Methodenartikel

Gestandaardiseerde coronaire ringvoorbereiding van ratten en real-time registratie van dynamische spanningsveranderingen langs de diameter van het vat

DOI:

10.3791/64121

⸱

16 juni 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Basic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft de draadmyograaftechniek voor het meten van vasculaire reactiviteit van de kransslagader van de rat.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als een belangrijke gebeurtenis van hart- en vaatziekten, coronaire hartziekte (CAD) is algemeen beschouwd als de belangrijkste boosdoener van atherosclerose, myocardinfarct en angina pectoris, die het leven en de gezondheid van mensen over de hele wereld ernstig bedreigen. Het vastleggen van de dynamische biomechanische kenmerken van geïsoleerde bloedvaten heeft mensen echter lang verbaasd. Ondertussen zijn nauwkeurige positionering en isolatie van kransslagaders om in vitro dynamische vasculaire spanningsveranderingen te meten een trend geworden in de ontwikkeling van CAD-geneesmiddelen. Het huidige protocol beschrijft de macroscopische identificatie en microscopische scheiding van de kransslagaders van ratten. De contractie- en verwijdingsfunctie van de kransslagaderring langs de diameter van het vat werd bewaakt met behulp van het gevestigde multi-myograafsysteem. De gestandaardiseerde en geprogrammeerde protocollen voor coronaire ringspanningsmeting, van bemonstering tot gegevensverzameling, verbeteren de herhaalbaarheid van de experimentele gegevens enorm, wat de authenticiteit van vasculaire spanningsrecords na fysiologische, pathologische en medicamenteuze interventie garandeert.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Coronaire hartziekte (CAD) is algemeen erkend en bezorgd als een typische en representatieve hart- en vaatziekte, de belangrijkste doodsoorzaak in zowel ontwikkelde als ontwikkelingslanden 1,2. Als een bloed- en zuurstoftoevoerroute voor een normale cardiale fysiologische functie, komt circulerend bloed het hart binnen en voedt het het hart via twee hoofdkransslagaders en een bloed vasculair netwerk op het oppervlak van het myocard 3,4. Cholesterol- en vetafzettingen in de kransslagaders snijden de bloedtoevoer van het hart en de gewelddadige ontstekingsreactie van het vasculaire systeem af, waardoor atherosclerose, stabiele angina, onstabiele angina, myocardinfarct of plotselinge hartdood ontstaat 5,6. Als reactie op pathologische stenose van de kransslagaders, compenserende versnelde fysiologische hartslag voldoet aan de bloedtoevoer van het hart zelf of vitale organen van het lichaam door de output van de linker ventrikelte verhogen 7. Als langdurige coronaire stenose niet op tijd wordt verlicht, kunnen zich uitgebreide nieuwe bloedvaten ontwikkelen in bepaalde delen van het hart8. Op dit moment neemt de klinische behandeling van CAD vaak trombolyse of chirurgische mechanische trombolyse en een exogene bionische vasculaire bypass met frequente medicatie en grote chirurgische handicapaan 9. Daarom is het functionele onderzoek van de fysiologische activiteit van de kransslagader nog steeds een dringende doorbraak voor hart- en vaatziekten10.

Er zijn geen beschikbare technische middelen om coronaire fysiologische activiteit te detecteren, behalve draadloze telemetriesystemen, die dynamisch in vivo coronaire druk, vasculaire spanning, bloedzuurstofverzadiging en pH-waarden11 kunnen registreren. Daarom, gezien de textuurgeheim en complexiteit van kransslagaders, zijn nauwkeurige identificatie en isolatie van kransslagaders ongetwijfeld de beste keuzes voor het verkennen van meerdere mechanismen van CAD in vitro4.

Een serie multi-myograafsysteem, in het bijzonder een draadmicrograafmicrovasculaire spanningsdetector (zie Materiaaltabel), is een zeer volwassen verhandelbaar apparaat voor het registreren van in vitro weefselspanningsveranderingen van kleine vasculaire, lymfatische en bronchiale buizen met de kenmerken van hoge precisie en continue dynamische registratie12. Het genoemde systeem is op grote schaal gebruikt om in vitro weefselspanningskarakteristieken van holtestructuren met diameters van 60 μm tot 10 mm vast te leggen. De continue verwarmingskenmerken van het platform van de draadmicrograaf compenseren grotendeels de stimulatie van de ongunstige externe omgeving. Ondertussen stellen de constante input van het gasmengsel en de pH-waarden ons in staat om nauwkeurigere vasculaire spanningsgegevens te verkrijgen in een vergelijkbare fysiologische toestand13. Gezien de complexiteit van anatomische lokalisatie van kransslagaders van ratten (figuur 1), is de isolatie ervan echter verwarrend geweest en beperkt het de verkenning van gediversifieerde hart- en vaatziekten en medicijnontwikkeling door het mechanisme. Daarom introduceert het huidige protocol het anatomische locatie- en scheidingsproces van de kransslagader van de rat in detail, gevolgd door spanningsmeting op het platform van de draadmicrograaf14.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het dierprotocol werd beoordeeld en goedgekeurd door het managementcomité van de Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (record nr. 2021-11). Mannelijke Sprague Dawley (SD) ratten (260-300 g, 8-10 weken oud) werden gebruikt voor de huidige studie. De ratten werden in een dierenkamer gehouden en waren vrij om te drinken en te eten tijdens het experiment.

1. Oplossingsvoorbereiding

  1. Bereid fysiologische zoutoplossing (PSS) door 118 mM NaCl, 4,7 mM K+, 2,5 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgCl2∙6H2O, 25 mM NaHCO3, 11 mM D-glucose en 5 mM HEPES op te lossen (zie Materiaaltabel).
  2. Bereid een hoog K+ zoutoplossing door 58 mM NaCl, 60 mM K+, 2,5 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgCl2∙6H2O, 25 mM NaHCO3, 11 mM D-glucose en 5 mM HEPES op te lossen.
  3. Verzadig de bovenstaande twee oplossingen en bel met een gemengd gas van 95% O2 en 5% CO2. Houd ondertussen de pH-waarden van de oplossing tussen 7,38 en 7,42 met 2 mM NaOH.
    OPMERKING: Voor meer informatie over de bereiding van oplossingen, zie referentie15.

2. Rattenkransslagaderdissectie

  1. Verdoof de rat door inademing van 2% isofluraan. Bevestig diepe anesthesie door teenklem en dien, indien nodig, extra anesthetica toe. Open vervolgens onmiddellijk de thoracale holte om het hart bloot te leggen op de draagbare operatietafel na een eerder gepubliceerd rapport12.
  2. Na het dissociëren en verwijderen van het hart, draineert u het resterende bloed uit alle hartkamers door mild te knijpen met een medische plastic tang. Plaats het voorbewerkte hart snel in een petrischaaltje met 95% O2 + 5% CO2 verzadigd PSS bij 4 °C, met een pH-waarde van 7,40.
  3. Om de anatomische positie van de kransslagaders nauwkeurig te identificeren, past u de houding van het geïsoleerde hart onder de lichtmicroscoop aan volgens het schematische diagram (figuur 2A).
    OPMERKING: Op het vooraanzicht bevonden de rechter oorschelp en de longslagader zich respectievelijk linksboven en rechtsboven.
    1. Knip de linker en rechterventrikelholtes langs het interventriculaire septum uit de wortel van de longslagader met een chirurgische schaar en een pincet (figuur 2B).
  4. Om de linker- en rechterkransslagaders van het myocardiale weefsel te scheiden, ontleedt u de rechterkamer onder een optische anatomische microscoop om de rechter kransslagadertak grondig bloot te leggen. Identificeer vervolgens de positie van de linker kransslagader door het hartweefsel 45° met de klok mee te draaien (figuur 2D).
  5. Na het verwijderen van het omliggende kleverige myocardiale weefsel, onderscheidt u expliciet de pulserende linker (ongeveer 5 mm) en rechter (ongeveer 5 mm) kransslagaders. Scheid de kransslagaders in het midden onmiddellijk en dompel volledig onder in PSS bij 4 °C. Verkrijg een arteriële ring van ongeveer 2 mm door de losgemaakte slagader verticaal door te knippen met een anatomische schaar om de vasculaire spanning onder verschillende stimuli te registreren (figuur 2E).

3. Suspensie en fixatie van de arteriële ring

OPMERKING: Voor meer informatie over deze stap, zie referentie14.

  1. Bereid twee roestvrijstalen draden van 2 cm (zie materiaaltabel) en week voor in 4 °C PSS-oplossing verzadigd met 95% O2 + 5% CO2. Passeer beide draden parallel door de arteriële ring samen met de richting van het vat onder een optische anatomische microscoop en met draden van gelijke lengte blootgesteld aan beide uiteinden van de vasculaire holte.
  2. Bevestig de arteriële ring met de staaldraad voor- en achterkant in het bad van de draadmicrograaf gevuld met borrelende PSS met 95% O2 + 5% CO2. Draai de horizontale schroefknop voor een geschikte afstand voor en achter, zodat de twee draden horizontaal zijn en de arteriële ring zich in een natuurlijke staat van ontspanning bevindt.
  3. Nadat u het DMT-bad op het thermostatische apparaat hebt geïnstalleerd, opent u de software voor gegevensverzameling (zie Materiaaltabel) om ervoor te zorgen dat het bijbehorende padsignaal is opgenomen. Stel de volgende parameters in: oculairkalibratie (mm/div): 0,36; doeldruk (kPa): 13,3; IC1/IC100: 0,9; online gemiddelde tijd: 2 s; vertragingstijd: 60 s. De stappen van arteriële ringfixatie zijn weergegeven in figuur 3.

4. Standaardisatie van vasculaire spanning in de arteriële ring van ratten

OPMERKING: Voor verschillende holtemonsters was optimale initiële spanning nodig voor bloedvaten om uitzonderlijke activiteit in vitro te behouden. Zie voor meer informatie referentie15.

  1. Bereik de optimale initiële spanning van de arteriële ring door een redelijke spanning langs de diameter van het vat aan te brengen.
    OPMERKING: Op basis van de vorige studie16 werd de maximale door agonisten geïnduceerde spanning bereikt bij de factor k-waarde van 0,90 met de initiële rekspanning van 1,16 ± 0,04 mN/mm (referentiewaarden voor verschillende vatmonsters: k-waarde, 0,90-0,95; beginspanning, 1,16-1,52 mN/mm).
  2. Stel op dit punt de weergegeven vasculaire spanningswaarde in op nul. Breng daarna een trekprikkel van 3 mN aan op de arteriële ring door de spiraalas van het bad te draaien.
  3. Stel na incubatie gedurende 1 uur in zuurstofverzadigde PSS-buffer bij 37 °C, pH 7,40, de spanningswaarde opnieuw in op 0 mN op het spanningsbedieningspaneel van de draadmicrograaf. Het uithardingsproces van de initiële spanning van de arteriële ring is weergegeven in figuur 4.

5. Reactiviteit detectie van de kransslagaderring

  1. Voer de contractiele activiteit van de kransslagaderring uit met de draadmyograaftechniek14 en valideer in drie afzonderlijke bewerkingen door te stimuleren met 60 mM K + -oplossing gedurende elk 10 minuten.
  2. Spoel na elke stimulatie het bad met zuurstofverzadigd PSS totdat de vasculaire tonus terugkeert naar de oorspronkelijke toestand.
    OPMERKING: Alleen wanneer de spanningsfluctuatie van de drie parallelle metingen minder dan 10% was en de amplitude van elke contractie groter was dan 1 mN/mm, konden gekwalificeerde en zeer actieve arteriële ringen worden gebruikt voor verdere experimenten. De activiteitsverificatie van de kransring van de rat is weergegeven in figuur 5.

6. Postoperatieve behandeling

  1. Na de operatie euthanaseer de dieren volgens institutioneel goedgekeurde protocollen.
    OPMERKING: Voor de huidige studie werden de dieren geëuthanaseerd door het inademen van overtollig isofluraan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anatomisch gepositioneerd, rat kransslagaders verdeeld en diep verborgen in myocardiaal weefsel waren niet gemakkelijk te herkennen. Door de kransslagaders van mensen (figuur 1A) en ratten (figuur 1B) te vergelijken, werd een snelle en nauwkeurige scheiding van de kransslagaders van ratten uitgevoerd volgens het bemonsteringsproces in figuur 2. Na het nauwkeurig lokaliseren van de rechter oorschelp, longslagader en top van voren ond...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De verstoring van de coronaire microcirculatie, waarbij een breed scala aan patiënten met CAD betrokken is, is geleidelijk erkend en betrof de basis voor adequate myocardumperfusie. Gezien de ernstige complicaties van plotselinge coronaire hartziekten en hart- en vaatziekten, zijn tijdige preventie en behandeling van geneesmiddelen uiterst belangrijk voor een klinisch persoon met CAD17. Onvermijdelijk hebben de geheimhouding van de anatomie van de kransslagader en de complexiteit van de fysiologis...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het Key R&D-project van Sichuan Provincial Science and Technology Plan (2022YFS0438), de National Natural Science Foundation of China (82104533), de China Postdoctoral Science Foundation (2020M683273) en de Afdeling Wetenschap &Technologie van de provincie Sichuan (2021YJ0175).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ApigeninSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China150731
CaCl2Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA501330
D-glucoseSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA610219
HEPESXiya Reagent Co., Ltd., Shandong, ChinaS3872
KClSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100395
KH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100781
LabChart Professional version 8.3 ADInstruments, Australia—
MgCl2·6H2OSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100288
Multi myograph system Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark620M
NaClSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100241
NaHCO3Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100865
Steel wiresDanish Myo Technology, Aarhus, Denmark400447
U46619Sigma, USAD8174

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Malakar, A. K., et al. A review on coronary artery disease, its risk factors, and therapeutics. Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 16812-16823 (2019).
  2. Murray, C., et al. national age-sex specific all-cause and cause-specific mortality for 240 causes of death, 1990-2013: A systematic analysis for the global burden of disease Study 2013. The Lancet. 385 (9963), 117-171 (2015).
  3. Zhang, Y., et al. Adenosine and adenosine receptor-mediated action in coronary microcirculation. Basic Research in Cardiology. 116 (1), 22(2021).
  4. Allaqaband, H., Gutterman, D. D., Kadlec, A. O. Physiological consequences of coronary arteriolar dysfunction and its influence on cardiovascular disease. Physiology. 33 (5), 338-347 (2018).
  5. Minelli, S., Minelli, P., Montinari, M. R. Reflections on atherosclerosis: Lesson from the past and future research directions. Journal of Multidisciplinary Healthcare. 13, 621-633 (2020).
  6. Alvarez-Alvarez, M. M., Zanetti, D., Carreras-Torres, R., Moral, P., Athanasiadis, G. A survey of sub-saharan gene flow into the mediterranean at risk loci for coronary artery disease. European Journal of Human Genetics. 25 (4), 472-476 (2017).
  7. LaCombe, P., Tariq, M. A., Lappin, S. L. Physiology, Afterload Reduction. StatPearls [Internet]. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2022).
  8. Gutterman, D. D., et al. The human microcirculation: regulation of flow and beyond. Circulation Research. 118 (1), 157-172 (2016).
  9. Wang, G., Li, F., Hou, X. Complementary and alternative therapies for stable angina pectoris of coronary heart disease: A protocol for systematic review and network meta-analysis. Medicine. 101 (7), 28850(2022).
  10. Markousis-Mavrogenis, G., et al. Coronary microvascular disease: the "meeting point" of cardiology. European Journal of Clinical Investigation. 52 (5), 13737(2021).
  11. Allison, B. J., et al. Fetal in vivo continuous cardiovascular function during chronic hypoxia. The Journal of Physiology. 594 (5), 1247-1264 (2016).
  12. Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 321 (1), 77-111 (2021).
  13. Liu, L., et al. Comparison of Ca2+ handling for the regulation of vasoconstriction between rat coronary and renal arteries. Journal of Vascular Research. 56 (4), 191-203 (2019).
  14. Sun, J., et al. Isometric contractility measurement of the mouse mesenteric artery using wire myography. Journal of Visualized Experiments. (138), e58064(2018).
  15. Guo, P., et al. Coronary hypercontractility to acidosis owes to the greater activity of TMEM16A/ANO1 in the arterial smooth muscle cells. Biomedicine & Pharmacotherapy. 139, 111615(2021).
  16. Ping, N. N., Cao, L., Xiao, X., Li, S., Cao, Y. X. The determination of optimal initial tension in rat coronary artery using wire myography. Physiological Research. 63 (1), 143-146 (2014).
  17. Niccoli, G., Scalone, G., Lerman, A., Crea, F. Coronary microvascular obstruction in acute myocardial infarction. European Heart Journal. 37 (13), 1024-1033 (2016).
  18. Mumma, B., Flacke, N. Current diagnostic and therapeutic strategies in microvascular angina. Current Emergency and Hospital Medicine Reports. 3 (1), 30-37 (2015).
  19. Lanza, G. A., Parrinello, R., Figliozzi, S. Management of microvascular angina pectoris. American Journal of Cardiovascular Drugs. 14 (1), 31-40 (2014).
  20. Zhu, T. Q., et al. Beneficial effects of intracoronary tirofiban bolus administration following upstream intravenous treatment in patients with ST-elevation myocardial infarction undergoing primary percutaneous coronary intervention: The ICT-AMI study. International Journal of Cardiology. 165 (3), 437-443 (2013).
  21. Huang, D., et al. Restoration of coronary flow in patients with no-reflow after primary coronary intervention of acute myocardial infarction (RECOVER). American Heart Journal. 164 (3), 394-401 (2012).
  22. Fu, W. J., et al. Anti-atherosclerosis and cardio-protective effects of the Angong Niuhuang Pill on a high fat and vitamin D3 induced rodent model of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 195, 118-126 (2017).
  23. Li, J., et al. Chinese medicine She-Xiang-Xin-Tong-Ning, containing moschus, corydalis and ginseng, protects from myocardial ischemia injury via angiogenesis. The American Journal of Chinese Medicine. 48 (1), 107-126 (2020).
  24. Wu, W., et al. Three dimensional reconstruction of coronary artery stents from optical coherence tomography: Experimental validation and clinical feasibility. Scientific Reports. 11 (1), 1-15 (2021).
  25. Liu, M., et al. Janus-like role of fibroblast growth factor 2 in arteriosclerotic coronary artery disease: Atherogenesis and angiogenesis. Atherosclerosis. 229 (1), 10-17 (2013).
  26. Hu, G., Li, X., Zhang, S., Wang, X. Association of rat thoracic aorta dilatation by astragaloside IV with the generation of endothelium-derived hyperpolarizing factors and nitric oxide, and the blockade of Ca2+ channels. Biomedical reports. 5 (1), 27-34 (2016).
  27. Guo, Y., et al. Anticonstriction effect of MCA in rats by danggui buxue decoction. Frontiers in Pharmacology. 12, 749915(2021).
  28. Jing, Y., et al. Apigenin relaxes rat intrarenal arteries, depresses Ca2+-activated Cl− currents and augments voltage-dependent K+ currents of the arterial smooth muscle cells. Biomedicine & Pharmacotherapy. 115, 108926(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Coronaire arteri n van rattenregistratie van vasculaire spanningdraadmyograafmeting van vatdiameterisolatie van arteri le ringenkalium ge nduceerde contractievasodilatie assaymodel voor cardiovasculaire ziekten

Gerelateerde artikelen