analyse worden uitgevoerd in single-cell resolution assays. Bij deze methode worden alle individuele cellen onderzocht, het celtype van elk wordt toegewezen in de analysefase en de celtypen van belang worden selectief gefilterd voor verder onderzoek. Post-hoc analyse is met succes gebruikt om transcriptomen te verkrijgen van zich ontwikkelende cellen met zowel hoge ruimtelijke als temporele resolutie in C. elegans embryo's 23,24,25,26,27 en L1 28 stadium wormen. Chromatine toegankelijkheid is ook gekarakteriseerd met behulp van ATAC-seq in plaats van RNA-seq met behulp van een vergelijkbare strategie29.

Elke aanpak heeft zijn voor- en nadelen. Voor de C. elegans darm is wormdisaggregatie en FACS-isolatie van darmcellen haalbaar in de embryo- en larvale stadia30, maar is een uitdaging bij volwassenen. Dit wordt verondersteld te wijten te zijn aan de grote, endo-reduplicated en sterk aanhankelijke cellen van de darm waardoor ze moeilijk onbeschadigd te dissociëren zijn. De hier beschreven handdissectiemethode omzeilt deze uitdagingen, waardoor grote delen van de darm van de volwassen worm kunnen worden geïsoleerd. De praktijk van het met de hand ontleden van geslachtsklieren uit ditzelfde stadium is wijdverspreid en eenvoudig. Darmdissectie is vergelijkbaar met gonadedissectie, maar wordt minder vaak uitgevoerd32. Het hier gepresenteerde protocol is gebaseerd op een langer, ongepubliceerd protocol ontwikkeld door Dr. James McGhee en Barb Goszczynski. Dit gestroomlijnde protocol leent technieken voor het isoleren van blastomeren uit embryo's in een vroeg stadium 23,33,34,35. Hoewel handdissectie niet haalbaar is voor het isoleren van de meeste cel- of weefseltypen in C. elegans, is het ideaal voor het isoleren van darmen van volwassen wormen. Daarom is handdissectie een aanvulling op andere middelen voor het verkrijgen van darmspecifieke celpreparaten.

Protocol

Cl2122 wormen werden gebruikt voor de huidige studie. De wormen werden verkregen via het Caenorhabditis Genetics Center (CGC, zie Tabel van Materialen), gefinancierd door het NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

1. Kweken van wormen voor dissectie

  1. Kweek een grote plaat CL2122-wormen in gemengd stadium voor synchronisatie volgens standaard kweekprocedures (d.w.z. NGM-platen bezaaid met E. coli OP50)36,37.
    OPMERKING: Het duurt over het algemeen ~ 96 uur om de maximale legcapaciteit voor eieren te bereiken.
    1. Embryo bereidt de wormen voor binnen de periode van 72-96 uur. Laat de embryo's na het voorbereiden van het embryo gedurende 48 uur uitkomen in M9 (zie tabel 1). Dit levert een synchrone populatie van L1-stadiumwormen op.
      OPMERKING: CL2122-wormen herbergen een geïntegreerde transgene-GFP (groen fluorescerend eiwit) die wordt aangedreven door de darmspecifieke mtl-2 (MeTaLlothionein 2) promotor38. Deze promotor is specifiek voor het cytoplasma van de darmcel en maakt het mogelijk om de darm te visualiseren op een fluorescerende dissectiemicroscoop. Eenmaal getraind, vinden gebruikers fluorescentiebegeleiding mogelijk niet nodig.
  2. Plaat gesynchroniseerde L1-wormen op minimaal twee kleine platen. Kweek wormen op NGM-platen met voldoende voedsel totdat ze het volwassen stadium bereiken (geïdentificeerd door de aanwezigheid van embryo's die in staat zijn om eieren te leggen). Dit duurt tussen de 38-46 uur bij 20 °C.
    1. Zorg ervoor dat dezelfde ontwikkelingsfase wordt geoogst over replica's en over vergelijkende stammen.
      OPMERKING: De tijdsduur om de wormen te laten groeien is afhankelijk van de stam, temperatuur, voedselbron en ontwikkelingsstadium waarop is gericht39. Andere stadia in de buurt van het volwassen stadium kunnen ook worden gebruikt, zoals de L4- en oudere volwassen stadia. Voor het plannen van microbioomexperimenten kunnen verschillende bacteriële voedselbronnen buiten de traditionele voedselbron (E. coli OP50) worden gebruikt om wormen te laten groeien, zoals de CeMbio-stammen4 of een ziekteverwekker van belang40.

2. Bereiding van stamoplossingen en microcapillaire pipetten

OPMERKING: Tabel 1 geeft de details van alle buffers en oplossingen die voor dit onderzoek zijn gebruikt.

  1. Bereid 50 ml eizouten (ook bekend als eibuffer) in een nucleasevrije conische buis (zie materiaaltabel). Eenmaal gemaakt, bewaren op kamertemperatuur.
  2. Bereid 10 ml 100 mM levamisol stockoplossing in een nucleasevrije conische buis. Maak na bereiding 500 μL aliquots en bewaar ze bij −20 °C. Aliquots kunnen worden ontdooid en gedurende 1 week bij 4 °C worden bewaard.
  3. Bereid 1 ml 20 mg/ml stockacetylated bovine serum albumin (BSA) oplossing in een nucleasevrije microcentrifugebuis. Maak na bereiding 50 μL aliquots voor eenmalig gebruik en bewaar ze bij −20 °C.
    OPMERKING: Het is belangrijk om de geacetyleerde versie van BSA te gebruiken omdat dit de enige vorm van BSA is die nucleasevrij is. Niet-geacetyleerd BSA kan een belangrijke bron van nucleasen zijn en dus leiden tot de afbraak van monsters.
  4. Bereid ten minste vijf microcapillaire pipetten van 50 μm en 100 μm elk volgens de onderstaande stappen.
    1. Trek eerst standaard glazen haarvaten (4 in lange en 1,2 mm buitendiameter) in een injectienaaldvorm met behulp van een naaldtrekker (zie Materiaaltabel) en voorwaarden voor "Adherent Cell, C. elegans, & Drosophila" uit het Sutter Instruments Pipette Cookbook41 (Voorwaarden: Heat = Ramp + 5; Trekken = 100; Vel. = 75; Vertraging = 90; Druk = 500; Doos van 2,5 mm x 2,5 mm).
    2. Smeed vervolgens de microcapillaire pipetten tot 50 μm (drie vinkjes zoals aangegeven door de microforge oculaire liniaal onder het M5/0.1-objectief) of 100 μm (vijf vinkjes onder dezelfde omstandigheden) met behulp van een microforge (zie Materiaaltabel). Deze afmetingen vertegenwoordigen de geschatte openingsdiameter van de microcapillaire pipet (figuur 3).
    3. Bevestig vervolgens een mondaspiratorbuis op de microcapillaire pipetten.
      OPMERKING: Aspiratorpipetten worden traditioneel gecontroleerd door pipetteren in de mond, maar veel moderne veiligheidsprotocollen staan deze methode niet toe. Als zodanig kunnen gebruikers de aspiratie regelen met de mondaspiratorbuis door de slang tussen de vinger en duim te knijpen. Bovendien kan een spuitfilter in het mondaspiratorbuissysteem worden geïnstalleerd voor extra veiligheid.

3. Experimentele voorbereiding

  1. Bereid 5 ml dissectiebuffer in een nucleasevrije conische buis. Bewaren bij kamertemperatuur.
  2. Bereid 1 ml werkende geacetyleerde BSA-oplossing in een nucleasevrije microcentrifugebuis. Blijf op ijs.
  3. Maak 350 μL werkende levamisoloplossing in een nucleasevrije microcentrifugebuis. Bereid in drievoud (één buis voor ongeveer 20 wormen). Blijf op ijs.
  4. Bereid chelatiebuffer voor in een nucleasevrije microcentrifugebuis (tabel 1). Maak in repliceren (één buis voor ongeveer 10 ontleedde wormen). Blijf op ijs. Het gebruik van chelatiebuffer tijdens handdissecties verbetert de kwaliteit en kwantiteit van RNA (figuur 4).
  5. Bereid één microcentrifugebuis per experimentele groep die 500 μL nucleïnezuurisolatiereagens of kit-gespecificeerd isolatiereagens bevat (zie Materiaaltabel) in een nucleasevrije buis. Blijf op ijs. Deze buis zal worden gebruikt om de uiteindelijke, geïsoleerde darmen te verzamelen voor opslag of later gebruik.
  6. Bereid een M9-bad en een dissectiebufferbad voor. Verkrijg hiervoor twee steriele petrischalen met een diameter van 35 mm. Voeg vervolgens 2 ml M9 toe aan het ene gerecht en 2 ml dissectiebuffer aan het andere. Voeg ten slotte 100 μL werkende BSA-oplossing toe aan elk bad. Wervel om te mengen. Het toevoegen van BSA aan de baden voorkomt dat de wormen aan het plastic blijven plakken.
  7. Bereid de dissectiearray voor. Verkrijg een 2-well concavity dia (zie Tabel van materialen) en voeg 150 μL werkende levamisol oplossing toe aan de eerste put. Voeg vervolgens 150 μL dissectiebuffer toe aan het tweede putje. Voeg ten slotte 20 μL werkende BSA-oplossing toe aan elke put. Door BSA aan elke put toe te voegen, voorkomt u dat de wormen aan de glijbaan blijven plakken.

4. Handdissectie van de C. elegans darm

  1. Verplaats met behulp van een wormprikker 20 volwassen wormen van de NGM-plaat naar het M9-bad (stap 3.6). Dit zal externe bacteriën van de wormen wassen.
  2. Verplaats vervolgens alle 20 wormen van het M9-bad naar het dissectiebufferbad (stap 3.6). Dit zal externe bacteriën verder wegspoelen en de wormen in de dissectiebuffer in evenwicht brengen.
  3. Verplaats vervolgens partijen wormen (d.w.z. in sets van 10) van het dissectiebufferbad naar de put met levamisoloplossing (stap 3.7).
    OPMERKING: Levamisole zal de wormen tijdelijk verlammen.
    1. Zodra de wormbewegingen vertragen, verplaats je ze snel van de levamisolput naar de put met de dissectiebuffer (stap 3.7). Zorg ervoor dat u de wormen niet te veel verlamt.
      OPMERKING: Het aantal wormen dat in batches naar de levamisoloplossing wordt verplaatst, kan variëren op basis van het comfort van de gebruiker. Dit geldt ook voor het aantal wormen dat in eerste instantie in het M9-bad werd geplukt en vervolgens in het dissectiebufferbad werd verplaatst. Het is een goede gewoonte om extra wormen beschikbaar te hebben voor dissectie, vooral tijdens de training, omdat de gebruiker leert en vertrouwd raakt met het protocol.
  4. Laat de wormen vervolgens een beetje in de dissectiebuffer bewegen voordat ze met dissecties beginnen.
    OPMERKING: Darmen extruderen niet goed van overdreven verlamde wormen (d.w.z. wormen die helemaal niet bewegen).
  5. Wanneer u klaar bent, ontleedt u de wormen onder een fluorescerende ontleedbare scoop met behulp van een hypodermische naald (d.w.z. 27 G x 1/2 inch) (zie Materiaaltabel) door één snede te maken, hetzij net achter de keelholte (figuur 5Aa) of net voor het rectum (figuur 5Ab). Dit zal twee grote delen van de darm produceren, een voorste-middenhelft en een midden-achterste helftI. Zet dit patroon voort voor de rest van de wormen en houd het aantal darmsecties verkregen uit de voorste-midden- en midden-achterste secties gelijkwaardig totdat het gewenste totale aantal darmen is verkregen.
    OPMERKING: Het aanbrengen van de hypodermische naald op een lege spuitloop van 1 ml kan helpen bij de manipulatie ervan tijdens handdissecties. Afhankelijk van het comfort en de ervaring van de gebruiker is het niet ongebruikelijk om een dissectiesnede te maken die geen darmfragment oplevert. Met de praktijk komt dit echter veel minder vaak voor.
  6. Wacht ongeveer 1 minuut tot de darmen maximaal uit het lichaam zijn geëxtrudeerd. Ze nemen meestal een lusvorm aan en kunnen aan een deel van de geslachtsklieren worden vastgeplakt (figuur 5A). Voeg tijdens het wachten 50 μL chelatiebuffer toe aan de put om de afbraak van RNA te helpen verminderen (figuur 4).
  7. Gebruik tijdens het wachten en om de darmextrusie verder te vergemakkelijken de microcapillaire pipet van 100 μm die aan een mondaspirator is bevestigd en trek de darm / worm in en uit de pipet (figuur 5B). Dit zal ook helpen om de darm te bevrijden van de geslachtsklier. Zorg ervoor dat u de darm niet verliest door deze per ongeluk volledig op te zuigen in de microcapillaire pipet.
    OPMERKING: De gebruiker kan afwisselen tussen de microcapillaire pipetten van 100 μm en 50 μm om de darm te bevrijden van de rest van het lichaam en de geslachtsklier. De kleinere diameteropening van de microcapillaire pipet van 50 μm kan een voordeel bieden voor het verwijderen van kleverige stukjes uit de darm. Aspiratorpipetten worden traditioneel gecontroleerd door pipetteren, maar veel moderne veiligheidsprotocollen staan deze methode niet toe. Als zodanig kunnen gebruikers de aspiratie regelen met de mondaspiratorbuis door de slang tussen de vinger en duim te knijpen. Bovendien kan een spuitfilter in het mondaspiratorbuissysteem worden geïnstalleerd voor extra veiligheid.
  8. Zodra een darm voldoende geëxtrudeerd is, gebruikt u de 27 G hypodermische naald om deze weg te snijden van de rest van het lichaam en eventuele resterende geslachtsklier. De grootte van het geïsoleerde darmgedeelte kan sterk variëren, afhankelijk van de ervaring van de oogstmachine, de kwaliteit van de snede en het niveau van verlamming in de worm.
    OPMERKING: De integriteit van de darm en darmfragmenten kan eenvoudig worden gecontroleerd in het hele protocol via hun GFP-fluorescentie.
  9. Gebruik nu de microcapillaire pipet om het darmgedeelte aan te zuigen en verplaats het uit de put en in de microcentrifugebuis met nucleïnezuurisolatiereagens of kit-gespecificeerd isolatiereagens. Houd de geïsoleerde darmen in reagens op ijs en herhaal dit voor de resterende darmen.
    OPMERKING: Meerdere darmen kunnen gedurende de dag worden toegevoegd aan de microcentrifugebuis die nucleïnezuurisolatiereagens of een ander kit-gespecificeerd isolatiereagens bevat. Blijf op ijs. Als niet alle darmen in 1 dag kunnen worden geïsoleerd, kunnen de darmen die al geïsoleerd zijn en opgeslagen in een nucleïnezuurisolatiereagens (dat de nucleïnezuren behoudt) bij −80 °C worden gehouden totdat de isolaties worden hervat en / of kunnen worden voltooid. Hier zijn de monsters stabiel op lange termijn (d.w.z. enkele maanden tot 1 jaar) en kunnen ze blijven totdat ze klaar zijn om nucleïnezuren te isoleren. Darmen kunnen worden geoogst in water of een kitspecifieke lysisbuffer. Er moet echter rekening worden gehouden bij het bepalen hoe lange darmen in een bepaalde buffer op ijs (of een andere gewenste temperatuur) kunnen blijven voordat ze overgaan op stroomafwaartse toepassingen.

5. RNA-isolatie uit ontlede darmen

  1. Homogeniseer de verworven weefsels die zijn opgeslagen in het nucleïnezuurisolatiereagens door drie vries-/dooi-/vortexcycli uit te voeren. Gebruik hiervoor een kralenbad van 37 °C en vloeibare stikstof (of andere vergelijkbare middelen).
  2. Voeg vervolgens 0,2 volumes fenol:chloroform:IAZ-reagens (zie Materiaaltabel) toe aan het monster en vortex kort. Voor een startmonstervolume van 500 μL zouden bijvoorbeeld 0,2 volumes chloroform 100 μL zijn.
  3. Schud de buis met de hand gedurende 20 s en incubeer vervolgens bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
  4. Scheid de monsterfasen door centrifugatie (10.000 x g, 18 min, 4 °C).
  5. Verwijder de waterige fase en breng over in een nieuwe nucleasevrije microcentrifugebuis.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u de interface niet opzweept of verstoort.
  6. Voeg vervolgens een gelijk volume van 100% ethanol toe aan de waterige fase en schud het monster met de hand gedurende 20 s.
  7. Breng 700 μL van het monster over naar de spinkolom (zie Materiaaltabel). Hecht vervolgens RNA aan de kolom met centrifugatie (≥8.000 x g, 30 s, RT [kamertemperatuur]). Gooi de doorstroom weg. Herhaal dit voor eventuele extra resterende monsters.
  8. Voeg 350 μL RW1-buffer (zie materiaaltabel) toe aan de kolom om het monster te wassen. Centrifugeer vervolgens (≥8.000 x g, 30 s, RT) en gooi de doorstroom weg.
  9. Voer dna-vertering op de kolom uit. Voeg 80 μL DNase I toe aan de RDD-buffer (zie Materiaaltabel) aan de monsterkolom. Incubeer vervolgens gedurende 15 minuten bij RT.
  10. Voeg vervolgens 350 μL RW1-buffer toe aan de kolom om het monster te wassen. Centrifugeer (≥8.000 x g, 30 s, RT) en breng de kolom over naar een nieuwe opvangbuis. Gooi de doorstroom en de oude opvangbuis weg. Deze wassing verwijdert de DNase.
  11. Voeg 500 μL RPE (zie Tabel met materialen) toe aan de monsterkolom. Centrifugeer vervolgens (≥8.000 x g, 30 s, RT) en gooi de doorstroom weg. Herhaal dit voor een tweede wasbeurt.
  12. Centrifugeer vervolgens nog eens 1 minuut om het kolommembraan verder te drogen (≥8.000 x g, 1 min, RT). Breng vervolgens de monsterkolom over in een verse nucleasevrije microcentrifuge-verzamelbuis met een deksel. Gooi de doorstroom en de oude opvangbuis weg.
  13. Voeg 14 μL nucleasevrij water rechtstreeks toe aan het membraan van de monsterkolom. Incubeer vervolgens het monster gedurende 2 minuten bij RT. Vervolgens centrifugeer (≥8.000 x g, 1 min, RT) om het RNA te elueren.
  14. Bewaar het monster op ijs. Beoordeel vervolgens de RNA-kwaliteit en -kwantiteit van het monster met behulp van in de handel verkrijgbare testkits (zie de tabel met materialen). Als u klaar bent, bewaart u het monster in een vriezer van −80 °C.
    OPMERKING: RNA is over het algemeen stabiel bij −80 °C gedurende maximaal 1 jaar zonder afbraak.

Resultaten

Het huidige protocol werd gebruikt om grote delen van de darm met de hand te isoleren van volwassen C. elegans (figuur 2). Het uiteindelijke darmmonster voor elke getoonde experimentele groep bestaat uit een gelijke verzameling voorste-midden- en midden-achterste darmsecties. Afhankelijk van de experimentele vraag kan het echter ook een verzameling van alleen voorste, middelste of achterste darmsecties omvatten. Gezamenlijk worden drie representatieve resultaten gepresenteerd voor dit protocol. De eerste toont de succesvolle dissectie en isolatie van darmen (figuur 6). De tweede rapporteert de resultaten van RNA-isolatie uit geïsoleerde darmen (figuur 7). De derde toont de resultaten van microbiële surveillance van geïsoleerde darmen (figuur 8).

Voor het eerste resultaat toont figuur 6A hoe een geëxtrudeerde darm eruit ziet na het maken van een primaire incisie op plaats "a" in figuur 5A bij volwassen CL2122-wormen. Omdat CL2122-wormen de darmspecifieke mtl-2-promotor herbergen die is gefuseerd met GFP (mtl-2p: : GFP), zullen geïsoleerde darmen groen gloeien onder de fluorescerende ontleedingsomvang. De succesvolle dissectie van een darmsegment is vervolgens weergegeven in figuur 6B. Dit darmgedeelte is vrij van zichtbare verontreinigingen zoals puin van de geslachtsklier of het karkas. Figuur 6C toont daarentegen darmen die niet met succes zijn ontleed, omdat geslachte dieren en karkassen nog steeds zichtbaar aan het darmsegment zijn gehecht.

Voor het tweede resultaat werden de darmen geoogst in een nucleïnezuurisolatiereagens en de volgende dag verwerkt met behulp van een total RNA-extractieprotocol met lage input (zie Materiaaltabel). Een laatste darmmonster van 60 totale darmsecties uit de voorste-midden- en midden-achterste secties levert ongeveer 15 ng hoogwaardig totaal RNA op (figuur 7A). Deze hoeveelheid totale darmen kan gemakkelijk in één dag worden verkregen, maar kan indien nodig ook over meerdere dagen worden verdeeld. RNA-opbrengsten uit handdissectie zijn efficiënter dan wormdisaggregatie en FACS-isolatie van darmcellen, omdat honderdduizenden darmcellen nodig zijn om evenredige hoeveelheden totaal RNA te verkrijgen (figuur 7B). Belangrijk is dat de RNA-opbrengsten gegenereerd door handdissectie meer dan voldoende zijn als input voor commerciële RNA-seq-bibliotheekkits (d.w.z. NEBNext Ultra II en NEBNext Single Cell / Low Input), die slechts 2 pg RNA kunnen nemen.

Voor het derde resultaat werden de darmen geoogst tot steriele ddH20 en dezelfde dag verwerkt met behulp van een commerciële microbiële DNA-isolatiekit (zie Materiaaltabel). Een laatste darmmonster van 40 totale darmsecties uit de voorste-midden- en midden-achterste secties levert ongeveer 0,009 pg totaal microbieel DNA op met behulp van een pan-bacteriële detectietest (zie Tabel van materialen) (figuur 8). Deze hoeveelheden zijn te laag voor traditionele kwantificeringsmethoden en moeten worden geëxtrapoleerd uit qPCR-standaardcurven. Idealiter zouden gebruikers zich moeten richten op een uiteindelijke totale hoeveelheid darmen >40, omdat dit de detectiegrens en grens van signaal-ruis met betrekking tot reagensverontreinigingsniveaus verhoogt.

Bij het overwegen van experimenteel ontwerp is het altijd noodzakelijk om geschikte controlemonsters te verzamelen. Voor transcriptomics-experimenten kan een geschikte experimentele controle preparaten van de hele worm omvatten die op dezelfde manier als darmen zijn verzameld. Tijdens de dissectie en isolatie van darmen van C. elegans is het echter gebruikelijk om stukjes karkas en gonade te zien die zich vastklampen aan de darmsecties. Hoewel idealiter deze verontreinigende weefsels uit de darmen worden verwijderd voorafgaand aan opslag voor stroomafwaarts gebruik, kunnen aanvullende experimentele controles de verzameling van de overgebleven wormkarkassen na darmdissectie en / of de verzameling van ontleedde geslachtsklieren omvatten. Voor microbioomexperimenten kunnen controles ook preparaten van de hele worm omvatten die op dezelfde manier als darmen zijn verzameld, naast conventionele positieve (bacteriekweek) en negatieve (water) controles.

figure-results-1
Figuur 1: Handdissectie van darmen van volwassen C. elegans die worden gebruikt om weefselspecifieke preparaten te genereren voor gebruik in een breed scala van downstream omics-testen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Schema voor het handdissectieprotocol. Dit protocol werd gebruikt om grote delen van de darm met de hand te isoleren van volwassen C. elegans . Darmen kunnen worden geïsoleerd voor verschillende stroomafwaartse testen. Hier is het gebruik van darmen voor RNA-isolatie en microbiële DNA-isolatie. Afbeelding gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Fabricage van microcapillaire pipets. (A) Een vers getrokken maar niet-gesmede microcapillaire pipet wordt getoond door het oculaire stuk van een microforge. Een oculaire liniaal wordt gebruikt om microcapillaire pipetten van 50 μm te meten tot een geschatte binnendiameter van drie vinkjes (weergegeven, aangegeven met pijl). (B) Ongesmede, 50 μm en 100 μm microcapillaire pipetten worden onder de ontleedhoek weergegeven naast een kalibratieliniaal met 1 div = 0,1 mm. (C) De microcapillaire pipetten van 50 μm en 100 μm uit (B) worden opnieuw weergegeven, maar vanuit een ander gezichtspunt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Het gebruik van chelatiebuffer (CB) tijdens handdissectie om de RNA-opbrengst te verbeteren. Een totaal RNA-extractieprotocol met lage input genereerde RNA-preparaten uit benoemde weefsels. Representatieve gel-elektroforeseruns die de geïsoleerde totale RNA-kwaliteit (RIN, RNA-integriteitsnummer) en kwantiteit karakteriseren, worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Handdissectiestappen. (A) De in het protocol beschreven dissectiestappen worden hier beschreven. In (1) wordt de darm van de worm gevisualiseerd door GFP-fluorescentie. De primaire incisieplaats kan gelijkmatig over de wormen worden verdeeld om een gelijkmatige dekking over de hele lengte van de darm te garanderen. Als alternatief kunnen "a" of "b" primaire incisieplaatsen worden geselecteerd om een anterieur-midden of midden-posterieur darmfragmentspecifiek preparaat te verkrijgen. In (2) is de darm geëxtrudeerd en heeft een lusvorm aangenomen. In (3) wordt de darm eerst weggesneden van het wormlichaam terwijl het wordt geprobeerd het te bevrijden van het karkas en de geslachtsklier. De darm wordt dan verwijderd uit het resterende karkas of de geslachtsklier die niet kan worden verwijderd. In (4) is een gereinigd deel van de darm geïsoleerd en klaar voor opslag. (B) Een cruciale stap is het losmaken van klevend puin (d.w.z. geslachtsklier, karkas) uit de darm door het in en uit de microcapillaire pipet aan het einde van de mondaspirator te laten lopen. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Representatieve resultaten van handontledingsstappen. Een representatieve afbeelding die (A) de extrusie van de darm van de worm toont. Dit zijn wormen van het CL2122-genotype, die GFP tot expressie brengen onder de darmcelspecifieke mtl-2-promotor . Twee representatieve beelden tonen (B) een gereinigd en volledig geïsoleerd deel van de darm en (C) een geïsoleerde darm met besmettende geslachtsklier- en karkasweefsels. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Representatieve resultaten van totale RNA-extractie uit geïsoleerde darmen. (A) Een representatief beeld van RNA-preparaten opgelost door agarose gel-elektroforese wordt getoond, waarbij de kwaliteit (RINs, RNA-integriteitsaantal) en kwantiteit van geïsoleerde totale RNA's worden gekarakteriseerd. (B) Een representatieve gel van totaal RNA geïsoleerd uit darmcellen geoogst uit L1-stadiumwormen via fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) wordt ter vergelijking getoond. Bij 20 cellen per darm kan worden afgeleid dat de handdissectiemethode meer totaal RNA per darm oplevert dan FACS-gezuiverde darmcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: Representatieve resultaten voor totale microbiële DNA-extractie uit geïsoleerde darmen. Een commerciële microbiële DNA-isolatiekit genereerde DNA-preparaten uit darmen, hele wormen en controles. Een pan-bacteriële gentest werd gebruikt om het aantal bacteriën in de monsters te kwantificeren. Een representatief beeld van (A) de gegenereerde qPCR-amplificatiecurven, (B) de E. coli OP50-standaardcurve die wordt gebruikt om de monsters te kwantificeren, en (C) de monsters worden weergegeven. In (B) worden de log-beginconcentraties van E. coli-normen afgezet tegen hun CT-waarden . In (C) werden twee replica's (reps) van 40 hele wormen mediaal gesneden en 40 geïsoleerde darmsecties werden verwerkt voor microbiële gDNA-isolatie. De No-Template-Control (NTC) van de qPCR-run wordt ook weergegeven. De Y-as vertegenwoordigt de CT-waarden van het monster. De hoeveelheid DNA gekwantificeerd uit PCR's wordt weergegeven als totale picogramwaarden (pg) boven de monsterstaven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Samenstellingen van de buffers en oplossingen die in dit onderzoek zijn gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Dit artikel beschrijft het stapsgewijze protocol voor het met de hand ontleden van darmen van volwassen C. elegans, waarbij zuivere preparaten voor stroomafwaartse testen worden gegenereerd. Kritieke stappen in dit protocol zijn (1) ervoor zorgen dat de wormen niet te veel worden verlamd, (2) nauwkeurige dissectiesneden maken, (3) micropipetetten van de juiste grootte smeden voor dissectie en (4) zorgen voor het snelle herstel van gezonde darmen tijdens de uiteindelijke oogst. Om deze redenen moet voorzichtig worden omgegaan met het blootstellen van wormen aan de levamisoloplossing en moeten de hypodermische naalden regelmatig worden vernieuwd om maximale scherpte te garanderen. Het hanteren van de darm met behulp van de microcapillaire pipet en mondaspirator is een andere stap die oefening zal vergen. Goed gesmede micropipetten van de juiste grootte maken ook een aanzienlijk verschil bij het isoleren van grote delen van de darm tijdens dissecties, naast het verminderen van het risico op het verliezen van darmen in de micropipet. Nieuwe protocolgebruikers verliezen vaak darmen aan de binnenrand van de microcapillaire pipet voordat ze in het isolatiereagens kunnen worden uitgeworpen. Dit probleem kan worden gewijzigd met oefening en goed gesmede microcapillaire pipetten.

Het hierin beschreven protocol is ontworpen voor gebruik bij volwassen wormen. Voorlopige proeven ondersteunen dat dit protocol ook effectief is voor gebruik bij L4-wormen en oudere volwassen wormen. De werkzaamheid van dit protocol is echter nog niet geëvalueerd bij wormen in het vroege larvale stadium. Een beperking van deze aanpak is de kleine hoeveelheid materiaal die het oplevert. Hoewel de hoeveelheden voldoende zijn voor RNA-seq en PCR, zijn ze mogelijk niet geschikt voor andere testen. Als zodanig moeten gebruikers bepalen of de minimaal vereiste input voor een test haalbaar kan worden verzameld met dit protocol.

Ons laboratorium maakt routinematig gebruik van FACS om darmcellen te zuiveren na isolatie30, post-hoc analysemethoden voor darmcelidentificatie en deze handdissectiemethode30,42. Handdissectie heeft het voordeel dat het vatbaar is voor gebruik bij volwassen wormen wanneer wormdisaggregatie en celisolatie minder succesvol zijn. Bovendien zijn de efficiëntie en kwaliteit van totaal RNA geëxtraheerd uit handdissectiepreparaten hoog, waarschijnlijk omdat de weefsels snel uit de wormen worden geplukt en vervolgens snel worden afgezet in een nucleïnezuurisolatiereagens, waardoor de afbraak van RNA wordt verminderd. Een ander voordeel van de handdissectiemethode is dat het goedkoop is, gemakkelijk te leren en geen gespecialiseerde apparatuur vereist. Ten slotte maakt deze aanpak de oogst en isolatie van darmbacteriën uit wormdarmen mogelijk, waardoor downstream microbioomstudies mogelijk worden.

Het hier beschreven handdissectieprotocol voor het isoleren van darmen van volwassen C. elegans vormt een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van verschillende aspecten van de biologie van C. elegans . Met een pure voorbereiding van darmen kunnen onderzoekers bijvoorbeeld de kruising tussen immuniteit, veroudering, metabolisme en het microbioom onderzoeken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

We zijn dank verschuldigd aan het pionierswerk van James McGhee en Barb Goszczynski, die in eerste instantie de darmdissectiemethode ontwikkelden waaruit dit protocol is aangepast. Ons werk wordt ondersteund door een MIRA (R35) Award onder toezicht van het National Institute of General Medical Sciences (National Institutes of Health, R35GM124877 aan EON) en een NSF-CAREER Award onder toezicht van de NSF MCB Div Of Molecular and Cellular Bioscience (Award #2143849 aan EON).

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Acetylated Bovine Serum Albumin (BSA)VWR97061-420Nuclease vrije BSA
CL2122 worm strainCGC (Caenorhabditis Genetics Center)CL2122dvIs15 [(pPD30.38) unc-54(vector) + (pCL26) mtl-2::GFP]. Control strain voor CL2120. Fenotype blijkbaar WT.
Calcium Chloride DihydrateFisherC79Nodig voor het maken van Egg Salts
50 mL Centrifuge Tubes, BulkOlympus Plastics28-108Nuclease vrije conische buis nodig voor het maken van oplossingen.
15 mL Centrifuge Tubes, BulkOlympus Plastics28-103Nuclease vrije conische buis nodig voor het maken van oplossingen.
Concavity slide (2-well)Electron Microscopy Sciences71878-0812-pack van 2-well concavity slides
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N'N'-tetraacetic acid (EGTA)Millipore SigmaE3889Nodig voor het maken van chelation buffer
Fluorescent Dissection MicroscopeLeicaM205 FCADit is een optioneel stukje apparatuur dat kan worden gebruikt met fluorescerende C. elegans stammen om gebruikers te helpen tijdens handdissecties
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N'-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)Millipore SigmaH4034Nodig voor het maken van dissectie buffer
High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579voor beoordeling van de kwaliteit en hoeveelheid totaal RNA
High Sensitivity RNA ScreenTape LadderAgilent5067-5581voor beoordeling van de kwaliteit en hoeveelheid totaal RNA
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample BufferAgilent5067-5580voor beoordeling van de kwaliteit en hoeveelheid totaal RNA
HostZERO Microbial DNA KitZymo ResearchD4310Isolatie van microbieel DNA uit worm darmen/wormen
Hypodermic Needle (27G x 1/2")BD Scientific305109Nodig voor handdissectie van darmen
Levamisole (a.k.a. (-)-Tetramisole hydrochloride)Millipore SigmaL9756Wordt gebruikt om wormen tijdelijk te verlammen voorafgaand aan handdissectie van darmen.
Luer-Lok General Use Disposable Syringe (1 mL)BD Scientific309628Optioneel. Kan worden gebruikt om de hypodermische naald vast te zetten, waardoor de naald tijdens de dissectie gemakkelijker te manipuleren is. Verwijder de plunjer.
Magnesium Chloride HexahydrateFisherM33Nodig voor het maken van Egg Salts
Magnesium Sulfate HeptahydrateSigma-Aldrich230391-500GNodig voor het maken van M9 buffer
MF-900 MicroforgeNarishigeMF-900Wordt gebruikt om de microcapillaire pipetten te smeden. Beschikbaar via Tritech Research.
1.7 mL Microtubes, ClearOlympus Plastics22-282Nuclease vrije microfuge buis nodig voor het maken van oplossingen en monsteropslag.
Mouth Aspirator TubeMillipore SigmaA5177Mondaspiratorbuis is nodig in combinatie met de microcapillaire pijp om het aspireren van gedissekteerde darmen mogelijk te maken.
16S Pan-Bacterial Control TaqMan AssayThermo FisherA50137Assay ID: Ba04930791_s1. Assay gebruikt voor detectie van darmmicroben via qPCR.
P-1000 Micropipette PullerSutter InstrumentsModel P-1000Wordt gebruikt om de microcapillaire pipetten te trekken voorafgaand aan het smeden.
Petri Dish (35 x 10 mm)Genesee Scientific - Olympus Plastics32-103Wordt gebruikt om M9 bad en Dissectie Buffer bad te maken voor het wassen van wormen voorafgaand aan de dissectie.
Phenol:Chloroform:IAAAmbionAM9730Wordt gebruikt bij de isolatie van totaal RNA
Potassium ChlorideMillipore Sigma529552Nodig voor het maken van Egg Salts
Potassium Phosphate MonobasicSigma-AldrichP0662-500GNodig voor het maken van M9 buffer
Qubit 3 FluorometerInvitrogenQ33216Behoort bij de Qubit RNA HS Assay Kit. Kan worden gebruikt om RNA te kwantificeren voorafgaand aan het draaien van monsters op de Agilent ScreenTape.
Qubit RNA HS Assay KitInvitrogenQ32852Kan worden gebruikt om RNA te kwantificeren voorafgaand aan het draaien van monsters op de Agilent ScreenTape.
RNasin Ribonuclease InhibitorPromegaN2111Breed spectrumremming van veelvoorkomende eukaryotische RNAsen
RNase-Free DNase SetQiagen79254Wordt gebruikt voor on-column DNA-digestie tijdens RNA-isolatieprotocol.
RNeasy Micro KitQiagen74004Wordt gebruikt voor isolatie van totaal RNA uit wormdarmen/wormen
Standard Glass CapillariesWorld Precision Instruments1B100F-44 inch OD 1,2 mm standaard borosilicaat glas capillairen gebruikt om microcapillaire pipetten voor dissectie te maken
Sodium ChlorideFisherS271Nodig voor het maken van Egg Salts
Sodium phosphate dibasic heptahydrateFisher ScientificS373-500Nodig voor het maken van M9 buffer
Syringe filter (0.2 micrometer SCFA)Thermo Fisher72302520Optioneel voor gebruik met de mond aspirator buis bij monden pipetten.
4150 TapeStation SystemAgilentG2992AABehoort bij de RNA ScreenTape reagentia voor het beoordelen van RNA kwaliteit en hoeveelheid
TaqPath BactoPure Microbial Detection Master MixApplied BiosystemsA52699Master mix gebruikt voor qPCR
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026Nucle

Referenties

  1. Riddel, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. C. elegans II. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1997).
  2. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  3. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  4. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  5. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485(2017).
  6. Roy, P. J., Stuart, J. M., Lund, J., Kim, S. K. Chromosomal clustering of muscle-expressed genes in Caenorhabditis elegans. Nature. 418 (6901), 975-979 (2002).
  7. Pauli, F., Liu, Y., Kim, Y. A., Chen, P. -J., Kim, S. K. Chromosomal clustering and GATA transcriptional regulation of intestine-expressed genes in C. elegans. Development. 133 (2), 287-295 (2005).
  8. Spencer, W. C., et al. A spatial and temporal map of C. elegans gene expression. Genome Research. 21 (2), 325-341 (2011).
  9. Spencer, W. C., et al. Isolation of specific neurons from C. elegans larvae for gene expression profiling. PLoS One. 9 (11), 112102(2014).
  10. Ma, X., et al. Analysis of C. elegans muscle transcriptome using trans-splicing-based RNA tagging (SRT). Nucleic Acids Research. 44 (21), 156(2016).
  11. Blazie, S. M., et al. Comparative RNA-Seq analysis reveals pervasive tissue-specific alternative polyadenylation in Caenorhabditis elegans intestine and muscles. BMC Biology. 13 (1), 4(2015).
  12. Blazie, S. M., et al. Alternative polyadenylation directs tissue-specific miRNA targeting in Caenorhabditis elegans somatic tissues. Genetics. 206 (2), 757-774 (2017).
  13. Gómez-Saldivar, G., et al. et al.Tissue-specific transcription footprinting using RNA PoI DamID (RAPID) in Caenorhabditis elegans. Genetics. 216 (4), 931-945 (2020).
  14. Katsanos, D., Barkoulas, M. Targeted DamID in C. elegans reveals a direct role for LIN-22 and NHR-25 in antagonizing the epidermal stem cell fate. Science Advances. 8 (5), 3141(2022).
  15. Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529 (7584), 92-96 (2015).
  16. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), 1007559(2018).
  17. Mathies, L. D., et al. mRNA profiling reveals significant transcriptional differences between a multipotent progenitor and its differentiated sister. BMC Genomics. 20 (1), 427(2019).
  18. Liang, X., Calovich-Benne, C., Norris, A. Sensory neuron transcriptomes reveal complex neuron-specific function and regulation of mec-2/ Stomatin splicing. Nucleic Acids Research. 50 (5), 2401-2416 (2021).
  19. Glenwinkel, L., et al. In silico analysis of the transcriptional regulatory logic of neuronal identity specification throughout the C. elegans nervous system. eLife. 10, 64906(2021).
  20. Taylor, S. R., et al. Molecular topography of an entire nervous system. Cell. 184 (16), 4329-4347 (2021).
  21. Charest, J., et al. Combinatorial action of temporally segregated transcription factors. Developmental Cell. 55 (4), 483-499 (2020).
  22. Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genome Research. 22 (4), 766-777 (2012).
  23. Tintori, S. C., Nishimura, E. O., Golden, P., Lieb, J. D., Goldstein, B. A transcriptional lineage of the early C. embryo. Developmental Cell. 38 (4), 430-444 (2016).
  24. Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. CEL-Seq: Single-cell RNA-Seq by multiplexed linear amplification. Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).
  25. Hashimshony, T., Feder, M., Levin, M., Hall, B. K., Yanai, I. Spatiotemporal transcriptomics reveals the evolutionary history of the endoderm germ layer. Nature. 519 (7542), 219-222 (2015).
  26. Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single-cell resolution. Science. 365 (6459), 1971(2019).
  27. Warner, A. D., Gevirtzman, L., Hillier, L. W., Ewing, B., Waterston, R. H. The C. elegans embryonic transcriptome with tissue, time, and alternative splicing resolution. Genome Research. 29 (6), 1036-1045 (2019).
  28. Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  29. Durham, T. J., et al. Comprehensive characterization of tissue-specific chromatin accessibility in L2 Caenorhabditis elegans nematodes. Genome Research. 31 (10), 1952-1969 (2021).
  30. King, D. C., et al. The transcription factor ELT-2 positively and negatively impacts direct target genes to modulate the Caenorhabditis elegans intestinal transcriptome. bioRxiv. , (2021).
  31. Kocsisova, Z., Mohammad, A., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle analysis in the C. elegans germline with the thymidine analog EdU. Journal of Visualized Experiments. (140), e58339(2018).
  32. Han, S., et al. Mono-unsaturated fatty acids link H3K4me3 modifiers to C. elegans lifespan. Nature. 544 (7649), 185-190 (2017).
  33. Edgar, L. G., Wolf, N., Wood, W. B. Early transcription in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 120 (2), 443-451 (1994).
  34. Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and manipulation of embryonic cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
  35. Nishimura, E. O., Zhang, J. C., Werts, A. D., Goldstein, B., Lieb, J. D. Asymmetric transcript discovery by RNA-seq in C. elegans blastomeres identifies neg-1, a gene important for anterior morphogenesis. PLoS Genetics. 11 (4), 1005117(2015).
  36. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  37. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
  38. Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. In vivo aggregation of β-amyloid peptide variants. Journal of Neurochemistry. 71 (4), 1616-1625 (1998).
  39. Altun, Z. F., Hall, D. H. WormAtas Hermaphrodite Handbook – Introduction to C. elegans Anatomy. WormAtlas. , (2006).
  40. Tan, M. -W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 715-720 (1999).
  41. Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018: P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. Sutter Instrument Company. , Novato, CA. https://www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2018).
  42. Dineen, A., Nishimura, E. O., Goszczynski, B., Rothman, J. H., McGhee, J. D. Quantitating transcription factor redundancy: The relative roles of the ELT-2 and ELT-7 GATA factors in the C. elegans endoderm. Developmental Biology. 435 (2), 150-161 (2018).

Herprints en machtigingen

Tags

Darmdissectieisolatie van de darmfluorescente labelingmicrocapillaire pipetRNA-isolatiedarmmicrobiotahypodermische naaldisolatie van nucleïnezuren
Handdissectie van Caenorhabditis elegans Darmen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.